Diese Arbeit wurde durch die Zuschüsse aus dem National Natural Science Foundation of China (31201086, 31470759 und 31671219) und Shanghai Natural Science Foundation (12ZR1436900) unterstützt.

C57BL/6 Mäusen werden in bestimmten Pathogen-freies Bedingungen gezüchtet. Alle tierische experimentellen Methoden sind nach den Richtlinien von Animal Care und Ethikkommission medizinischen Universität zweiten Militär genehmigt.
 1. Dissektion der postnatalen Entwicklung Hypophyse <ol><li>Perform-Anästhesie: Neugeborene Mäuse (P0 - P5) auf zerstoßenem Eis induzieren Hypothermie zu platzieren. Injizieren Sie bei Mäusen, die älter als 5 Tage alt 5 % Urethan (30 µL/g Körpergewicht) intraperitoneal, um Anästhesie zu induzieren. Antworten zu Tail/Prisen Toe zu beurteilen. Gehen Sie erst, nachdem die Maus reagiert nicht auf die Schmerzreize ist.</li>
	<li>Sichern die Maus in die Rückenlage (mit Gesicht nach oben auf dem Rücken liegend) durch den Vorderpfoten vorsichtig abkleben und Hinterpfoten auf eine Arbeitsfläche, die in der Lage ist, merken (z.B. Styropor) innerhalb einer chemischen Dampfhaube.</li>
	<li>Transcardial Perfusion führen.
	<ol><li>Schneiden Sie den Maus-Brustkorb mit Chirurgische Scheren, das Herz (und anderen thorakalen Organe) verfügbar zu machen.</li>
		<li>Sichern das schlagende Herz mit stumpfen Pinzette und Nadel 26G (0,45 mm) in den linken Ventrikel. Die Nadel ist beigefügt, um eine 10 mL Spritze mit heparinisierten Phosphat gepufferte Kochsalzlösung gefüllt (PBS; ergänzt mit Natriumnitrit 5 mg/mL und 10 U/mL Heparin, pH 7,4, warm auf 37 ° C vor der Verwendung). Sofort den rechten Vorhof mit einer feinen Schere geschnitten und beginnen, den Körper mit den warmen PBS durchspülen, bis die Flüssigkeit verlassen den rechten Vorhof ist. 
		Hinweis: Ca. 5-10 mL PBS für Neugeborene Mäuse erforderlich ist und 10-20 mL PBS für Erwachsene Mäuse.</li>
		<li>Bewahren Sie die Nadel auf und ändern Sie in eine andere Spritze gefüllt mit 4 % Paraformaldehyd (PFA; pH 7,4). Perfundieren 10 mL und 20 mL Fixiermittel für Neugeborenen und P21 Maus bzw.. 
		Achtung: PFA ist giftig. Es kann Haut und Atemwege Irritationen und Schädigungen des Auges führen. Tragen Sie Handschuhe und arbeiten unter einem chemischen Haube.</li>
	</ol></li> <li>Enthaupten die PFA-behoben: Maus und mit einer Schere aufschneiden der Schädelknochen.
	<ol><li>Heben Sie vorsichtig das Hinterhirn aus der Schädelbasis mit kleinen Zangen. Bei den ersten Anzeichen von der Sella Turcica Stop zu heben, aber halt das Hinterhirn Hypophyse Stiel und Nervenfasern Anschluss an der Unterseite des Gehirns mit einer feinen Schere schneiden. Dieser Schritt ist wichtig, um sicherzustellen, dass die Hypophyse nicht entfernt mit dem Gehirn aufgehoben wird.</li>
		<li>Dann halten das Gehirn anheben und entfernen Sie das gesamte Gehirn um die pituitäre Drüse voll verfügbar zu machen. Schneiden Sie die gesamte Sella-Region einschließlich der Hypophyse (Hirnanhangdrüse), seitliche Trigeminal Nerven, und die unter Sphenoid Knochen mit einer Schere (ca. 3 x 5 mm 2).</li>
	</ol></li> <li>Setzen die sezierte Gewebe in einer 35 mm-Schüssel oder einen Brunnen von einem 6-Well-Platte mit 2 mL kalten 4 % PFA (pH 7,4). Fix das Gewebe bei 4 ° C für 40 min. für P0 - P7 Hypophysen, 1 h für P14 Hypophysen, 1,5 h für P21 - P28 Hypophysen und 3 h für Erwachsene Hypophysen.</li>
	<li>Weitere Dissoziation der Hypophyse <ol><li>waschen das fixierte Gewebe mit 10 mL PBS, 5 Änderungen, 15 min. Die neonatale Hypophyse zusammen mit seinen umliegenden Gewebe und die unter Sphenoid Knochen direkt an Dehydrierung verarbeitet werden können. Jedoch sollte Hypophysen von Mäusen, die älter als 5 Tage getrennt werden weiter unter einem Stereomikroskop.</li>
		<li>Setzen das fixierte Gewebe in einer 35-mm-Schale mit 1 mL PBS. P5 - P14 Hypophysen, entfernen Sie die Bindegewebe Membranen zwischen den Nerven und Knochen mit feinen Zangen und Scheren und isolieren Sie sorgfältig der Hypophyse zusammen mit seitlichen Trigeminal Nerven als Ganzes, sondern verlassen die Sella Turcica. Die isolierten Drüse und Nerven sind durch Bindegewebe Membranen mit verbunden eine &#34; H &#34;-wie aussehen ( Abb. 1 b).</li>
		<li>Für P21 und Erwachsenen Hypophysen, entfernen Sie die Nerven und Bindegewebe Membranen um die Hypophyse und die Drüse aus dem umliegenden Gewebe frei. Die Hypophyse Gewebe mit Linsenreinigung Seidenpapier einwickeln und steckte es in eine Einbettung Kassette. 
		Hinweis: Die winzige Hypophyse mit Linsenreinigung Seidenpapier einwickeln hilft zu verhindern den potenziellen Verlust von Proben und Gewebe Integrität in der folgenden Prozedur Paraffin einbetten. Es möglicherweise nicht notwendig, die Hypophyse umbrochen, wenn sie in einer kleinen Flasche in der Cryo-Einbettung Prozedur verarbeitet wird.</li>
	</ol></li></ol> 2. Paraffin einbetten und Berandungen <ol><li>entwässern die Exemplare in Kassetten mit 50 %, 65 %, 75 % und 95 % Ethanol Lösungen für 15 min einbetten. Anschließend mit 3 Änderungen von reinem Ethanol, 3 min für P0 - P4 Drüsen, 4 min P5 - P14 Drüsen und 5 min für P21 und ältere Drüsen zu entwässern. Klar, mit Xylol ändert 3, 3 min für P0 - P4 Drüsen, 4 min P5 - P14 Drüsen und 5 min für P21 und ältere Drüsen. Mit geschmolzenem Paraffinwachs, 3 Änderungen, 7 min. für P0 - P4 Drüsen infiltrieren und zweimal 8 min gefolgt von 6 min. einmal für P5 und ältere Drüsen. 
	Hinweis: Die optimale Parameter für die Verarbeitung von Gewebe können empirisch angepasst werden. Um qualitativ hochwertige Teile zu erhalten, sind unzureichend oder über Dehydrierung zu vermeiden. Das gleiche gilt für das clearing der Gewebe mit Xylol.</li>
	<li>Orientierung beim Einbetten von <ol><li>auf ein Gewebe einbetten Konsolensystem, entfernen Sie das Exemplar aus der Kassette und legen Sie sie in eine Basis Form halb gefüllt mit geschmolzenem Paraffinwachs. Korrekte Ausrichtung der einbettenden Hypophyse ist unerlässlich für die Befriedigung der koronalen Abschnitte.</li>
		<li>Für P21 und Erwachsenen Hypophyse, positionieren Sie die Hypophyse mit seinen kurzen Achse senkrecht zur Bodenfläche einer base Form (die Schnittebene). Verwenden Sie Sphenoid Knochen und Trigeminal Nerven als anatomische Landmarken für P0 - P4 und P5 - P14 Hypophysen, beziehungsweise. Exemplare mit ihrer Trigeminal Nerven oder transversale Lamina Sphenoid Knochen senkrecht zur Bodenfläche einer base Form orientieren.</li>
		<li>Sanft halten das Gewebe in der gewünschten Position mit erwärmten feinen Pinzette bis das Wachs auf einer Kühlplatte halbfeste wird. Füllen Sie die Form mit flüssigem Paraffin Wachs. Ermöglichen den Paraffinblock abkühlen lassen, bis das Wachs vollständig verfestigt wird. 
		Hinweis: Die Hypophyse an embryonalen Tag 18,5 (E18.5) kann in die gleiche Weise wie die Neugeborenen Hypophyse behandelt werden. Aber die Hypophysen (Rathke &#39; s Beutel) jünger als E16.5 sollte mit den ganzen Kopf eingebettet und, die sagittale Achse (vom Mund zum Hinterhauptbein) senkrecht zur Bodenfläche einer base Form ausgerichtet.</li>
	</ol></li> <li>Chill Paraffinblock bei-20 ° C für 10-20 min und dann schneiden Sie es in dünne Scheiben (4 µm Dicke wird bevorzugt) mit einem Mikrotom. Um zufrieden stellende koronalen Abschnitte zu erhalten, eine Feinabstimmung der Position der Paraffin-Blöcke beim Schneiden. Montieren Sie die Gewebe-Scheiben auf Polylysin-beschichtete Glasplatten, Ablösung der Scheiben in den folgenden Verfahren zu verhindern. 
	Hinweis: Alternativ Proben können werden dehydriert in 15 %, 30 % (W/V) Saccharose-Lösungen (mit PBS-Puffer) bei 4 ° C bis sie auf den Boden sinken, in Cryo-Einbettung Verbindung mit der gleichen Ausrichtung Methode eingebettet, und schnell auf Trockeneis eingefroren. Dann schneiden Sie die gefrorenen Gewebe Blöcke in Scheiben von 8-10 µm mit einem Kryostat. Die Morphologie der Cryo-Abschnitten, ist jedoch oft schlechter als Abschnitte paraffin.</li>
</ol> 3. H &#38; E Färbung und Immunfluoreszenz Beschriftung <ol><li>Warm die Folien bei Hitze blockieren bei 55 ° C und Wachsentfernung mit Xylol, 2 Änderungen, 4 min. Die Proben mit 95 % igem Ethanol zweimal und 75 % Ethanol zweimal, 3 min zu entwässern. Waschen Sie die Folien mit destilliertem Wasser für 5 min auf einen Shaker.</li>
	<li>Für H &#38; E Färbung, die Abschnitte in Alaun Hämatoxylin Lösung für 6 min. Fleck, Spülen in RunnIng Leitungswasser für 2 min, mit 0,2 % Ammoniak Wasser für 45 s und wieder abspülen unter fließendem Wasser für 2 min zu unterscheiden. Dann pausiert die Abschnitte mit 95 % igem Ethanol für 1 min und Fleck mit Eosin für 2 min. nacheinander zu entwässern, klar, und montieren.</li>
	<li><ol><li>Immunfluoreszenz Kennzeichnung behandeln die Abschnitte mit Methanol mit 3 % H 2 O 2 und 0,01 % NaN 3 für 20 min bei Raumtemperatur, endogene Peroxidasen zu inaktivieren. Abrufen von Antigenen durch Kochen Abschnitte im Abruf Puffer (1 mM EDTA und 1 mM Tris-HCl, pH 7,4) in einem Schnellkochtopf für 2 min. inkubieren die Abschnitte mit blockierenden Puffer (5 % Ziegenserum in PBS) für 30 min bei 37 ° c</li>
		<li>Inkubieren Sie Abschnitte mit Kaninchen Anti-Wachstumshormon (GH) Antikörper (1:2, 000) oder Kaninchen Anti-glial fibrillary sauren Protein (GFAP) Antikörper (1:2, 000) verdünnt in blocking-Puffer über Nacht bei 4 ° c</li>
		<li>Abschnitte mit Sekundärantikörper (Ziege Anti-Kaninchen IgG-HRP, 1: 300 in blocking-Puffer) inkubieren 35 min bei 37 ° c</li>
		<li>Verstärken die Signale mit Biotinyl Tyramide (01:50 in Tris gepufferte Kochsalzlösung mit 0,3 % H 2 O 2) für 15 min bei Raumtemperatur und visualisieren mit Streptavidin-Alexa594 oder 488 (1: 300 in blocking-Puffer, 30 min, 37 ° C).</li>
		<li>Die Kernen mit DAPI (50 mg/L mit PBS-Puffer) für 5 min bei Raumtemperatur counterstain. 
		Hinweis: Es kann nicht das Signal mit Tyramide Signal Verstärkung (TSA) System zu verstärken erforderlich. Alternativ kann ein Fluoreszenz-konjugierten Sekundärantikörper verwendet werden, um das Signal zu visualisieren.</li>
	</ol></li> <li>Acquire Bilder mit einem Fluoreszenzmikroskop mit DAPI, Texas Red und FITC Filtersätze × 4/0,13 × 40/0,75 Ziele und 5,0-Megapixel-Kamera ausgestattet. Verwenden Sie die 360, 488 und 594 nm Laser-Wellenlängen für bildgebende DAPI, Alexa 488- und Alexa 594-gefärbten Abschnitte bzw.. Optimieren Sie die Laserleistung (0,8 diente in der Regel) und Belichtungszeit auf das gewünschte Niveau für jeden Kanal. Erfassen Sie das Abbild von Bild-Datenerfassungs-Software gesteuert und überlagern die Fluoreszenzbilder nachträglich über Bildverarbeitungs-Software.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fauquier, T., Lacampagne, A., Travo, P., Bauer, K., Mollard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+face+of+the+anterior+pituitary.">Hidden face of the anterior pituitary.</a> Trends Endocrinol Metab. 13 (7), 304-309 (2002).</li><li>Haedo, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+pituitary+function+by+cytokines.">Regulation of pituitary function by cytokines.</a> Horm Res. 72 (5), 266-274 (2009).</li><li>Zhu, X., Gleiberman, A. S., Rosenfeld, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+physiology+of+pituitary+development:+signaling+and+transcriptional+networks.">Molecular physiology of pituitary development: signaling and transcriptional networks.</a> Physiol Rev. 87 (3), 933-963 (2007).</li><li>Bancalari, R. E., Gregory, L. C., McCabe, M. J., Dattani, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+gland+development:+an+update.">Pituitary gland development: an update.</a> Endocr Dev. 23, 1-15 (2012).</li><li>Kelberman, D., Rizzoti, K., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C., Dattani, M. 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(46), (2010).</li><li>Budry, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Related+pituitary+cell+lineages+develop+into+interdigitated+3D+cell+networks.">Related pituitary cell lineages develop into interdigitated 3D cell networks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12515-12520 (2011).</li><li>Wilson, D. B., Wyatt, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopathology+of+the+pituitary+gland+in+neonatal+little+(lit)+mutant+mice.">Histopathology of the pituitary gland in neonatal little (lit) mutant mice.</a> Histol Histopathol. 7 (3), 451-455 (1992).</li><li>Jonkers, B. W., Sterk, J. C., Wouterlood, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcardial+perfusion+fixation+of+the+CNS+by+means+of+a+compressed-air-driven+device.">Transcardial perfusion fixation of the CNS by means of a compressed-air-driven device.</a> J Neurosci Methods. 12 (2), 141-149 (1984).</li><li>Cao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZBTB20+is+required+for+anterior+pituitary+development+and+lactotrope+specification.">ZBTB20 is required for anterior pituitary development and lactotrope specification.</a> Nat Commun. 7, 11121 (2016).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Für die Entwicklung von murinen Hypophysen, wurde es technisch schwierig, geeignete koronalen Abschnitte aufgrund ihrer winzig und zerbrechlich Funktionen und anatomische Besonderheiten6,8zu erhalten. Einige Forschungsgruppen wählte somit Mitte sagittale Abschnitte, die Morphologie der embryonalen und neonatale Hypophyse11,12zu analysieren. Mitte-sagittale Abschnitt der Hypophyse kann aber auch zeigen v...

Die Hirnanhangdrüse oder Hypophyse ist ein wichtiges endokrine Organ Sekretion von Hormonen, die wichtig für die Homöostase1,2. Anatomisch ist die Hypophyse eine '' Two-in-One'' Struktur bestehend aus der Neurohypophysis und der Adenohypophysis. Diese Teile haben unterschiedliche embryonale Herkunft und Funktion sehr unterschiedlich. Die Neurohypophysis ergibt sich aus der neuralen Ektoderm und sondert Oxytocin und Antidiuretic Hormon. Die Adenohypophysis stammt aus Rathkes-Tasche und ist verantwortlich für die Freisetzung von Hormonen wie Wachstumshormon, Prolaktin, Schilddrüsenhormone – Förderung, Follikel – Förderung Hormon, luteinisierendes Hormon, adrenokortikotropes Hormon, und Melanozyten – Förderung Hormon3,4,5.
Die pituitäre Drüse ruht auf der dorsalen Oberfläche des Sphenoid Knochens (Sella Turcica) des Schädels Maus und wird auf den Boden des Gehirns durch einen fragilen Stiel befestigt. Es ist seitlich umgeben von Trigeminal Nerven und anterior von der Optik Chiasmus6,7. Die Drüse hat eine längliche ovale Form mit seiner Längsachse senkrecht zu der Leiter. Auf der dorsalen Oberfläche können die Neurohypophysis und die Adenohypophysis leicht, mit dem ehemaligen Besatzungsmacht der dorsalen medialen Region und die letzteren, die sich seitlich und ventral abgegrenzt werden. Während der postnatalen Entwicklung steigt die Größe der Hypophyse im ersten Monat nach der Geburt8,9. Dennoch bleibt die Maus Hypophyse sehr klein mit einem durchschnittlichen Gewicht von 1,9 mg und einem langen Achse Durchmesser von ~ 3 mm in Erwachsenen10, einem langen Achse Durchmesser von 2 bis 2,5 mm postnatale Tag 21 (P21) und nur 1-1,5 mm bei P0.
Ein koronaler Abschnitt wird bevorzugt, um Adenohypophysis und Neurohypophysis in eine einzige Scheibe der Hypophyse Maus angezeigt. Allerdings müssen einige technische Fähigkeiten erhalten koronalen Abschnitte der Hypophyse aus Entwicklungsländern Mäuse aufgrund seiner außergewöhnlich geringen Größe und unterschiedliche Anatomie zu befriedigen. In diesem video Artikel zeigen wir, wie zu sezieren Maus Hypophyse Hypophyse koronalen Abschnitte in verschiedenen Entwicklungsphasen.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Tools/Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissors-straight</td><td>JinZhong</td><td>J21010</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Fine scissors-strainght</td><td>JinZhong</td><td>WA1010</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Blunt forceps</td><td>JinZhong</td><td>JD1020</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Fine forceps</td><td>Dumont</td><td>RS-5015</td><td>for isolation of the pituitary</td></tr><tr><td>26G (0.45mm) needle</td><td>HongDa</td><td></td><td>for transcardial perfusion</td></tr><tr><td>Syringe (1 mL)</td><td>BD</td><td>300841</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Syringe (10 mL)</td><td>BD</td><td></td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>35mm dish</td><td>Corning</td><td>430165</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Lens cleaning paper</td><td>ShuangQuan</td><td></td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Anatomical microscope</td><td>OLYMPUS</td><td>SZX-ILLB2-200</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Embedding cassette</td><td>Thermo Fisher</td><td>22-272423</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Tissue embedding console system</td><td>KEDEE</td><td>KD-BM11</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Thermo Fisher</td><td>HM315R</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Superfrost-Plus slides</td><td>Thermo Fisher</td><td>22-037-246</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Cover glass</td><td>Thermo Fisher</td><td>12-543</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>OLYMPUS</td><td>BH2-RFCA</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Urethane</td><td>BBI</td><td>EB0448</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>for PBS</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>for PBS</td></tr><tr><td>Na2HPO4.12H2O</td><td>Sigma</td><td>71650</td><td>for PBS</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>P2222</td><td>for PBS</td></tr><tr><td>NaNO2</td><td>Sigma</td><td>237213</td><td></td></tr><tr><td>Heparin Sodium Injection</td><td>SPH</td><td>H31022051</td><td>for perfusion saline</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>SCR</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>SCR</td><td>10023418</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Thermo Fisher</td><td>8330</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Sigma</td><td>H9627</td><td>for H&amp;amp;E staining</td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Sigma</td><td>E4009</td><td>for H&amp;amp;E staining</td></tr><tr><td>rabbit anti growth hormone (GH)</td><td>National Hormone</td><td></td><td>for immunostaining</td></tr><tr><td>antibody</td><td>Pituitary Program</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-mouse GFAP antibody</td><td>Sigma</td><td>G9269</td><td>for immunostaining</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG, HRP</td><td>Jackson</td><td>111-035-003</td><td>for immunostaining</td></tr><tr><td>TSA system</td><td>NEN Life Science Products</td><td>NEL700</td><td>for immunostaining</td></tr><tr><td>Streptavidin, Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher</td><td>S32356</td><td>for immunostaining</td></tr><tr><td>Anti-FITC Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11090</td><td>for immunostaining</td></tr></tbody></table>

dissection and coronal slice preparation of developing mouse pituitary gland

Die Hirnanhangdrüse oder Hypophyse ist ein wichtiges endokrine Organ Sekretion von Hormonen, die wichtig für die Homöostase. Es besteht aus zwei Drüsen mit getrennten embryonale Herkunft und Funktionen – die Neurohypophysis und die Adenohypophysis. Die entwickelnden Maus pituitäre Drüse ist klein und zart mit eine längliche ovale Form. Ein koronaler Abschnitt wird bevorzugt, um die Adenohypophysis und Neurohypophysis in eine einzige Scheibe der Hypophyse Maus angezeigt.
Das Ziel dieses Protokolls ist es, richtige Hypophyse koronalen Abschnitte mit gut erhaltenen Gewebe Architekturen aus Entwicklungsländern Mäuse zu erreichen. In diesem Protokoll beschrieben detailliert wie man sezieren und Prozess Hypophyse richtig von Mäusen zu entwickeln. Erstens werden Mäuse durch Transcardial Perfusion von Formaldehyd vor der Präparation fixiert. Dann sind drei verschiedene sezierenden Techniken angewendet, um intakte Hypophyse je nach Alter von Mäusen zu erhalten. Für Fetale Mäuse bis 4 Tage embryonalen Tag(e) 17,5-18,5 und Neugeborene bis Jahren, werden die gesamte Sella Regionen einschließlich Sphenoid Knochen, Drüse und Trigeminal Nerven indiziert. Für Welpen sind Alter postnatale Tagen (P) 5-14, der Hypophyse verbunden mit Trigeminal Nerven als Ganzes seziert. Bei Mäusen über 3 Wochen alt sind die Hypophyse sorgfältig frei aus dem umliegenden Gewebe seziert. Gewusst wie: der Hypophyse einbetten in eine korrekte Ausrichtung mithilfe der umgebenden Gewebe als Landmarken zu befriedigen koronalen Abschnitte anzeigen Diese Methoden sind hilfreich bei der Analyse von histologischer und Entwicklungsstörungen Funktionen der Hypophyse bei der Entwicklung von Mäusen.

Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Hypophyse aus Entwicklungsländern Mäuse zu sezieren. Für die Neugeborenen Maus, die gesamte Sella-Regionen mit der Hypophyse, die Trigeminal Nerven und der Unterseite Sphenoid Knochen wurden heraus von der Schädelbasis seziert. Die kleinen und zarten Hypophyse intakt geblieben während des Prozesses (Abbildung 1A). Bei Mäusen, die älter als 5 Tage, der Hypophyse, befestigt an den seitlichen Trigeminal Nerven wurd...

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Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

Dissektion und koronale Slice Vorbereitung Maus Hypophyse zu entwickeln

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll zur Hypophyse zu sezieren und bereiten Hypophyse koronalen Abschnitte von Mäusen zu entwickeln.

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

dissection-coronal-slice-preparation-developing-mouse-pituitary

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

17.2K Aufrufe.  Second Military Medical University. Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll zur Hypophyse zu sezieren und bereiten Hypophyse koronalen Abschnitte von Mäusen zu entwickeln.

Serie: Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed from human fibroblasts using episomal vectors. Colonies of iPSCs can be observed 30 days after initiation of fibroblast reprogramming. Pluripotent colonies are manually picked and grown in neural induction medium to permit differentiation into neural progenitor cells (NPCs). iPSCs rapidly convert into neuroepithelial cells within 1 week and retain the capability to self-renew when maintained at a high culture density. Primary mouse NPCs are differentiated into astrocytes by exposure to a serum-containing medium for 7 days and form a monolayer upon which embryonic day 18 (E18) rat cortical neurons (transfected with channelrhodopsin-2 (ChR2)) are added. Human NPCs tagged with the fluorescent protein, tandem dimer Tomato (tdTomato), are then seeded onto the astrocyte/cortical neuron culture the following day and allowed to differentiate for 28 to 35 days. We demonstrate that this system forms synaptic connections between iPSC-derived neurons and cortical neurons, evident from an increase in the frequency of synaptic currents upon photostimulation of the cortical neurons. This co-culture system provides a novel platform for evaluating the ability of iPSC-derived neurons to create synaptic connections with other neuronal populations.

A protocol to generate a co-culture system consisting of neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), primary cortical neurons and astrocytes is described. This co-culture system allows detection of the formation of synaptic contacts and circuits between new, iPSC-derived neurons and pre-existing cortical neurons expressing channelrhodopsin-2.

Ein optogenetische Ansatz zur Abschätzung Bildung neuronaler Verbindungen in einer Co-Kultursystem

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as well as differentiation and integration of new neurons into existing neural circuits. For postnatal neurogenesis in the olfactory bulbs, these events are segregated within three anatomically distinct domains: proliferation largely occurs in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles, migrating neuroblasts traverse through the rostral migratory stream (RMS), and new neurons differentiate and integrate within the olfactory bulbs (OB). The three domains serve as ideal platforms to study the cellular, molecular, and physiological mechanisms that regulate each of the biological events distinctly. This paper describes an organotypic slice assay optimized for postnatal brain tissue, in which the extracellular conditions closely mimic the in vivo environment for migrating neuroblasts. We show that our assay provides for uniform, oriented, and speedy movement of neuroblasts within the RMS. This assay will be highly suitable for the study of cell autonomous and non-autonomous regulation of neuronal migration by utilizing cross-transplantation approaches from mice on different genetic backgrounds.

This protocol describes an organotypic slice assay optimized for the postnatal brain and high-resolution time-lapse imaging of neuroblast migration in the rostral migratory stream.

Ein organotypischen Assay für High-Resolution Time-Lapse Imaging neuronaler Migration in der postnatalen Gehirn

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

Neurowissenschaften

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that break away from axon terminals when the cortical tissue is homogenized. The SNs retain pre- and postsynaptic characteristics, which makes them useful in the study of synaptic transmission. They retain the molecular machinery used in neuronal signaling and are capable of uptake, storage, and release of neurotransmitters.
The production and isolation of active SNs can be problematic using medias like Ficoll, which can be cytotoxic and require extended centrifugation due to high density, and filtration and centrifugation methods, which can result in low activity due to mechanical damage of the SNs. However, the use of discontinuous Percoll-sucrose density gradients to isolate SNs provides a rapid method to produce good yields of translationally active SNs. The Percoll-sucrose gradient method is quick and gentle as it employs isotonic conditions, has fewer and shorter centrifugation spins and avoids centrifugation steps that pellet SNs and cause mechanical damage.

A method to prepare translationally active, intact synaptoneurosomes (SNs) from mouse brain cortex is described. The method uses a discontinuous Percoll-sucrose density gradient allowing for the quick preparation of active SNs.

Vorbereitung der Synaptoneurosomen von Maus Cortex mit einem diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Dichtegradienten

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

Preparation of Parasagittal Slices for the Investigation of Dorsal-ventral Organization of the Rodent Medial Entorhinal Cortex

Computation in the brain relies on neurons responding appropriately to their synaptic inputs. Neurons differ in their complement and distribution of membrane ion channels that determine how they respond to synaptic inputs. However, the relationship between these cellular properties and neuronal function in behaving animals is not well understood. One approach to this problem is to investigate topographically organized neural circuits in which the position of individual neurons maps onto information they encode or computations they carry out1. Experiments using this approach suggest principles for tuning of synaptic responses underlying information encoding in sensory and cognitive circuits2,3.
The topographical organization of spatial representations along the dorsal-ventral axis of the medial entorhinal cortex (MEC) provides an opportunity to establish relationships between cellular mechanisms and computations important for spatial cognition. Neurons in layer II of the rodent MEC encode location using grid-like firing fields4-6. For neurons found at dorsal positions in the MEC the distance between the individual firing fields that form a grid is on the order of 30 cm, whereas for neurons at progressively more ventral positions this distance increases to greater than 1 m. Several studies have revealed cellular properties of neurons in layer II of the MEC that, like the spacing between grid firing fields, also differ according to their dorsal-ventral position, suggesting that these cellular properties are important for spatial computation2,7-10.
Here we describe procedures for preparation and electrophysiological recording from brain slices that maintain the dorsal-ventral extent of the MEC enabling investigation of the topographical organization of biophysical and anatomical properties of MEC neurons. The dorsal-ventral position of identified neurons relative to anatomical landmarks is difficult to establish accurately with protocols that use horizontal slices of MEC7,8,11,12, as it is difficult to establish reference points for the exact dorsal-ventral location of the slice. The procedures we describe enable accurate and consistent measurement of location of recorded cells along the dorsal-ventral axis of the MEC as well as visualization of molecular gradients2,10. The procedures have been developed for use with adult mice (&gt; 28 days) and have been successfully employed with mice up to 1.5 years old. With adjustments they could be used with younger mice or other rodent species. A standardized system of preparation and measurement will aid systematic investigation of the cellular and microcircuit properties of this area.

We describe procedures for preparation and electrophysiological recording from brain slices that maintain the dorsal-ventral axis of the medial entorhinal cortex (MEC). Because neural encoding of location follows a dorsal-ventral organization within the MEC, these procedures facilitate investigation of cellular mechanisms important for navigation and memory.

Vorbereitung der Parasagittale Slices für die Untersuchung von dorsal-ventrale Organisation des medialen entorhinalen Cortex Nager

Computation in the brain relies on neurons responding appropriately to their synaptic inputs. Neurons differ in their complement and distribution of ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

Live-Imaging der Mitose in der Entwicklung von embryonalen Maus-Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice1, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.

Using multiple angles to cut the mouse pup brain, we improve upon a previously-described acute brain slice which captures the connections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures.

Modifikation eines Colliculo-thalamokortikalen Maus Hirnschnitt, Einbindung der 3D-Druckkammerkomponenten und Multiskalen Optical Imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study ...

A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these tumors are not easily grown in standard culture conditions. Neurosphere cultures under serum-free conditions and orthotopic xenografts have expanded the range of tumors that can be maintained. However, many types of brain tumors remain difficult to propagate or study. This is particularly true for pediatric brain tumors such as pilocytic astrocytomas and medulloblastomas. This protocol describes a system that allows primary human brain tumors to be grown in culture. This quantitative assay can be used to investigate the effect of microenvironment on tumor growth, and to test new drug therapies. This protocol describes a system where fluorescently labeled brain tumor cells are grown on an organotypic brain slice from a juvenile mouse. The response of tumor cells to drug treatments can be studied in this assay, by analyzing changes in the number of cells on the slice over time. In addition, this system can address the nature of the microenvironment that normally fosters growth of brain tumors. This brain tumor organotypic slice co-culture assay provides a propitious system for testing new drugs on human tumor cells within a brain microenvironment.

Many types of human brain tumors are localized to specific regions within the brain and are difficult to grow in culture. This protocol addresses the role of tumor microenvironment and investigates new drug treatments by analyzing fluorescent primary brain tumor cells growing in an organotypic mouse brain slice. &#160;

Ein Hirntumor / Organotypischen Co-Kultursystem für die Untersuchung Tumor-Microenvironment und gezielte Arzneimitteltherapie

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these ...

Medizin

Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal (P1&#8722;3) Mouse Neurogenic Niches

The neurosphere assay is an extremely useful in vitro technique for studying the inherent properties of neural stem/progenitor cells (NSPCs) including proliferation, self-renewal and multipotency. In the postnatal and adult brain, NSPCs are mainly present in two neurogenic niches: the subventricular zone (SVZ) lining the lateral ventricles and the subgranular zone of the hippocampal dentate gyrus (DG). The isolation of the neurogenic niches from postnatal brain allows obtaining a higher amount of NSPCs in culture with a consequent advantage of higher yields. The close contact between cells within each neurosphere creates a microenvironment that may resemble neurogenic niches. Here, we describe, in detail, how to generate SVZ- and DG-derived neurosphere cultures from 1&#8722;3-day-old (P1&#8722;3) mice, as well as passaging, for neurosphere expansion. This is an advantageous approach since the neurosphere assay allows a fast generation of NSPC clones (6&#8722;12 days) and contributes to a significant reduction in the number of animal usage. By plating neurospheres in differentiative conditions, we can obtain a pseudomonolayer of cells composed of NSPCs and differentiated cells of different neural lineages (neurons, astrocytes and oligodendrocytes) allowing the study of the actions of intrinsic or extrinsic factors on NSPC proliferation, differentiation, cell survival and neuritogenesis.

In this article, we describe, in detail, a protocol for the generation of neurosphere cultures from postnatal mouse neural stem cells derived from the main mouse neurogenic niches. Neurospheres are used to identify neural stem cells from brain tissue allowing the estimation of precursor cell numbers. Moreover, these 3D structures can be plated in differentiative conditions, giving rise to neurons, oligodendrocytes and astrocytes, allowing the study of cell fate.

Isolierung und Expansion von Neurosphären aus postnatalen (P1-3) Maus neurogenen Nischen

The neurosphere assay is an extremely useful in vitro technique for studying the inherent properties of neural stem/progenitor cells (NSPCs) including ...

Microdissection of Mouse Brain into Functionally and Anatomically Different Regions

The brain is the command center for the mammalian nervous system and an organ with enormous structural complexity. Protected within the skull, the brain consists of an outer covering of grey matter over the hemispheres known as the cerebral cortex. Underneath this layer reside many other specialized structures that are essential for multiple phenomenon important for existence. Acquiring samples of specific gross brain regions requires quick and precise dissection steps.&#160;It is understood that at the microscopic level, many sub-regions exist and likely cross the arbitrary regional boundaries that we impose for the purpose of this dissection.
Mouse models are routinely used to study human brain functions and diseases. Changes in gene expression patterns may be confined to specific brain areas targeting a particular phenotype depending on the diseased state. Thus, it is of great importance to study regulation of transcription with respect to its well-defined structural organization. A complete understanding of the brain requires studying distinct brain regions, defining connections, and identifying key differences in the activities of each of these brain regions. A more comprehensive understanding of each of these distinct regions may pave the way for new and improved treatments in the field of neuroscience. Herein, we discuss a step-by-step methodology for dissecting the mouse brain into sixteen distinct regions. In this procedure, we have focused on male mouse C57Bl/6J (6-8 week old) brain removal and dissection into multiple regions using neuroanatomical landmarks to identify and sample discrete functionally-relevant and behaviorally-relevant&#160;brain regions. This work will help lay a strong foundation in the field of neuroscience, leading to more focused approaches in the deeper understanding of brain function.

We present a hands-on, step-by-step, rapid protocol for mouse brain removal and dissection of discrete regions from fresh brain tissue. Obtaining brain regions for molecular analysis has become routine in many neuroscience labs. These brain regions are immediately frozen to obtain high quality transcriptomic data for system level analysis.

Mikrodissektion des Mausgehirns in funktionell und anatomisch unterschiedliche Regionen

The brain is the command center for the mammalian nervous system and an organ with enormous structural complexity. Protected within the skull, the brain ...

Preparation of Acute Slices from Dorsal Hippocampus for Whole-Cell Recording and Neuronal Reconstruction in the Dentate Gyrus of Adult Mice

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in molecular, anatomical and functional criteria suggesting a division into different sub-circuits along its rostro-caudal extent. Owing to differential connectivity and function the most fundamental distinction is made between the dorsal and the ventral hippocampus, which are preferentially involved in spatial and emotional processing, respectively. Accordingly, in vivo work regarding spatial memory formation has focused on the dorsal hippocampus.
In contrast, electro-physiological in vitro recordings have been preferentially performed on intermediate-ventral hippocampus, largely motivated by factors like slice viability and circuit integrity. To allow for direct correlation of in vivo data on spatial processing with in vitro data we have adapted previous sectioning methods to obtain highly viable transverse brain slices from the dorsal-intermediate hippocampus for long-term recordings of principal cells and interneurons in the dentate gyrus. As spatial behavior is routinely analyzed in adult mice, we have combined this transversal slicing procedure with the use of protective solutions to enhance viability of brain tissue from mature animals. We use this approach for mice of about 3 months of age. The method offers a good alternative to the coronal preparation which is frequently used for in vitro studies on dorsal hippocampus. We compare these two preparations in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.

We present a protocol to prepare acute-slices from the dorsal-intermediate hippocampus of mice. We compare this transversal preparation with coronal slicing in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.

Vorbereitung von akuten Scheiben aus dem Dorsal Hippocampus für die Ganzzellaufnahme und neuronale Rekonstruktion im Dentate Gyrus von erwachsenen Mäusen