Die Autoren möchten Jacqueline Rosenberg für Korrekturlesen Manuskript anerkennen. Diese Arbeit wurde unterstützt durch das US Department of Health And Human Services/National Institutes of Health mit einem Zuschuss zu YA DeClerck (gewähren 5R01 CA 129377) und der TJ Martell Foundation. MH Kubala ist der Empfänger eines Research Karriere Entwicklung Fellowship Award des Saban Research Institute am Kinder Hospital Los Angeles.

Die Protokoll-Abschnitt, der menschlichen Monozyten gewonnen von gesunden Probanden verwendet folgt den Richtlinien der Kinder Krankenhaus Los Angeles menschliche Forschung Ethik-Kommission und der Institutional Review Board unter das Menschenmaterial genehmigt wurde Protokoll Nummer: CCI 08-00208.
1. Vorbereitung von Krebszelllinien mit Tetracyclin-regulierten ShRNA Ausdruck
<ol><li>Klonen der ShRNA PAI-1 in Tet pLKO Puro Vektor 8 , 9<ol>
<li>ShRNA Oligomere, die Alterenthalten ich und EcoRI Spaltung am 5'-Ende, die Sinn-Sequenz, eine 6 Nukleotid-Schleife und der antisense Reihenfolge Website zu entwerfen. Hinweis: Typische Oligonukleotide sind wie folgt bestimmt: Forward Oligo: 5' CCGG - 19-21 bp spüren - CTCGAG - 19-21 bp Antisense - TTTTT, Reverse Oligo: 5' AATTAAAAA-19-21 bp spüren - CTCGAG - 19-21 bp Antisense 3'. Detailliertes Protokoll für das Oligomer-Design finden Sie im 8. In dieser Studie wurden für den stärksten Stummschaltungs-Effekt 3 ShRNA Sequenzen gegen PAI-1 getestet: ShRNA 132, 2 ShRNA und ShRNA 333Rührei33 sind in Tabelle 1enthalten.</li>
		<li>Tempern Oligomere ShRNA und ShRNA Oligomere kletterte.<ol>
<li>Rekonstituieren Sie Oligonukleotide bis 100 µM im Wasser und mischen Sie 1 µL vorwärts Oligonukleotid, 1 µL Reverse Oligonukleotid und 8 µL H2O.</li>
			<li>Um die Oligonucleotides Tempern, mischen Sie die folgenden: 1 µL Oligonukleotid-Mischung, 5 µL Puffer 10 mM Tris (Hydroxymethyl) Aminomethane (Tris) pH 7.5, 50 mM Natriumchlorid (NaCl), 10 mM Magnesiumchlorid (MgCl2), 1 mM Dithioerythritol (DTE) und 44 µL H 2 O.</li>
			<li>Inkubieren Sie die Mischung in eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Thermocycler bei 95 ° C für 5 min, schalten Sie das Gerät und warten Sie, bis die Raumtemperatur (RT) erreicht ist.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Voreilige geglühten Oligonukleotide durch Zugabe von 5 µL 3 M Natriumacetat pH 5,2 bis 50 µL geglüht Oligonukleotide.<ol>
<li>Fügen Sie 100 µL kalt 100 % Ethanol (EtOH) und inkubieren Sie für 30 min bei-80 ° C. Zentrifuge in einer Benchtop-Zentrifuge mit maximaler Geschwindigkeit für 30 min bei 4 ° C.</li>
			<li>Überstand zu entfernen, fügen Sie 500 µL kaltem 70 % EtOH, Zentrifuge für 30 min, überstand zu entfernen, und lösen sich Pellets in 20 µL H2O.</li>
			<li>Bewerten Sie die Konzentration der geglühten Oligonukleotide durch Spektralphotometrie, Messung der Absorption bei 260 nm. Verdünnen Sie Oligonukleotide die Endkonzentration von 1 ng/µL.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Luria Bertani (LB)-Medium und LB-Agar-Platten vorbereiten.<ol>
<li>Für LB-Medium, Auflösung 10 g Tryptone, 5 g Hefeextrakt, 10 g NaCl in 1 L Wasser. Anpassen der pH-Wert des Mediums auf pH 7,0 mit 1 N NaOH und Autoklaven.</li>
			<li>Fügen Sie für LB-Agar-Platten 15 g/L Agar in LB-Medium. Autoklaven und auf ca. 50 ° c abkühlen Antibiotikum und gießen Sie die Platten.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Streifen von Bakterien mit Tet pLKO Puro Vektor ausgestrahlt (siehe die Tabelle der Materialien) auf LB Agarplatte mit 100 µg/mL Ampicillin ergänzt und inkubieren Sie über Nacht (O/N) bei 37 ° C.</li>
		<li>Impfen Sie 100 mL LB-Medium ergänzt mit 100 µg/mL Ampicillin (LB/Ampicillin) mit 1 Kolonie von der Platte zu und wachsen Sie O/N unter Schütteln bei 37 ° C.</li>
		<li>IsolateTet-pLKO-Puro aus 100 mL Bakterienkultur mit einem Plasmid-Isolierung-Kit.</li>
		<li>Bereiten Sie die Einschränkung Reaktion für die Tet-pLKO-Puro-Vektor mit EcoRI und AgeI Restriktionsenzymen wie folgt: 1 µL EcoRI, 1 µL AgeI, 5 µL 10-fach Puffer 1 µL Plasmid-DNA (1 µg), 42 µL H2O. inkubieren 1 h bei 37 ° C. Um genug gespalten Vektor zu erhalten, bereiten Sie bis zu 5 x 50 µL Reaktionen.</li>
		<li>Verwenden Sie 1 % Agarosegel gespalten Vektor aus dem Agarosegel mit einem DNA-Reinigung-Kit zu reinigen. Um die Ausbeute an DNA zu erhöhen, minimieren Sie die Agarose DNA-Verhältnis im Gel mithilfe einer Agarose-Gel-Kamm für große Brunnen und indem Sie die meisten der Agarose sorgfältig aus der Band mit einem Skalpell.</li>
		<li>Die Ligatur Reaktion Mischung wie folgt vorbereiten: 1 ng geglüht Oligonukleotide, 50 ng gespalten Vektor 2 µL 10-fach Ligase Puffer, 1 µL-Ligase und Wasser bis zu 20 µL. verbinden den Vektor mit geglühtem ShRNA Oligonukleotiden bei 16 ° C O/N.<ol>
<li>Bereiten Sie darüber hinaus eine Negativkontrolle Reaktion ohne Oligonukleotide, uncleaved, teilweise gespalten und selbst aufgespaltenen Vektor erklären, die zu falsch positiven Kolonien führt.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Mit standard Transformation Techniken verwandeln Sie Ligatur Mischungen in chemisch kompetente Bakterienzellen homologe Rekombination der Lentivirale Vektoren mit direkten Wiederholungen zu verhindern.</li>
		<li>Wachsen Sie Bakterien auf Tellern mit Ampicillin O/N bei 37 ° C. Hinweis: Wenn Wachstum der Sat-Kolonien auftritt, wiederholen Sie die Transformation und wachsen Sie Bakterien bei 30 ° C zu verlangsamen das Wachstum und damit verhindern, dass Sat-Kolonien.</li>
		<li>Um erfolgreiche Unterbindung zu überprüfen, wählen Sie zwischen 10-20 einzelne Kolonien, aufpfropfend 2 mL LB/Ampicillin-Kulturen und eine Ampicillin-Platte als Lager Platte (später als positive Klon verwendet werden). Wachsen Sie flüssige Kulturen mit zitternden O/N bei 37 ° C. Inkubieren Sie die Platte O/N bei 37 ° c</li>
		<li>Die Dichtplatte mit Parafilm und Store bei 6 ° C.</li>
		<li>Plasmid-DNA aus flüssigen Kulturen mit einem Plasmid-Isolierung-Kit zu isolieren.</li>
		<li>Führen Sie Restriktionsanalyse Plasmid-DNA isoliert von Ampicillin-resistente Kolonien mit XhoI Enzym. Für jeden Klon bereiten die folgende Reaktion Mischung: 0,5 µL XhoI, 2,5 µL 10-fach Puffer 1 µL Plasmid-DNA (0,5 µg), und 21 µL H2O. Inkubation für 1 h bei 37 ° C. Analysieren Sie das Ergebnis der Einschränkung Reaktion, indem man die Reaktion auf eine 1 % Agarosegel. Hinweis: Restriktionsanalyse gespalten durch XhoI WT-Vektors generiert 3 Fragmente: 8.447, 1.800 und 200 bp. Stuffer-Sequenz in Tet pLKO Puro Vector 1800 bp ist nicht in positive Klone mit ShRNA-PAI-1 und der XhoI Digest führt zu DNA-Fragmente der Größe: 8.447, 190 und 130 bp. Wie in Abbildung 1dargestellt, die 2.000 bp Fragment findet sich nicht in DNA isoliert von Ampicillin resistente Kolonien Anzahl: 3, 8 und 11. Je nach Bauart der Oligonukleotide variieren die Länge und Anzahl der erhaltenen Fragmente von DNA aus positiven Kolonien.</li>
		<li>Überprüfen Sie die korrekte einsetzen der ShRNA Sequenzen in der Tet-pLKO-Puro-Vektor durch Sequenzierung8,9.</li>
		<li>Impfen Sie 100 mL LB/Ampicillin-Kultur mit der Kolonie mit der richtigen Klon zu und wachsen Sie O/N bei 37 ° C.</li>
		<li>Plasmid-DNA mit einem Plasmid-Isolierung-Kit zu isolieren.</li>
	</ol></li>
	<li>Teilchenerzeugung Lentivirus.
	<ol>
<li>Beschichten die 15 cm Gewebe Kulturschale mit Poly-L-Lysin durch Abdecken der Oberfläche der Schale mit sterilem Wasserlösung von 0,01 % Poly-L-Lysin und Inkubation bei RT für 15 min. die Lösung durch Absaugen entfernen und trocknen das Geschirr.</li>
		<li>Samen 5 x 106 menschliche embryonale Nieren-293-Zellen (HEK293) Zellen in der Poly-L-Lysin-beschichtet 15 cm Schüssel und Kultur in Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) Medium ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin Mischung (Pen/Strep) bei 37 ° C, 5 % CO 2 bis 70 % Konfluenz erreicht.</li>
		<li>Um Viruspartikel produzieren, transfizieren Sie HEK293 Zellen mit 25 µg pLKO-Tet-auf-ShRNA, 25 µg PsPAX, (Verpackung Plasmid), und 5 µg pMD2.G Plasmide (Umschlag mit dem Ausdruck ihrer Plasmid) mit Transfection Reagens. Hinweis: PsPAX und pMD2.G Plasmide sind ein Geschenk aus dem Didier Trono Labor (Ecole Polytechnique Federale de Lausanne, Schweiz).</li>
		<li>Induzieren Sie HEK293 Zellen am nächsten Tag durch den Wechsel des Mediums zu DMEM mit 10 mM Natrium Butyrat und 20 mM HEPES pH 7,2 und Kultivierung für 8 h ergänzt.</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und 25 mL frische DMEM mittlere mit 20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-Piperazineethanesulfonic Säure (HEPES) pH 7,2. Nach der Inkubation bei 37 ° C für 48 h sammeln Sie sorgfältig Virus-haltigen Medium durch pipettieren; Vermeidung von Leckagen.</li>
		<li>Filtern Sie die gesammelten Mittel durch einen 0,45 µM Spritze Filter, HEK293 Zellen zu entfernen. Die Viruspartikel-haltigem Medium kann sofort verwendet oder bei-80 ° C für die spätere Verwendung gespeichert werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Generation von stabil transfizierten Zelllinien
	<ol>
<li>Samen HCT116 Darmkrebszellen und MDA-MB-231 Brustkrebs-Zellen Zellen/Brunnen in DMEM Medium ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % auf 50.000 Pen/Strep in einem 12-Well-Platte. Inkubation bei 37 ° C um 5 % CO2 bis Zellen 60-70 % Zusammenfluss sind.</li>
		<li>Zellen mit PBS waschen und 1 mL Virus-haltigen Medium zu Krebs Zellen und inkubieren Sie O/N bei 37 ° C um 5 % CO2. Als ein Steuerelement hinzufügen 1 mL frisches DMEM Medium ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Pen/Strep, 2 Brunnen mit Krebszellen.</li>
		<li>Entfernen Sie vorsichtig die Virus-haltigen Medium durch Absaugen. Die Zellen mit PBS waschen und ändern Sie das Medium in DMEM mit 10 % (V/V) Tetracyclin-freie FBS (Tet-frei) und 1 % Pen/Strep.</li>
		<li>Nach 72 h, Zellen mit PBS waschen und ändern Sie das Medium in DMEM 10 % Tet-freie FBS 1 % Pen/Strep, 1 µg/mL Puromycin für Auswahl von Virus-transfizierten Zellen.<ol>
<li>Abhängig von der Zell-Linie verwendet einstellen Sie Puromycin Konzentration für die optimale Auswahl durch Tests Puromycin Konzentrationen (0.1, 0.5, 1, 2 und 5 µg/mL) in den Zellen nicht ausgestrahlt und wählen Sie die niedrigste Konzentration, wo keine Kontrollzellen überleben, nach 3 Tagen der Kultur.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Wählen Sie Virus ausgestrahlt Zellen durch die Kultivierung von Zellen in Anwesenheit von Puromycin für 3-14 Tage. Bereiten Sie als Steuerelemente zwei weitere Brunnen mit nicht ausgestrahlt Zellen, eine mit Puromycin und ohne Puromycin-haltigem Medium. Beobachten Sie teilweise Tötung der Zellen von Puromycin im Brunnen mit Virus ausgestrahlt Zellen im Vergleich zu Kontroll-Vertiefungen. Hinweis: Nicht ausgestrahlt Zellen wachsen nicht in Gegenwart von Puromycin.</li>
		<li>Überprüfen Sie die Effizienz der bedingten KD in der Puromycin-resistenten HCT116 Darmkrebs und MDA-MB-231 Brustkrebszellen. Hinweis: Die wirksame Konzentration von Doxycyclin variiert mit der Zell-Linie verwendet und muss (in der Regel von 100 ng/mL, 2 µg/mL) titriert werden.<ol>
<li>Bestimmen Sie die Doxycyclin-Konzentration, die nicht giftig für die Zellen aber wirksam bei der Downregulating die Expression des Proteins von Interesse ist. In diesem Protokoll wurde 1 µg/mL erfolgreich eingesetzt in Vitro.</li>
			<li>Kulturzellen Sie für 72 Stunden in an- und Abwesenheit von 0,1, 1 und 2 µg/mL Doxycyclin. Überprüfen Sie die Höhe der Expression des Proteins herunterreguliert (hier, PAI-1) in der Zelle lysate durch Western blot Analyse. Vergleichen Sie HCT116 und MDA-MB-231 Zellen bedingt ShRNA, Rührei Kontrollzellen zum Ausdruck zu bringen.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Vorbereitung des konditionierten Mediums
	<ol>
<li>Samen 1 x 106 mit Doxycyclin stabil transfizierten Zellen reguliert pLKO ShRNA enthaltenden Lentiviren in 10 cm-Gerichten.</li>
		<li>Zell-Linien in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Medium mit 10 % Tet-freie FBS und 1 % wachsen Pen/Strep in Abwesenheit und Anwesenheit von 1 µg/mL Doxycyclin für 72 h bei 37 ° C um 5 % CO2, täglich frische Doxycyclin hinzufügen. Hinweis: RPMI Medium ist kompatibel mit Kulturbedingungen der Monozyten. Doxycyclin ist eine leichte sensible Verbindung. Die Zellkulturen durch abdecken mit Alufolie vor Licht schützen und arbeiten unter direkten Lichteinfall zu vermeiden.</li>
		<li>Sammeln Sie das Medium durch pipettieren, durch 0,45 µm-Filter filtern Sie und bei-80 ° C in Aliquote einfrieren.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Isolierung von Monozyten aus menschlichem Blut
<ol><li>Monozyten aus dem menschlichen peripheren Blut zu isolieren. Hinweis: Menschliche primäre Monozyten sind isoliert von 7 mL weißer Blutkörperchen konzentriert in einem Leukozyten Filter gesunde Thrombozyten-Spender entnommen. Abhängig von der Geber produziert einen Leukozyten Filter zwischen 1 x 109 und 2 x 109 peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs), ungefähr 10 % von denen Monozyten bilden.<ol>
<li>Bereiten Sie die Arbeitsstation im Kabinett Laminar-Flow.</li>
		<li>Sterilisieren Sie Schere und die laminare Strömung Schrank mit ultraviolettem Licht (UV) für 30 Minuten.</li>
		<li>Sprühen Sie die Leukozyten-Filter mit 70 % EtOH und an der Luft trocknen innen die laminare Strömung Kabinett.</li>
		<li>Geschnitten Sie beide Enden der Leukozyten-Filter mit einer Schere und entleeren Sie den Inhalt des Filters in einer 50 mL-Tube.</li>
		<li>Verdünnen Sie bis 90 mL durch Zugabe von PBS mit 1 % (V/V) FBS (PBS/FBS).</li>
		<li>3 x 50 mL Röhrchen mit 15 mL-Dichte-Gradienten-Lösung vorzubereiten. Schichten Sie langsam 30 mL PBS/FBS verdünnt Blut über die Dichte Gradienten Lösung mit einer Pipette-Controller auf Schwerkraft fließen gesetzt, um zu vermeiden, Mischen der Schichten.</li>
		<li>In einer Schaukel Rotor bei 400 X g bei RT ohne Bremsen für 25 min zentrifugieren.</li>
		<li>Entsorgen Sie die oberste Schicht zu und übertragen Sie die mittlere Schicht mit PBMCs zu einem frischen 50 mL-Tube.</li>
		<li>Fügen Sie PBS/FBS bis zu 50 mL und Zentrifuge bei 120 X g bei RT für 10 min. Überstands mit Thrombozyten entfernen. Wiederholen Sie diesen Schritt zwei weitere Male.</li>
		<li>Aufschwemmen Sie das Pellet in 50 mL PBS/FBS und zählen Sie die PBMCs mit einem Hemocytometer. Zentrifugieren bei 120 X g bei RT und das Pellet in PBS/FBS mit 1 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) (PBS/FBS/EDTA), eine Endkonzentration von 5 x 107 Zellen/mL aufzuwirbeln.</li>
		<li>Verwenden Sie eine negative Auslese Kit, um Monozyten durch Erschöpfung der nicht-monozytären Zellen zu bereichern. Hinweis: Das negative Auslese-Kit verwendet einen Cocktail von Antikörpern (CD2, CD3, CD16, CD19, CD20, CD56, CD66b, CD123 und Glycophorin A) T Zellen, NK Zellen Neutrophile, B Zellen, Granulozyten und Erythrozyten. Die Antikörper-Komplexe binden an die Oberfläche dieser nicht monozytären Zellen und Dextran Magnetpartikel. Wenn das Rohr in einem Magneten platziert wird, die Perlen halten an den Wänden des Schlauches und der nicht-monozytären Zellen aus der Projektmappe entfernen.<ol>
<li>1 mL 5 x 107 PBMCs/mL 50 µL der Antikörper cocktail hinzufügen, mischen mit einer Pipette und inkubieren Sie für 10 min bei RT. hinzufügen 50 µL magnetische Beads, die PBMCs mit dem Antikörper cocktail mit einer Pipette mischen und weitere 10 min bei RT inkubieren</li>
			<li>Addieren Sie PBS/FBS/EDTA, 25 mL und Ort die PBMC-Mischung in einem Magneten, der eine 50 mL-Tube aufnehmen können. Inkubieren Sie für 10 min bei RT magnetischen Perlen werden halten an den Wänden des Schlauches und sequester nicht monozytären Zellen aus der Lösung.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Mit einem 25-mL-Pipette, die Lösung mit Monozyten aus der Tube in den Magneten entfernen. Achten Sie auf die Seiten des Rohres mit der Pipette nicht berühren.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Lösung bei 250 X g bei RT und Entfernen des Überstands Aufschwemmen der Pellet mit Monozyten in RPMI Medium mit 10 % Tet-freie FBS und 1 % Pen/Strep.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) Boyden Kammer Migration Assay
<ol><li>Bereiten Sie 1 % (w/V) Rinderserumalbumin (BSA) Lösung durch Auflösen von BSA 1 g in 100 mL Reinstwasser und Filtern durch eine 0,2 µm Porengröße zu sterilisieren.</li>
	<li>Inkubieren Sie die poröse Membran-Einsätze in 1 % sterile BSA Lösung O/N für die verbesserte Einhaltung von Makrophagen die Membran. Verwenden Sie für Monozyten/Makrophagen 5-8 µm Pore Größe Einsätze.<ol>
<li>Füllen Sie eine steriles Gewebe Kulturschale mit 1 % BSA Lösung und setzen Sie die Einsätze in der Schale. Gelten Sie 200 µL 1 % BSA Lösung innerhalb der Einsätze.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Waschen Sie die Einsätze zweimal, indem man sie in eine Schüssel gefüllt mit sterilen PBS und Anwendung PBS im Inneren des Filters.</li>
	<li>Seed 40.000 HCT116 oder MDA-MB-231 Zellen in 0,5 mL RPMI Medium mit 10 % Tet-freie FBS und 1 % Pen/Strep pro Bohrloch in einer 24-Well-Platte, in dreifacher Ausfertigung. Alternativ legen Sie 0,5 mL zuvor generierten konditionierten Medium in den Brunnen als Quelle der Lockstoffgradient.</li>
	<li>Am nächsten Tag legen Sie Platte 8.000 Monozyten im vorbereitet in 0,3 mL Volumen des Mediums RPMI, enthält 10 % Tet-freie FBS und 1 % Pen/Strep, in dreifacher Ausfertigung, und Inkubation bei 37 ° C um 5 % CO2.</li>
	<li>Sammeln Sie die Einsätze nach 48 h. Hinweis: Die Länge eines Experiments muss optimiert werden, je nach den spezifischen Bedingungen und Zellen verwendet, indem Sie ausführen eine Zeitverlauf Experiment wo sind Einsätze in unterschiedlichen Inkubationszeiten gesammelt.<ol>
<li>Schütteln Sie das überschüssige Medium und streichen Sie genau die Innenfläche mit einem Baumwoll-gespitzten Applikator Zellen zu entfernen, die nicht migriert haben.</li>
		<li>Flecken Sie auf der Außenseite der Einsätze mit der Wright Giemsa-Methode.</li>
		<li>Montieren Sie sorgfältig 3 Einsätze/Objektträger in eine hohe Viskosität Mikroskop Immersionsöl, um sicherzustellen, dass die Seite des Filters mit migrierten Makrophagen nach oben zeigt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bild der Folien mit einem Lichtmikroskop mit 20 X Objektiv. Fotografieren Sie die 9 Felder/Filter. Zählen Sie die migrierte Makrophagen in 9 Felder/Filter.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Bestehend aus einer Vielzahl von Zelltypen, ist die TME entscheidend für die Entstehung von Krebs. Um optimale Wachstumsbedingungen zu ermitteln, ziehen die Krebszellen Monozyten durch Sekretion von chemotaktische Faktoren. Hier präsentieren wir ein Protokoll für das Studium des Mechanismus der Monocyte Rekrutierung von Tumor Zellen in Vitro. Zu diesem Zweck wird eine Kombination von induzierbaren gen Expressionssystems, Reinigung des primären menschlichen Monozyten und als Beispiel für eine Migration Assay...

Tumor verbunden sind Makrophagen (TAMs) tragen zur Tumorentstehung durch die Förderung von Tumorwachstum und Metastasierung regulieren die Immunantwort2. Krebszellen Rekrut entzündliche Monozyten, die Tumor zu infiltrieren und Pro-tumorigenic TAMs3differenzieren. Infiltration des Tumors mit TAMs korreliert mit schlechten klinischen Verlauf und die immunsuppressive Rolle der Makrophagen4,5verbunden worden. Allerdings sind die Mechanismen der Rekrutierung von Makrophagen an den Tumor nicht gut erforscht und ein besseres Verständnis der beteiligten Bahnen ist entscheidend für die Weiterentwicklung des Feldes und vielversprechende Therapien. Eine der Herausforderungen bei der Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Tumorzellen und normalen Zellen im Tumor Mikroumgebung (TME) ist die Komplexität der Mechanismen und Zellen beteiligt, in-vitro- Ansätze, die Präparation der das Übersprechen zu ermöglichen. Hier präsentieren wir eine vielseitige Methode, die angewendet werden kann, um parakrine Wirkung von einem Krebs Zelle abgeleitet, sekretierten Proteine über die Migration von anderen Zelltypen wie Makrophagen, in Vitrozu untersuchen. Mit einem System, wo ist der Ausdruck der ShRNA gegen ein Krebs Zelle abgeleitete Protein beteiligt bei der Rekrutierung von Monozyten unter der Kontrolle des Tetracyclin induzierbaren Promotors, ist die parakrine Wirkung des sekretierten Proteins auf Monozyten quantitated. In diesem Protokoll folgte Klonen von ShRNA Sequenzen in der Tetracyclin-regulierten Vektor vorgestellt Generation der stabilen Krebszelllinien. Darüber hinaus die Reinigung des primären menschlichen Monozyten und eine Boyden Kammer Assay werden verwendet, um die parakrine Wirkung eine Krebszelle abgeleitete Protein zur Migration von Monozyten zu analysieren.
Herunterregulierung des Proteins Kodierung Gene wird häufig mit SiRNA und ShRNA Techniken, wenn auch nicht ohne Einschränkungen in der Verwendung angewendet. Der langfristigen Knock-Down (KD) von Genen kann sekundäre adaptive Reaktion der Zellen hervorrufen, die experimentellen Ergebnisse beeinträchtigen. Fehlende zeitliche Kontrolle der Genexpression macht es schwierig, die dynamische Rolle eines Proteins über die Zeit oder die Rolle eines Proteins entscheidend für das Überleben der Zellen zu studieren. Dieses Problem ist besonders wichtig in in-Vivo -Einstellungen, wo möglicherweise die Rolle eines Proteins in Tumorentstehung und Progression Downregulation des Ausdrucks des Proteins des Interesses erforderlich, nur nach Tumor festgestellt wird. Bedingte KD hat den Vorteil, verhindern eine zu frühe tödliche Wirkung von der KD auf Zellen und Analyse der Rolle des Proteins in verschiedenen Phasen des Tumorwachstums, zu ermöglichen, während bedingungslose KD mangelnde Entwicklung von Tumoren führen kann.
Eine Reihe von bedingten KD-Systeme wurden entwickelt, um die Einschränkungen des stabilen KD zu beheben. Die bedingte gen Expressionssysteme gehören Ecdyson-induzierbaren Überexpression Systeme, Cytochrom P-450 Induktion System1und Tetracyclin reguliert gen Expressionssysteme. Die Tetracyclin-regulierte Gene Expressionssysteme ermöglichen Steuerung Ausdruck der ShRNA nach Zugabe von Antibiotika Tetracyclin (oder seine stabiler analog - Doxycyclin). In Tet-ON Systemen, der Ausdruck der ShRNA induziert wird, in Anwesenheit von Tetracyclin/Doxycyclin, wodurch eine Genexpression KD, während in Tet-OFF-Systeme, ist der Ausdruck der ShRNA in Anwesenheit von Tetracyclin, wodurch in der Genexpression unterdrückt. Ein Nachteil von Tetracyclin-induzierbaren Systems ist bereits berichtet niedrigen Ebenen des Ausdrucks der ShRNA in Ermangelung von Doxycyclin - so genannte Undichtigkeit6,7. In der Tet-beschrieben System hier, bei der Verabreichung von Tetracyclin, die Bindung des konstitutiv exprimierten Tetracyclin Repressor (TetR) Protein auf die Tet-responsive Element (TRE) Sequenz innerhalb der H1 Promotorregion ShRNA von Interesse ist unterdrückt. Dies führt zu Ausdruck der ShRNA und Hemmung der Übersetzung des Proteins des Interesses an einem Tetracyclin-abhängigen Weise8,9.
Andere verfügbare Tet-ON-Systeme umfassen gleichzeitige Knock-in der die Sequenz zwischen TATA-Box und proximalen Sequence-Element (PSE) und TATA-Box und Transkription starten Website entwickelt von Chan Et al.TetO. 10 dieses System erfordert weniger toxische Dosen von Tetracyclin, ShRNA Ausdruck, jedoch unter einer nicht-induzierte Zustand zu regulieren niedrige Niveaus der ShRNA ausgedrückt werden. Der Krüppel-assoziierten Feld (Krabbe) basierte Tet-ON System11 enthält KRAB, ein Zink-Finger-Protein, das Themen Gene innerhalb eines Bereichs von 3 kb der KRAB Bindungsstelle transcriptional Unterdrückung gelegen. Chimäres Protein tTRKRAB TetO binden kann, und aufgrund der großen Palette von DNA steuerbare Kapazität, TetO brauchen nicht zwischen die Transkription zu Website und dem Projektträger zu starten und haben geringe Auswirkungen auf die Aktivität des Veranstalters. Unter den nicht-induzierte Zustand wurde diese steuerbare RNA Interferenzsystem berichtet, zeigen ein geringeres Maß an undichten Ausdruck der ShRNA11,12; Es erfordert jedoch einen sequenziellen, zwei-Vektor klonen Ansatz. Im Vergleich zu vorher entwickelten bedingte KD-Systeme wie z. B. die Ecdyson-induzierbaren Überexpression oder Cytochrom P-450 Induktionssystem das Tetracyclin-regulierten System hat den Vorteil, seine Robustheit und Reversibilität und ist daher die am häufigsten verwendeten routinemäßig System13. Das System verwendet in diesem Protokoll hat den Vorteil gegenüber dual TetO Knock-in-System und KRAB Tet-ON System, wie es erfordert, geradlinig, einzelne Vektor klonen, ermöglicht schnelle Erzeugung von mehreren Klonen, und es sehr geringe Undichtigkeit in zeigt der das Fehlen von Doxycyclin.
TME ist entscheidend für die Entstehung von Krebs. Zur Erleichterung der Tumorwachstum rekrutieren Krebszellen entzündliche Monozyten durch Sekretion chemotaktische Proteine. Rekrutierte Monozyten des Tumors zu infiltrieren und differenzieren in Pro-tumorigenic TAMs, die Tumorwachstum und Metastasierung beitragen. In-vitro- Studien der Immunzelle Rekrutierung nutzen Migration Assays, mit Boyden Kammer Assay wird weithin verwendet14,15,16,17. In diesem Test wird die Lockstoffgradient Protein-Quelle, z. B. Krebszellen oder ein gereinigtes Protein, in der unteren Kammer platziert. Immunzellen befinden sich in der oberen Kammer durch poröse Membran aus dem unteren Fach getrennt. Zellen, die Migration auf die zunehmende Neigung der Lockstoffgradient, und auf der unteren Seite der Membran sind fleckig und unter dem Mikroskop ausgezählt. Hier testen wir die Lockstoffgradient Funktion des Plasminogen-Aktivator-Inhibitor 1 (PAI-1) auf Monozyten durch die Generierung von stabilen, induzierbaren Krebszelllinien, wo Doxycyclin Zusatz Expression von PAI-1 geregelt ist. Wir verwenden menschliche primäre Monozyten in der Boyden Kammer Migration Test zu um beurteilen, die Rolle des PAI-1 Monocyte Migration. Unterschiede zwischen primären menschlichen Monozyten und weit verbreiteten monozytären Zelllinien wie THP1 berichtet worden und umfassen verschiedene Cytokine Ausdruck Muster18; z. B. 5-10 fache Erhöhung der TNF-α Ausdruck von THP1 Zellen gegenüber menschlichen Monozyten19. THP1 Zellen menschlichen Leukämie monozytären Zellen abgeleitet sind, sind leicht zu pflegen und vermehren sich mit durchschnittlich Verdopplungszeit von 19-50 h20. Im Gegenteil, sind menschlichen Monozyten gekennzeichnet durch eine kurze Lebensdauer in der Abwesenheit von Wachstumsfaktoren. Da Monozyten aus Blut von Spendern, gereinigt sind eine ganze Menge Variabilität tritt zwischen den Individuen und abhängig von der Methode der Reinigung, kann Verunreinigungen mit anderen Zelltypen entstehen. Jedoch primäre Monozyten relevant sind und es wird empfohlen, verwenden oder mit der monozytären Zelllinien mit primären Monozyten in biologischen Forschung19erzielten Ergebnisse bestätigen. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Reinigung der menschlichen primäre Monozyten aus dem peripheren Blut. Alternative Methoden der Monocyte Reinigung gehören Dichte-Gradienten und Haftung-Protokolle und zwei-Schritt-Verfahren mit einzelnen Steigungen von Ficoll-Hypaque gefolgt von einer Percoll gradient21. Die Reinheit der Monocyte Bevölkerung durch diese Methoden schwankt zwischen 70-90 % erhalten. Die hier beschriebene Methode verwendet ein Dichtegradient, gefolgt von einer negativen Auslese immun22 und ermöglicht die Reinigung des menschlichen Monozyten ohne direkten Kontakt mit Antikörpern, damit ihre versehentliche Aktivierung zu vermeiden und was ein > 95 % reines Bevölkerung von Monozyten.
Das Protokoll hier vorgestellten dient zur Errichtung eines funktionalen Tet-ON Systems Genexpression KD in menschlichen Krebszelllinien, um die Lockstoffgradient Wirkung des Krebs-abgeleitete sekretierten Proteins PAI-1 auf Monozyten zu studieren. PAI-1 ist durch eine Vielzahl von Tumoren überexprimiert und seinen Ausdruck paradoxerweise korreliert mit schlechten klinischen Verlauf23,24. Die Pro-tumorigenic Rolle des PAI-1 ergibt sich aus seiner Pro-angiogenen und Anti-apoptotische Funktionen25,26. PAI-1 hat sich gezeigt, zu einer Entzündung durch Förderung der Rekrutierung von Makrophagen an den Ort der Entzündung27beizutragen. PAI-1 zeigte, glatte Muskulatur Cellmigration28,29 zu fördern und zur Teilnahme an der Mac-1 abhängige Makrophagen Migration30. PAI-1-Überexpression nachweislich auch Rekrutierung von Raw 264,7 Makrophagen in B16F10 Melanom Tumoren31deutlich zu verbessern. Jedoch wurde die Rolle des PAI-1 in TAM Migration nicht im Detail untersucht. Wir verwenden das beschriebene Protokoll beantworten die Frage, ob PAI-1 Monozyten zu Krebszellen zieht. Diese Methodik ermöglicht Dissektion der das Übersprechen zwischen Tumor und TME durch die sekretierten Proteine in Krebszellen zum Schweigen zu bringen und die Komponenten von der TME analysieren.

<table><tbody><tr><td>Tet-pLKO-puro lentiviral vector</td><td>Addgene</td><td>21915</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Tetracycline-free)</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-15</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>Sigma</td><td>10771-500ML</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Human Monocyte Enrichment Kit</td><td>StemCell</td><td>19059</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Magnet</td><td>StemCell</td><td>18002</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI HF</td><td>NEB</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>AgeI HF</td><td>NEB</td><td>R3552S</td><td></td></tr><tr><td>Cut Smart buffer</td><td>NEB</td><td>B7200S</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>PROMEGA Wizard SV Gel and PCR Cleanup System</td><td>PROMEGA</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>psPAX vector</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G vector</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>One Shot Stbl3 Chemically Competent&amp;nbsp;E. coli</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C737303</td><td></td></tr><tr><td>Hema 3 stain set for Wright-Giemsa stain</td><td>Protocol</td><td>123-869</td><td></td></tr><tr><td>HEK293 cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>XhoI restriction enzyme</td><td>NEB</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Ligase buffer</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0.5 M solution</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R1021</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>The Big Easy&quot; EasySep Magnet</td><td>Stem Cell</td><td>18001</td><td></td></tr><tr><td>0.1% Poly-L-Lysine solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7670</td><td></td></tr><tr><td>Sodium butyrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5887</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &amp;mu;M syringe filters</td><td>VWR International</td><td>28145-479</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881-500g</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td><td>Invitrogen</td><td>15504-020</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride(NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-5 kg</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-100g</td><td></td></tr><tr><td>dithioerythritol (DTE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8255-5g</td><td></td></tr><tr><td>ethanol (EtOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792780</td><td></td></tr><tr><td>tryptone</td><td>Amresco</td><td>J859-500g</td><td></td></tr><tr><td>yeast extract</td><td>Fluka</td><td>70161-500g</td><td></td></tr><tr><td>Bacto agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>ampicillin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9393-5g</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle&amp;rsquo;s Medium (DMEM)</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>puromycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9620</td><td></td></tr><tr><td>Doxycycline hyclate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-25g</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI)</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA pH 8.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R1021</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Permeable Support for 24 Well Plate with 8.0&amp;mu;m Transparent PET Membrane</td><td>Becton Dickinson</td><td>353097</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Cotton-Tipped Applicator&amp;nbsp;</td><td>Medline</td><td>MDS202000</td><td></td></tr><tr><td>Protocol Hema 3 STAT pack&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>123-869</td><td></td></tr><tr><td>Resolve Immersion Oil, High Viscosity</td><td>Richard Allan Scientific</td><td>M4004</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr></tbody></table>

conditional knockdown of gene expression in cancer cell lines to study the recruitment of monocytes/macrophages to the tumor microenvironment

SiRNA und ShRNA-vermittelten niederzuschlagen (KD) Methoden der Genexpression regulieren sind wertvolle Werkzeuge für das Verständnis der Funktion der Gene und Proteine. Jedoch in dem Fall, dass das KD des Proteins des Interesses eine tödliche Wirkung auf Zellen hat oder die erwartete Wirkung der KD ist sind zeitabhängig, bedingungslose KD-Methoden nicht geeignet. Bedingte Systeme eignen sich eher in diesen Fällen und das Thema von großem Interesse gewesen. Dazu gehören Ecdyson-induzierbaren Überexpression Systeme, Cytochrom P-450 Induktion System1, und die Tetracyclin reguliert gen Expressionssysteme.
Das Tetracyclin reguliert gen Ausdruck System ermöglicht reversible Kontrolle über Protein-Expression durch Induktion der ShRNA Ausdruck im Beisein von Tetracyclin. In diesem Protokoll präsentieren wir ein experimentelles Design mit funktionalen Tet-ON System im menschlichen Krebszelllinien für bedingte Regulation der Genexpression. Dann zeigen wir den Einsatz dieses Systems in der Studie von Tumor-Zelle-Monocyte-Interaktion.

Drei ShRNA-Sequenzen wurden für die effizienteste KD PAI-1 getestet. Hierzu wurden ShRNA Sequenzen gegen PAI-1 und Rührei (Tabelle 1) in Tet pLKO Puro Expressionsvektor nach dem oben beschriebenen Protokoll geklont. Die HT-1080 Fibrosarkom Zell-Linie war mit generierten Konstrukte stabil transfiziert und die Zellen wurden für 3 Tage mit Doxycyclin behandelt. Die Expression von PAI-1 ergab sich durch Western Blot- ()Abbildung 2A</st...

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Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

Dieses Protokoll dient eine Regelung für die Einrichtung eines funktionalen Tet-ON Systems in Krebszelllinien und seine spätere Verwendung, insbesondere für die Untersuchung der Rolle der Tumor Zelle abgeleitet Proteine bei der Rekrutierung von Monozyten/Makrophagen, den Tumor Mikroumgebung.

Bedingte Knockdown von Genexpression in Krebs-Zell-Linien, die Rekrutierung von Monozyten/Makrophagen, den Tumor Mikroumgebung zu studieren

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

conditional-knockdown-gene-expression-cancer-cell-lines-to-study

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Cancer Research

12.3K Aufrufe.  University of Southern California. Dieses Protokoll dient eine Regelung für die Einrichtung eines funktionalen Tet-ON Systems in Krebszelllinien und seine spätere Verwendung, insbesondere für die Untersuchung der Rolle der Tumor Zelle abgeleitet Proteine bei der Rekrutierung von Monozyten/Makrophagen, den Tumor Mikroumgebung.

Serie: Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful immunotherapies. Several studies have indicated that tumor infiltrating myeloid cells (e.g., myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) and tumor-associated macrophages (TAMs)) suppress cytotoxicity of CD8+ T cells in the tumor microenvironment, and that targeting these regulatory myeloid cells can improve immunotherapies. Here, we present an in vitro assay system to evaluate immune suppressive effects of monocytic-MDSCs and TAMs on the tumor-killing ability of CD8+ T cells. To this end, we first cultured na&#239;ve splenic CD8+ T cells with anti-CD3/CD28 activating antibodies in the presence or absence of suppressor cells, and then co-cultured the pre-activated T cells with target cancer cells in the presence of a fluorogenic caspase-3 substrate. Fluorescence from the substrate in cancer cells was detected by real-time fluorescence microscopy as an indicator of T-cell induced tumor cell apoptosis. In this assay, we can successfully detect the increase of tumor cell apoptosis by CD8+ T cells and its suppression by pre-culture with TAMs or MDSCs. This functional assay is useful for investigating CD8+ T cell suppression mechanisms by regulatory myeloid cells and identifying druggable targets to overcome it via high throughput screening.

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

We describe here a protocol to investigate cytotoxicity of pre-activated CD8+ T cells against cancer cells by detecting apoptotic cancer cells via real-time microscopy. This protocol can investigate mechanisms behind myeloid cell-induced T cell suppression and evaluate compounds aimed at replenishing T cells via blockade of immune suppressive myeloid cells.

Echtzeit-Erkennung von In Vitro Tumor Zelle Apoptose induziert durch CD8+ T-Zellen, unterdrückende Immunfunktionen Tumor infiltrieren myeloische Zellen zu studieren

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Forschung

Krebsforschung

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a malignant brain tumor with no cure, has up to a half the tumor mass TAMs. TAMs can be pro-tumoral or anti-tumoral, depending on the activation of specific genes in the cells. Genetic mutations in the tumors, through regulating cytokine expression, can affect recruitment of TAMs to the tumor microenvironment. Here, we describe a quantitative cell-based assay to assess macrophage recruitment by the conditioned medium from the tumor cells. This assay uses the human macrophage cell line MV-4-11 to study macrophage attraction by the conditioned medium from glioblastoma, allowing for high reproducibility and low variability. Data generated with this assay can contribute to a better understanding of the interaction between the tumor and the tumor microenvironment. Similar assay can be used to assess interaction between the tumor cells and other immune cells, including T cells and natural killer (NK) cells.

This article represents a useful in vitro assay to evaluate the capability of conditioned medium from tumor cells to attract macrophages.

In Vitro-Assay zur Untersuchung der Tumor-Makrophage-Interaktion

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer growth and metastasis. Paracrine signals can involve cell-cell contact between different cell types, such as PD-L1 expressed on the surface of tumors interacting directly with PD-1 on the surface of T cells, or the secretion of ligands by a tumor cell to affect an immune cell. Here we describe a co-culture method to interrogate the effects of tumor-secreted ligands on immune cell (macrophage) activation. This straightforward procedure utilizes commercially available 0.4 &#181;m polycarbonate membrane permeable supports and standard tissue culture plates. In the process described, macrophages are cultured in the upper chamber and tumor cells in the lower chamber. The presence of the 0.4 &#181;m barrier allows for the study of intercellular signaling without the confounding variable of physical contact, because the two cell types share the same medium and exposure to paracrine ligands. This approach can be combined with others, such as genetic alterations of the macrophage (e.g., isolation from genetic knock-out mice) or tumor (e.g., CRISPR-mediated alterations) to study the role of specific secreted factors and receptors. The approach also lends itself to standard molecular biological analyses such as quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) or Western blot analysis, without the need for flow sorting to separate the two cell populations. Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) can similarly be utilized to measure secreted ligands to better understand the dynamic interaction of cell signaling in the multiple cell type context. Duration of co-culture can also be varied for the study of temporally regulated events. This co-culture method is a robust tool that facilitates the study of tumor-secreted signals in the immune context.

Here, we present a method using permeable membrane supports to facilitate the study of non-contact paracrine signaling used by tumor cells to suppress the immune response. The system is amenable to studying the role of tumor-secreted factors in dampening macrophage activation.

Untersuchung der Auswirkungen von tumorgeheimen Parakrinliganden auf die Makrophagenaktivierung mit Co-Culture mit permeableMembranen unterstützt

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...

Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These acquired abnormalities in complex, multilayered molecular signaling networks induce aberrant cell proliferation and survival, extracellular matrix degradation, and metastasis to distant organs. Approximately 90% of cancer-related deaths are estimated to be caused by the direct or indirect effects of metastatic dissemination. Therefore, it is important to establish a highly reliable, comprehensive system to characterize cancer cell behaviors upon genetic and environmental manipulations. Such a system can give a clear understanding of the molecular regulation of cancer metastasis and the opportunity for successful development of stratified, precise therapeutic strategies. Hence, accurate determination of cancer cell behaviors such as migration and invasion with gain or loss of function of gene(s) allows assessment of the aggressive nature of cancer cells. The real-time measurement system based on cell impedance enables researchers to continually acquire data during a whole experiment and instantly compare and quantify the results under various experimental conditions. Unlike conventional methods, this method does not require fixation, staining, and sample processing to analyze cells that migrate or invade. This method paper emphasizes detailed procedures for real-time determination of migration and invasion of glioblastoma cancer cells.

Cancer is a lethal disease due to its ability to metastasize to different organs. Determining the ability of cancer cells to migrate and invade under various treatment conditions is crucial to assessing therapeutic strategies. This protocol presents a method to assess the real-time metastatic abilities of a glioblastoma cancer cell line.&#160;

Impedanzbasierte Echtzeitmessung der Krebszellmigration und -invasion

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to understand the underlying mechanisms of these diseases. We therefore present a straightforward protocol for the isolation of human monocytes from buffy coats, followed by a differentiation procedure which results in high macrophage yields. The technique relies mostly on commonly available lab equipment and thus provides a cost and time effective way to obtain large quantities of human macrophages. Briefly, buffy coats from healthy blood donors are subjected to a double density gradient centrifugation to harvest monocytes from the peripheral blood. These monocytes are then cultured in fluorinated ethylene propylene (FEP) Teflon-coated cell culture bags in the presence of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). The differentiated macrophages can be easily harvested and used for subsequent studies and functional assays. Important methods for quality control and validation of the isolation and differentiation steps will be highlighted within the protocol. In summary, the protocol described here enables scientists to routinely and reproducibly isolate human macrophages without the need for cost intensive tools. Furthermore, disease models can be studied in a syngeneic human system circumventing the use of murine macrophages.

We present a simple and efficient protocol for the generation of human macrophages. Buffy coats are processed by double density gradient centrifugation and isolated monocytes are then differentiated to macrophages in Teflon-coated cell culture bags. This maximizes macrophage yields and facilitates cell harvesting for subsequent experiments.

Isolierung humaner Monozyten durch Doppel-Zentrifugation und ihre Differenzierung zu Makrophagen in Teflon-beschichteten Zellkultur-Taschen

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Immunologie und Infektion

A Robust Discovery Platform for the Identification of Novel Mediators of Melanoma Metastasis

Metastasis is a complex process, requiring cells to overcome barriers that are only incompletely modeled by in vitro assays. A systematic workflow was established using robust, reproducible in vivo models and standardized methods to identify novel players in melanoma metastasis. This approach allows for data inference at specific experimental stages to precisely characterize a gene's role in metastasis. Models are established by introducing genetically modified melanoma cells via intracardiac, intradermal, or subcutaneous injections into mice, followed by monitoring with serial in vivo imaging. Once preestablished endpoints are reached, primary tumors and/or metastases-bearing organs are harvested and processed for various analyses. Tumor cells can be sorted and subjected to any of several 'omics' platforms, including single-cell RNA sequencing. Organs undergo imaging and immunohistopathological analyses to quantify the overall burden of metastases and map their specific anatomic location. This optimized pipeline, including standardized protocols for engraftment, monitoring, tissue harvesting, processing, and analysis, can be adopted for patient-derived, short-term cultures and established human and murine cell lines of various solid cancer types.

This article describes a workflow of techniques employed for testing novel candidate mediators of melanoma metastasis and their mechanism(s) of action.

Eine robuste Entdeckungsplattform zur Identifizierung neuartiger Mediatoren der Melanommetastasierung

Metastasis is a complex process, requiring cells to overcome barriers that are only incompletely modeled by in vitro assays. A systematic workflow was ...

An Ectopic Chemokine Expression Model for Testing Macrophage Recruitment In Vivo

Zebrafish are widely used in basic and biomedical research. Many zebrafish transgenic lines are currently available to label various types of cells. Owing to the transparent embryonic body of zebrafish, it is convenient for us to study the effect of one chemokine on the behavior of a certain type of cells in vivo. Here we provided a workflow to investigate the function of a chemokine on macrophage migration in vivo. We constructed a tissue-specific overexpression plasmid to overexpress IL-34 and injected the plasmid into one-cell stage transgenic fish embryos whose macrophages were specifically labeled by a fluorescent protein. We then used whole mount fluorescent in situ hybridization and immunostaining to detect the pattern of the chemokine expression and the number or location of macrophages. The injected WT embryos were raised to generate a stable transgenic line. Finally, we used confocal live imaging to directly observe macrophage behavior in the stable transgenic fish to study the function of IL-34 on macrophages in vivo.

To test the effect of a chemokine on macrophage recruitment in vivo, the whole mount in situ hybridization was used to detect the ectopic expression of the chemokine, and immunostaining was used to label macrophages. Live imaging was used for real-time observation of macrophage migration.

Ein ektopisches Chemokin-Expressionsmodell zum Testen der Makrophagenrekrutierung in Vivo

Zebrafish are widely used in basic and biomedical research. Many zebrafish transgenic lines are currently available to label various types of cells. Owing ...

Entwicklungsbiologie

<meta charset="utf8"></head><body>Untersuchung von Makrophagen-Tumor-Sphäroid-Interaktionen in einem 3D-Kollagenmatrix-Setup

A Macrophage-Tumor Spheroid Co-Invasion Assay

The interaction of immune and cancer cells and their respective impact on metastasis represents an important aspect of cancer research. So far, only a few protocols are available that allow an in vitro approximation of the in vivo situation. Here, we present a novel approach to observing the impact of human macrophages on the invasiveness of cancer cells, using tumor spheroids of H1299 non-small cell lung carcinoma cells embedded in a three-dimensional (3D) collagen I matrix. With this co-cultivation setup, we tested the impact of small interfering RNA (siRNA)-based depletion of regulatory factors in macrophages on the 3D invasion of cancer cells from the tumor spheroid compared to controls. This method allows the determination of different parameters, such as spheroid area or the number of invading cancer cells, and thus, to detect differences in cancer cell invasion. In this article, we present the respective setup, discuss the subsequent analysis, as well as the advantages and potential pitfalls of this method.

<meta charset="utf8"></head><body>Ein Makrophagen-Tumor-Sphäroid-Co-Invasions-Assay

Here, we present a protocol to investigate the interaction of primary human monocyte-derived macrophages with a tumor spheroid in a three-dimensional (3D) collagen I matrix, with the possibility to compare the impact of soluble and physical properties of the microenvironment on cell invasion.

Ein Makrophagen-Tumor-Sphäroid-Co-Invasions-Assay

The interaction of immune and cancer cells and their respective impact on metastasis represents an important aspect of cancer research. So far, only a few ...

Bedingte Knockdown von Genexpression in Krebs-Zell-Linien, die Rekrutierung von Monozyten/Makrophagen, den Tumor Mikroumgebung zu studieren

Zusammenfassung

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Echtzeit-Erkennung von In Vitro Tumor Zelle Apoptose induziert durch CD8⁺ T-Zellen, unterdrückende Immunfunktionen Tumor infiltrieren myeloische Zellen zu studieren

In Vitro-Assay zur Untersuchung der Tumor-Makrophage-Interaktion

Untersuchung der Auswirkungen von tumorgeheimen Parakrinliganden auf die Makrophagenaktivierung mit Co-Culture mit permeableMembranen unterstützt

Impedanzbasierte Echtzeitmessung der Krebszellmigration und -invasion

Isolierung humaner Monozyten durch Doppel-Zentrifugation und ihre Differenzierung zu Makrophagen in Teflon-beschichteten Zellkultur-Taschen

Eine robuste Entdeckungsplattform zur Identifizierung neuartiger Mediatoren der Melanommetastasierung

Ein ektopisches Chemokin-Expressionsmodell zum Testen der Makrophagenrekrutierung in Vivo

Ein Makrophagen-Tumor-Sphäroid-Co-Invasions-Assay

Ein Makrophagen-Tumor-Sphäroid-Co-Invasions-Assay

Ein Makrophagen-Tumor-Sphäroid-Co-Invasions-Assay