Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Ernst Und Berta Grimmke Stiftung und die Deutsche Ophthalmologische Gesellschaft (DOG) unterstützt.

Die experimentellen Verfahren dieser Studie wurden durch die Animal Care Ausschuss des Landes Rheinland-Pfalz, Deutschland genehmigt. Tierbetreuung entsprach der institutionellen Richtlinien and The Association Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Erklärung für den Einsatz von Tieren in der Augenheilkunde und Vision Forschung. Nach der EU-Richtlinie 2010/63/EU für Tierversuche wurden die Tiere behandelt. Männliche C57BL/6J Mäuse (The Jackson Laboratory, Bar Harbour, ME, USA) im Alter von 3 bis 4 Monate waren für die Experimente verwendet. Tiere waren unter Standardbedingungen (Temperatur 23 ± 2 ° C, Luftfeuchtigkeit Bereich 55 ± 10 % und 12 h hell/dunkel-Zyklen) untergebracht und hatten Zugang zu standard-Maus Chow und Wasser Ad Libitum.
1. Isolierung der Maus Retina
<ol><li>Legen Sie die Dissektion Instrumente auf dem Vorbereitungstisch und prüfen Sie, ob alle Instrumente ermöglichen eine schnelle Zubereitung abgeschlossen sind.</li>
	<li>Die Maus durch CO2 Inhalation zu opfern.</li>
	<li>Enthaupte die Maus mit Stahl Schere, Schädel-Sagitally in zwei Hälften, die mit der gleichen Schere schneiden und entfernen Sie die Haut und das Gehirn mit Auge Schere (Abbildung 1).</li>
	<li>Die Schädelknochen lassen nur den augenhöhlenknochen mithilfe Auge Schere abgeschnitten.</li>
	<li>Übertragen Sie die Umlaufbahn in eine Dissektion Schale mit eiskalten Krebs-Henseleit-Puffer.</li>
	<li>Halten Sie die Dissektion Gericht auf Eis oder ändern Sie den Puffer alle 10 Minuten.</li>
	<li>Schneiden Sie die augenhöhlenknochen mit Auge Schere und entfernen Sie vorsichtig die Augapfels zusammen mit dem orbital Gewebe mit Typ 4 Präzision Pinzetten und Student Vannas Frühjahr Scheren (Abbildung 2).</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig die Harderian Drüse, Bindegewebe und die extraokularen Muskeln mit Typ 5 Präzisions-Pinzetten und Vannas kapsulotomie Scheren, kümmert sich nicht um die Hauptniederlassung der Augenarterie beschädigen.</li>
	<li>Verbinden Sie orbital Zweige von der Augenarterie und schließlich das proximale Ende der wichtigste Zweig der Augenarterie mit 10: 0 Nylon Fäden (Abbildung 3).</li>
	<li>Übertragen des Augapfels in eine Petrischale mit 70 % igem Ethanol für 10 s mit 4 Präzisions-Pinzette geben. Setzen Sie des Augapfels wieder in die Dissektion Gericht und ersetzen Sie den Puffer mit frischen Krebs-Lösung zu. Die Hornhaut wird nach Ethanol Exposition weißlich erscheinen.</li>
	<li>Punktieren Sie die periphere Hornhaut mit einem 30 Gauge-Nadel und sezieren Sie die Hornhaut mit einer Schere Vannas kapsulotomie. Schonend Iris Gewebe geschnitten Sie ab, legen Sie eine scharfe Spitze der Vannas kapsulotomie Schere zwischen der Aderhaut und der Netzhaut und der Aderhaut und Lederhaut abgeschnitten. Lassen Sie einige skleralen Gewebe rund um den Sehnerv (Abbildung 4).</li>
</ol>2. Montage der Netzhaut in der Perfusion Kammer
Hinweis: Die Perfusion Kammer zur Netzhaut arteriola Experimente ist hausgemacht. Es besteht aus einem transparent Reservoir mit einem ein- und Abfluss Rohr (Abbildung 5). Einem Ende ein Silikonschlauch wird auf den Boden der Kammer mit Klebstoff Histoacryl und das andere Ende an ein Dreiwege Hahn befestigt geklebt. Schließen Sie eine Spritze mit frischen Krebs-Puffer, der drei-Wege-Hahn und füllen Sie das Rohr mit Puffer.
<ol><li>Nehmen Sie ein Glas Mikropipette mit einem Nadelhalter und schieben Sie es in das Ende des Rohres an der Unterseite der Perfusion Kammer. Dann brechen Sie die Spitze der Mikropipette mit Typ 4 Scheren, ein Trinkgeld von 100 µm Durchmesser zu erhalten.</li>
	<li>An der Spitze der Mikropipette konzentrieren Sie und spülen Sie es über die Spritze mit dem Schlauch verbunden. Darauf achten Sie, dass die Kapillare nicht durch Trümmer verdeckt ist. Im Falle einer Okklusion entfernen Sie, spülen Sie den Schlauch und fügen Sie ein weiteres Mikropipette.</li>
	<li>Füllen Sie die Perfusion Kammer mit kalten Krebs Puffer und setzen Sie die Kammer unter dem Stereo-Mikroskop.</li>
	<li>Legen Sie eine transparente Kunststoff-Plattform in der Perfusion Kammer. Diese Plattform hat eine Einrückung von 1,8 mm Breite für den Sehnerv und der Augenarterie und befindet sich an zwei Stahlseilen von 1,6 mm Durchmesser. Legen Sie dann einen Edelstahl-Ring von 2,8 mm Innendurchmesser und 4,0 mm Außendurchmesser auf die Plattform.</li>
	<li>Übertragen der Netzhaut mit dem Sehnerv und angehängten Augenarterie aus der Dissektion Kammer in die Perfusion Kammer äußerst vorsichtig mit einem Löffel. Dieser Schritt ist wichtig zur Vermeidung Dehnung des Gewebes, wie es möglicherweise nachteilig auf das Experiment.</li>
	<li>Der genähten Teil das proximale Ende der Augenarterie abgeschnitten, legen Sie zwei vorgeformte Schleifen von 10-0-Nylon-Naht auf der Mikropipette und cannulate der Augenarterie mit der Mikropipette. Binden Sie die Arterie, die Mikropipette (Abbildung 6) und platzieren Sie die Netzhaut auf die transparente Plattform Pinzette fein-Punkt.</li>
	<li>Schonend reißen Sie der vorderen Linse Capsula mit zwei feinen Spitze Pinzette auf, ziehen Sie die Linse heraus und schneiden Sie die ganze Linse Capsula mit Microscissors.</li>
	<li>Anschließend stellen Sie vier radiale Einschnitte in die Netzhaut Hälfte der Strecke von der Pars Plana des Sehnervs und legen Sie einen Edelstahl-Ring auf die Netzhaut, es unten zu befestigen. Die Netzhaut ist nun bereit für das Experiment (Abbildung 7).</li>
</ol>3. Vorbereitung der retinalen Arteriolen für das Experiment
<ol><li>Ort der Perfusion Kammer unter einem Lichtmikroskop. Das Ziel ist eine 100 X Eintauchen in Wasser Objektiv.</li>
	<li>Verbinden Sie die beiden Schläuche für in - und out - flow mit einer pericyclic Pumpe und zirkulieren Sie die Kammer mit Krebs-Puffer mit 95 % O2 Sauerstoff und Kohlensäure mit 5 % CO2 bei 37 ° C. Verwenden Sie einen Durchfluss zwischen 100 und 120 mL/min.</li>
	<li>Schließen Sie den Silikonschlauch, welche an die Mikropipette angeschlossen ist, an ein Reservoir Silikon Schlauch über ein drei-Wege-Hahn. Dann füllen Sie den Tank mit Krebs Puffer bis zu einer Höhe 50 mm Hg entspricht aber noch nicht die drei-Wege-Absperrhahn geöffnet.</li>
	<li>Schauen Sie durch die Ziele des Mikroskops und Fokus auf der retinalen Oberfläche. Suche nach Blutgefäßen oder roten Blutkörperchen. Es ist möglich, dass die Blutgefäße vollständig manchmal nur einige rote Blutkörperchen sichtbar sind zusammengebrochen sind.</li>
	<li>Wenn ein Blutgefäß gefunden wird, darauf konzentrieren und die drei-Wege-Hahn öffnen. Der Durchmesser des Gefäßes sollte sofort erhöhen und die roten Blutkörperchen bewegen entweder Zentrifugal, ob es eine arteriola, oder centripetally im Falle einer Venole. Die Arteriolen sind kleiner im Durchmesser im Vergleich zu Venolen der gleichen Größenordnung.</li>
	<li>Wenn ein Blutgefäß mit einem gut sichtbaren Wand gefunden ist, kann es für Experimente, die nach einer gasgleichgewichtherstellung von 30 min (Abbildung 8) eingesetzt werden. Zur Zeit der Gleichgewichtherstellung entwickeln die Arteriolen nur schwach inneren Ton, was zu weniger als 10 % der luminalen durchmesserreduzierung.</li>
</ol>4. Durchführung des Experiments
<ol><li>Testen Sie die Tragfähigkeit der Schiffe mit der Thromboxan mimetischen 9,11-Dideoxy-9α, 11α-Methanoepoxy Prostaglandin F2α (U46619), indem es zu den Bad-Lösung. Dieser Agent verengt Maus retinalen Arteriolen um ca. 50 % von Ruhestellung Durchmesser bei Konzentrationen von ≥ 10-6 M.</li>
	<li>Sobald das Schiff tragfähige bestätigt wird, waschen Sie die Agonisten aus dem Bad durch die Umwälzpumpe und liefern Sie frische Krebs Puffer in die Wanne.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Toda, N., Nakanishi-Toda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide:+ocular+blood+flow,+glaucoma,+and+diabetic+retinopathy.">Nitric oxide: ocular blood flow, glaucoma, and diabetic retinopathy.</a> Prog Retin Eye Res. 26 (3), 205-238 (2007).</li><li>Schuster, A. K., Fischer, J. E., Vossmerbaeumer, C., Vossmerbaeumer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+coherence+tomography-based+retinal+vessel+analysis+for+the+evaluation+of+hypertensive+vasculopathy.">Optical coherence tomography-based retinal vessel analysis for the evaluation of hypertensive vasculopathy.</a> Acta Ophthalmol. 93 (2), e148-e153 (2015).</li><li>Cherecheanu, A. P., Garhofer, G., Schmidl, D., Werkmeister, R., Schmetterer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+perfusion+pressure+and+ocular+blood+flow+in+glaucoma.">Ocular perfusion pressure and ocular blood flow in glaucoma.</a> Curr Opin Pharmacol. 13 (1), 36-42 (2013).</li><li>Faraci, F. M., Sigmund, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+biology+in+genetically+altered+mice+:+smaller+vessels,+bigger+insight.">Vascular biology in genetically altered mice : smaller vessels, bigger insight.</a> Circ Res. 85 (12), 1214-1225 (1999).</li><li>Kornfield, T. E., Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Retinal+Blood+Flow+Using+Fluorescently+Labeled+Red+Blood+Cells.">Measurement of Retinal Blood Flow Using Fluorescently Labeled Red Blood Cells.</a> eNeuro. 2 (2), (2015).</li><li>Guevara-Torres, A., Joseph, A., Schallek, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label+free+measurement+of+retinal+blood+cell+flux,+velocity,+hematocrit+and+capillary+width+in+the+living+mouse+eye.">Label free measurement of retinal blood cell flux, velocity, hematocrit and capillary width in the living mouse eye.</a> Biomed Opt Express. 7 (10), 4229-4249 (2016).</li><li>Schallek, J., Geng, Y., Nguyen, H., Williams, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+topography+of+retinal+pericytes+in+the+living+mouse+retina+using+in+vivo+adaptive+optics+imaging+and+ex+vivo+characterization.">Morphology and topography of retinal pericytes in the living mouse retina using in vivo adaptive optics imaging and ex vivo characterization.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8237-8250 (2013).</li><li>Gericke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+muscarinic+acetylcholine+receptor+subtype+mediating+cholinergic+vasodilation+in+murine+retinal+arterioles.">Identification of the muscarinic acetylcholine receptor subtype mediating cholinergic vasodilation in murine retinal arterioles.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (10), 7479-7484 (2011).</li><li>Gericke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+role+of+alpha1-adrenoceptor+subtypes+in+murine+ophthalmic+arteries.">Functional role of alpha1-adrenoceptor subtypes in murine ophthalmic arteries.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (7), 4795-4799 (2011).</li><li>Bohmer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alpha(1)B+-adrenoceptor+subtype+mediates+adrenergic+vasoconstriction+in+mouse+retinal+arterioles+with+damaged+endothelium.">The alpha(1)B -adrenoceptor subtype mediates adrenergic vasoconstriction in mouse retinal arterioles with damaged endothelium.</a> Br J Pharmacol. 171 (16), 3858-3867 (2014).</li></ol>

Die Autoren haben keinen finanziellen Interessenkonflikt.

Die Messung der vaskulären Antworten in der Maus Netzhaut ist schwierig, aufgrund der geringen Größe der Netzhautgefäße. Mit der vorgestellten Technik sind retinale Arteriolen durch übertragbare Lichtmikroskopie visualisiert. Dies ist möglich, weil die isolierte Netzhaut lichtdurchlässig ist. Der Vorteil des Verfahrens ist die hohe optische Auflösung. Die berechnete räumliche Auflösung beträgt 11 px/µm. Allerdings ist die echte Auflösung für das optische System, das weißes Licht verwendet, zwischen 200 un...

Störungen im retinalen Durchblutung haben in der Pathogenese der verschiedenen augenfälligen Krankheiten, z. B. Diabetische Retinopathie und Hypertensive Retinopathie Glaukom1,2,3verwickelt. So Studien zur Messung der vaskulären Reaktivität in der Netzhaut sind wichtig, um die Pathophysiologie dieser Krankheiten zu verstehen und entwickeln neue Behandlung nähert.
Durch die Möglichkeit der Genmanipulation im murinen Genom ist die Maus eine weit verbreitete Tiermodell für Studien des Herz-Kreislauf-System4geworden. Jedoch wegen der geringen Größe der Netzhautgefäße (≤ 30 µm) ist Messung der vaskulären Reaktivität in der Maus Netzhaut anspruchsvoll. Z. B. stereomicroscopic Techniken zur in Vivo Messung sind in ihrer optischen Auflösung begrenzt und erlauben daher nur zum Erkennen von Änderungen im Durchmesser oder Blut fließen in kleinen Blut von weniger als ≤ 30 µm Durchmesser bei der Ausstattung mit genau Weitere anspruchsvolle Geräte wie ein confocal Mikroskop mit Fluoreszenzfarbstoffen oder die Adaptive Optik Scannen Licht Ophthalmoskop5,6. Darüber hinaus ändert sich die Interpretation der in Vivo Messungen zur Ermittlung lokaler signalisieren, dass Mechanismen in retinalen Blutgefäßen durch Anästhetika, verwechselt werden können in systemischen Blutdruck und der Einfluss des retrobulbären Blutgefäße.
Daher entwickelten wir eine Methode zur Messung der Reaktionen der Netzhautgefäße Maus mit hochauflösenden optischen ex Vivo. Die enthaltenen erlaubt Visualisierung der retinalen Arteriolen über übertragen Lichtmikroskopie. Diese Methode, die auch bei Ratten verwendet werden kann, bietet Zugriff auf die Vorteile der Gene targeting-Technologie in okulären Gefäßforschung.

<table><tbody><tr><td>Steel Scissors</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3576.1</td><td>1x 140 mm</td></tr><tr><td>Eye Scissors</td><td>Geuder</td><td>G-19390</td><td>1x straight, 10.5 cm</td></tr><tr><td>Precision tweezers, straight with fine tips</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>LH68.1</td><td>2x type 4</td></tr><tr><td>Precision tweezers, straight with extra fine tips</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>LH53.1</td><td>2x type 5</td></tr><tr><td>Vannas capsulotomy scissors</td><td>Geuder</td><td>19760</td><td>1x straight, 77 mm</td></tr><tr><td>Student Vannas Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>91501-09</td><td>1x curved,</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Barraquer&lt;/em&gt; Needle Holder</td><td>Geuder</td><td>G-17500</td><td>1x curved, 120 mm</td></tr><tr><td>Needle</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>305128</td><td>1x 30 G</td></tr><tr><td>Glass Capillaries (for producing micropipettes)</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>9-000-1211</td><td>1x (1.2 x 0.8 mm; outer/inner diameter)</td></tr><tr><td>Nylon Suture</td><td>Alcon</td><td>198001</td><td>1x 10-0</td></tr><tr><td>Nunclon cell culture dish</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>153066</td><td>1x 35 mm diameter</td></tr><tr><td>Nunclon cell culture dish</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>172931</td><td>1x 100 mm diameter</td></tr><tr><td>Discofix C</td><td>Braun</td><td>16500C</td><td>10 cm</td></tr><tr><td>Histoacryl adhesive</td><td>B. Braun Surgical, S.A.</td><td>1050052</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pericyclic pump&amp;nbsp; (CYCLO II)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>EP76.1</td><td>1x</td></tr><tr><td>Vertical Pipette Puller Model 700C</td><td>David Kopf Instruments</td><td></td><td>1x</td></tr><tr><td>Microscope (Vanox-T AH-2)</td><td>Olympus</td><td></td><td>1x</td></tr><tr><td>Water immersion objective LUMPlanFL, 1.0 NA</td><td>Olympus</td><td></td><td>1x</td></tr><tr><td>Digital camera (TK-C1381)</td><td>JVC</td><td></td><td>1x</td></tr><tr><td>Perfusion chamber</td><td>self-made</td><td></td><td>1x</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Drugs and Solutions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>K928.4</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate (CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>5239.1</td><td></td></tr><tr><td>Kalium chloride (KCl)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>Kalium dihydrogen phosphate (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3904.2</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulphate (MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>261.2</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>9265.2</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydrogen carbonate (NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>0965.3</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-(D)-(+)- Glucose monohydrate</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>6780.1</td><td></td></tr><tr><td>9,11-dideoxy-9&amp;alpha;,11&amp;alpha;-methanoepoxy prostaglandin F2&amp;alpha; (U-46619)</td><td>Cayman Chemical</td><td>16450</td><td></td></tr><tr><td>Acetylcholine chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6625-25G</td><td></td></tr></tbody></table>

preparation steps for measurement of reactivity in mouse retinal arterioles ex vivo

Vaskuläre Insuffizienz und Veränderungen in der normalen retinalen Durchblutung gehören zu den Hauptfaktoren für die Pathogenese der verschiedenen Anblick-bedrohlichen okuläre Erkrankungen wie Diabetische Retinopathie, Hypertensive Retinopathie und Glaukom. Netzhaut mikrovaskuläre Vorbereitungen sind daher entscheidende Instrumente zur physiologischen und pharmakologischen Studien, die zugrunde liegenden pathophysiologischen Mechanismen abzugrenzen und zu Design-Therapien für Krankheiten. Trotz der breiten Verwendung von Mausmodellen in Augenheilkunde sind Studien über die Netzhaut vaskuläre Reaktivität knapp in dieser Spezies. Ein wesentlicher Grund für diese Diskrepanz ist die anspruchsvolle Isolierungsmaßnahmen aufgrund der geringen Größe der diese Netzhautgefäße, die ~ ≤ 30 µm luminalen Durchmesser. Um das Problem der direkten Isolation dieser Netzhaut mikrogefäßen für funktionelle Studien zu umgehen, haben wir eine Isolation und Vorbereitung Technik, die ex-Vivo -Studien der retinalen Vasoactivity Maus in der Nähe von physiologischen Bedingungen ermöglicht . Obwohl die vorliegenden experimentellen Vorbereitungen speziell auf die Maus retinalen Arteriolen beziehen werden, kann diese Methode leicht zu mikrogefäßen von Ratten eingesetzt werden.

U-46619 produziert Konzentration abhängig Vasokonstriktor Antworten in retinalen Arteriolen von Wildtyp Mäusen C57Bl/6J Hintergrund. Bei einer Konzentration von 10-6 M war die Reduktion der luminalen Durchmesser ≈50 % aus ruhenden Durchmesser. Abbildung 9A zeigt eine repräsentative Konzentration-Wirkungs-Kurve von einem retinalen arteriola. In Arteriolen mit U46619 preconstricted evozierte kumulative Gabe von Acetylcholin Konzentration abhäng...

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Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Viele Vision-bedrohlichen okuläre Erkrankungen gehen einher mit dysfunktionalen retinalen mikrogefäßen. Daher ist die Messung der retinalen arteriola Antworten wichtig, die zugrunde liegenden pathophysiologischen Mechanismen zu untersuchen. Dieser Artikel beschreibt ein detailliertes Protokoll für Maus retinalen arteriola Isolation und Vorbereitung zur Bewertung der Auswirkungen von vasoaktive Substanzen auf vaskuläre Durchmesser.

Vorbereitende Schritte für die Messung der Reaktivität in Maus retinalen Arteriolen Ex Vivo

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

7.1K Aufrufe.  University Medical Center of the Johannes Gutenberg University Mainz. Viele Vision-bedrohlichen okuläre Erkrankungen gehen einher mit dysfunktionalen retinalen mikrogefäßen. Daher ist die Messung der retinalen arteriola Antworten wichtig, die zugrunde liegenden pathophysiologischen Mechanismen zu untersuchen. Dieser Artikel beschreibt ein detailliertes Protokoll für Maus retinalen arteriola Isolation und Vorbereitung zur Bewertung der Auswirkungen von vasoaktive Substanzen auf vaskuläre Durchmesser.

Serie: Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes (ILM), and in conjunction with astrocytes, pericytes and endothelial cells they establish the blood-retinal barrier (BRB). BRB limits material transport between the bloodstream and the retina while the ILM acts as a basement membrane that defines histologically the border between the retina and the vitreous cavity. Labeling M&#252;ller cells is particularly relevant to study the physical state of the retinal barriers, as these cells are an integral part of the BRB and ILM. Both BRB and ILM are frequently altered in retinal disease and are responsible for disease symptoms.
There are several well-established methods to study the integrity of the BRB, such as the Evans blue assay or fluorescein angiography. However these methods do not provide information on the extent of BRB permeability to larger molecules, in nanometer range. Furthermore, they do not provide information on the state of other retinal barriers such as the ILM. To study BRB permeability alongside retinal ILM, we used an AAV based method that provides information on permeability of BRB to larger molecules while indicating the state of the ILM and extracellular matrix proteins in disease states. Two AAV variants are useful for such study: AAV5 and ShH10. AAV5&#160;has a natural tropism for photoreceptors but it cannot get across to the outer retina when administered into the vitreous when the ILM is intact (i.e., in wild-type retinas). ShH10 has a strong tropism towards glial cells and will selectively label M&#252;ller glia in both healthy and diseased retinas. ShH10 provides more efficient gene delivery in retinas where ILM is compromised. These viral tools coupled with immunohistochemistry and blood-DNA analysis shed light onto the state of retinal barriers in disease.

To investigate the blood-retinal barrier permeability and the inner limiting membrane integrity in animal models of retinal disease, we used several adeno-associated virus (AAV) variants as tools to label retinal neurons and glia. Virus mediated reporter gene expression is then used as an indicator of retinal barrier permeability.

Verwendung Adeno-assoziierte Virus als Werkzeug Retinal Barrieren in Disease Study

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

Forschung

Medizin

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An inflammatory factor, histamine, is demonstrated to compromise vessel integrity in the cultured retina through positive staining of IgG outside of the blood vessels. The effects of histamine itself and those of candidate drugs for potential treatments, such as lipoxin A4, are assessed using three parameters: blood vessel leakage via IgG immunostaining, activation of M&#252;ller cells via GFAP staining and change in neuronal dendrites through staining for MAP2. Furthermore, the layered organization of the retina allows a detailed analysis of the processes of M&#252;ller and ganglion cells, such as changes in width and continuity. While the data presented is with swine retinal culture, the system is applicable to multiple species. Thus, the model provides a reliable tool to investigate the early effects of compromised retinal vessel integrity on different cell types and also to evaluate potential drug candidates for treatment.

A low-cost, easy-to-use and powerful system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach induced by histamine. Blood vessel leakage, M&#252;ller cell activation and the continuity of neuronal processes are utilized to assess the damage response and its reversal with a potential drug, lipoxin A4.

Eine akute Retinal Modell zur Bewertung von Blut Retinal Barrier Breach und potenzielle Medikamente für die Behandlung

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples

Mitochondrial respiration is a critical energy-generating pathway in all cells, especially retinal photoreceptors that possess a highly active metabolism. In addition, photoreceptors also exhibit high aerobic glycolysis like cancer cells. Precise measurements of these metabolic activities can provide valuable insights into cellular homeostasis under physiological conditions and in disease states. High throughput microplate-based assays have been developed to measure mitochondrial respiration and various metabolic activities in live cells. However, a vast majority of these are developed for cultured cells and have not been optimized for intact tissue samples and for application ex vivo. Described here is a detailed step-by-step protocol, using microplate-based fluorescence technology, to directly measure oxygen consumption rate (OCR) as an indicator of mitochondrial respiration, as well as extracellular acidification rate (ECAR) as an indicator of glycolysis, in intact ex vivo retinal tissue. This method has been used to successfully assess metabolic activities in adult mouse retina and demonstrate its application in investigating cellular mechanisms of aging and disease.

Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples

Described here is a detailed protocol for performing mitochondrial stress assay and glycolytic rate assay in ex vivo retinal tissue samples using a commercial bioanalyzer.

Bestimmung der mitochondrialen Atmung und Glykolyse in Ex-vivo-Netzhautgewebeproben

Mitochondrial respiration is a critical energy-generating pathway in all cells, especially retinal photoreceptors that possess a highly active metabolism. ...

Neurowissenschaften

Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR model induction and its readouts in both mice and rats. Retinal neovascularization is induced in OIR by exposing rodent pups either to hyperoxia (mice) or alternating levels of hyperoxia and hypoxia (rats). The primary readouts of these models are the size of neovascular (NV) and avascular (AVA) areas in the retina. This preclinical in vivo model can be used to evaluate the efficacy of potential anti-angiogenic drugs or to address the role of specific genes in the retinal angiogenesis by using genetically manipulated animals. The model has some strain and vendor specific variation in the OIR induction which should be taken into consideration when designing the experiments.

Oxygen-induced retinopathy (OIR) can be used to model ischemic retinal diseases such as retinopathy of prematurity and proliferative diabetic retinopathy and to serve as a model for proof-of-concept studies in evaluating antiangiogenic drugs for neovascular diseases. OIR induces robust and reproducible neovascularization in the retina that can be quantified.

Sauerstoffinduzierte Retinopathie-Modell für ischämische Netzhauterkrankungen bei Nagetieren

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR ...

Quantification of Vascular Parameters in Whole Mount Retinas of Mice with Non-Proliferative and Proliferative Retinopathies

Retinopathies are a heterogeneous group of diseases that affect the neurosensory tissue of the eye. They are characterized by neurodegeneration, gliosis&#160;and a progressive change in vascular function and structure. Although the onset of the retinopathies is characterized by subtle disturbances in visual perception, the modifications in the vascular plexus are the first signs detected by clinicians. The absence or presence of neovascularization determines whether the retinopathy is classified as either non-proliferative (NPDR) or proliferative (PDR). In this sense, several animal models tried to mimic specific vascular features of each stage to determine the underlying mechanisms involved in endothelium alterations, neuronal death and other events taking place in the retina. In this article, we will provide a complete description of the procedures required for the measurement of retinal vascular parameters in adults and early birth mice at postnatal day (P)17. We will detail the protocols to carry out retinal vascular staining with Isolectin GSA-IB4 in whole mounts for later microscopic visualization. Key steps for image processing with Image J Fiji software are also provided, therefore, the readers will be able to measure vessel density, diameter and tortuosity, vascular branching, as well as avascular and neovascular areas. These tools are highly helpful to evaluate and quantify vascular alterations in both non-proliferative and proliferative retinopathies.

This article describes a well-established and reproducible lectin stain assay for the whole mount retinal preparations and the protocols required for the quantitative measurement of vascular parameters frequently altered in proliferative and non-proliferative retinopathies.

Quantifizierung vaskulärer Parameter in der gesamten Netzhaut von Mäusen mit nicht-proliferativen und proliferativen Retinopathien

Retinopathies are a heterogeneous group of diseases that affect the neurosensory tissue of the eye. They are characterized by neurodegeneration, ...

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To properly leverage this greater translatability, there is a need to devise reproducible methods of drawing quantitative data from these images. Optical coherence tomography (OCT) imaging can resolve retinal histology at micrometer resolution and reveal functional differences in vascular blood flow. Here, we delineate noninvasive vascular readouts that we use to characterize pathological damage post vascular insult in an optimized mouse model of retinal vein occlusion (RVO). These readouts include live imaging analysis of retinal morphology, disorganization of retinal inner layers (DRIL) measure of capillary ischemia, and fluorescein angiography measures of retinal edema and vascular density. These techniques correspond directly to those used to examine patients with retinal disease in the clinic. Standardizing these methods enables direct and reproducible comparison of animal models with clinical phenotypes of ophthalmic disease, increasing the translational power of vascular injury models.

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Here, we present three data analysis protocols for fluorescein angiography (FA) and optical coherence tomography (OCT) images in the study of Retinal Vein Occlusion (RVO).

Im lebenden Organismus Gefäßverletzungsanzeigen in der Netzhaut der Maus zur Förderung der Reproduzierbarkeit

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To ...

Measuring Retinal Vessel Diameter from Mouse Fluorescent Angiography Images

It is important to study the development of retinal vasculature in retinopathies in which abnormal vessel growth can ultimately lead to vision loss. Mutations in the microphthalmia-associated transcription factor (Mitf) gene show hypopigmentation, microphthalmia, retinal degeneration, and in some cases, blindness. In vivo imaging of the mouse retina by noninvasive means is vital for eye research. However, given its small size, mouse fundus imaging is difficult and might require specialized tools, maintenance, and training. In this study, we have developed a unique software enabling analysis of the retinal vessel diameter in mice with an automated program written in MATLAB. Fundus photographs were obtained with a commercial fundus camera system following an intraperitoneal injection of a fluorescein salt solution. Images were altered to enhance contrast, and the MATLAB program permitted extracting the mean vascular diameter automatically at a predefined distance from the optic disk. The vascular changes were examined in wild-type mice and mice with various mutations in the Mitf gene by analyzing the retinal vessel diameter. The custom-written MATLAB program developed here is practical, easy to use, and allows researchers to analyze the mean diameter and mean total diameter, as well as the number of vessels from the mouse retinal vasculature, conveniently and reliably.

Mouse retinal vasculature is particularly interesting in understanding the mechanisms of vascular pattern formation. This protocol automatically measures the diameter of mouse retinal vessels from fluorescent angiography fundus images at a fixed distance from the optic disk.

Messung des retinalen Gefäßdurchmessers aus Fluoreszenzangiographie-Bildern der Maus

It is important to study the development of retinal vasculature in retinopathies in which abnormal vessel growth can ultimately lead to vision loss. ...

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

The retina is a highly metabolically active tissue that requires a substantial blood supply. The retinal circulation supports the inner retina, while the choroidal vessels supply the photoreceptors. Alterations in retinal perfusion contribute to numerous sight-threatening disorders, including diabetic retinopathy, glaucoma and retinal branch vein occlusions. Understanding the molecular mechanisms involved in the control of blood flow through the retina and how these are altered during ocular disease could lead to the identification of new targets for the treatment of these conditions. Retinal arterioles are the main resistance vessels of the retina, and consequently, play a key role in regulating retinal hemodynamics through changes in luminal diameter. In recent years, we have developed methods for isolating arterioles from the rat retina which are suitable for a wide range of applications including cell physiology studies. This preparation has already begun to yield new insights into how blood flow is controlled in the retina and has allowed us to identify some of the key changes that occur during ocular disease. In this article, we describe methods for the isolation of rat retinal arterioles and include protocols for their use in patch-clamp electrophysiology, calcium imaging and pressure myography studies. These vessels are also amenable for use in PCR-, western blotting- and immunohistochemistry-based studies.

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

This manuscript describes a straightforward protocol for the isolation of arterioles from the rat retina that can be used in electrophysiological, calcium imaging and pressure myography studies.

Isolierung der retinalen Arteriolen für Ex Vivo Zelle Physiologie Studien

The retina is a highly metabolically active tissue that requires a substantial blood supply. The retinal circulation supports the inner retina, while the ...

Biologie

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while maintaining transparency of the visual axis. Perturbations to this delicate balance cause blinding illnesses, such as diabetic retinopathy. Therefore, the understanding of energy metabolism changes in the retina during disease is imperative to the development of rational therapies for various causes of vison loss. The recent advent of commercially-available extracellular flux analyzers has made the study of retinal energy metabolism more accessible. This protocol describes the use of such an analyzer to measure contributions to retinal energy supply through its two principle arms - oxidative phosphorylation and glycolysis - by quantifying changes in oxygen consumption rates (OCR) and extracellular acidification rates (ECAR) as proxies for these pathways. This technique is readily performed in explanted retinal tissue, facilitating assessment of responses to multiple pharmacologic agents in a single experiment. Metabolic signatures in retinas from animals lacking rod photoreceptor signaling are compared to wild-type controls using this method. A major limitation in this technique is the lack of ability to discriminate between light-adapted and dark-adapted energy utilization, an important physiologic consideration in retinal tissue.

This technique describes real time recording of oxygen consumption and extracellular acidification rates in explanted mouse retinal tissues using an extracellular flux analyzer.

Messung des Energiestoffwechsels in explantierten Netzhautgewebe extrazelluläre Flux-Analyse

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Monitoring Dynamic Growth of Retinal Vessels in Oxygen-Induced Retinopathy Mouse Model

Oxygen-induced retinopathy (OIR) is widely used to study abnormal vessel growth in ischemic retinal diseases, including retinopathy of prematurity (ROP), proliferative diabetic retinopathy (PDR), and retinal vein occlusion (RVO). Most OIR studies observe retinal neovascularization at specific time points; however, the dynamic vessel growth in live mice along a time course, which is essential for understanding the OIR-related vessel diseases, has been understudied. Here, we describe a step-by-step protocol for the induction of the OIR mouse model, highlighting the potential pitfalls, and providing an improved method to quickly quantify areas of vaso-obliteration (VO) and neovascularization (NV) using immunofluorescence staining. More importantly, we monitored vessel regrowth in live mice from P15 to P25 by performing fluorescein fundus angiography (FFA) in the OIR mouse model. The application of FFA to the OIR mouse model allows us to observe the remodeling process during vessel regrowth.

This protocol describes a detailed method for the preparation and immunofluorescence staining of mice retinal flat mounts and analysis. The use of fluorescein fundus angiography (FFA) for mice pups and image processing are described in detail as well.

Überwachung des dynamischen Wachstums von Netzhautgefäßen im sauerstoffinduzierten Retinopathie-Mausmodell

Oxygen-induced retinopathy (OIR) is widely used to study abnormal vessel growth in ischemic retinal diseases, including retinopathy of prematurity (ROP), ...