Ziel dieses Verfahrens ist es, Orientierungshilfen für die Herstellung, Kristallisation und strukturelle Bestimmung des menschlichen IKK1-alpha zu geben, um die mechanistische Grundlage seiner Signalfunktion zu verstehen und Plattformen für rationales Arzneimitteldesign zu schaffen. Diese Methode sollte Forschern helfen, die Struktur von IKK1 zu bestimmen, die Antworten auf wichtige Fragen im Bereich der Immunsignalisierung liefern würde. Diese Technik beschreibt einen schlanken Weg zur Gewinnung von Kristallen von IKK-Proteinen, die eher feuerfest zur Kristallisation sind, und um verschiedene kritische Informationen zur Überwindung von Engpässen bei der Bestimmung der Strukturen zu liefern.
Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, weil die Erzeugung von Milligramm Mengen an löslichem, wohlerzogenem Protein seine Expression in Insektenzellen erfordert und die Kristallisation nur unter einem sehr engen Fenster von Bedingungen erfolgen kann. Das molekulare Ersatzverfahren, das bei der Bestimmung der Struktur von IKK1 verwendet wird, kann auch sehr schwierig sein, insbesondere aufgrund der schlechten Ablenkeigenschaften der Kristalle, nicht an der Stelle der asymmetrischen Einheit, die viele IKK1-Moleküle enthält, wenn keine geeigneten Suchmodelle vorhanden sind. Die Verfahren werden Kyle Shumate und Sonjiala Hotchkiss, Studenten aus meinem Labor, demonstrieren.
Am ersten Tag, Platte Sf9 Zellen in zwei Milliliter Sf903 Insektenzellmedium, in jedem Brunnen einer Sechs-Brunnen-Platte und inkubieren bei 27 Grad Celsius. Durchdurchfahrt der Zellen, wenn sie eine Dichte von zwei bis drei mal 10 zu den sechs Zellen pro Milliliter in Suspension erreichen, indem sie sie zu frischen Medien verdünnen, mit einer Dichte von etwa sechs mal 10 bis fünf. Am zweiten Tag acht Mikroliter Sf9-Transfektionsreagenz in 100 Mikroliter SF-903 oder Grace es Insect Medium verdünnen.
Dann wirbeln Sie die Mischung kurz. In einem separaten Rohr ein Mikrogramm kitgereinigtes rekombinantes Bakmid in 100 Mikroliter desselben Mediums verdünnen. Kombinieren Sie die verdünnte DNA und das Transfektionsreagenz.
Nach der Inkubation bei Raumtemperatur für 15 bis 30 Minuten, entfernen Sie das Medium aus dem Brunnen. Dann fügen Sie einen Milliliter frisches Medium hinzu. Als nächstes fügen Sie das verdünnte DNA-Transfektionsreagenz-Gemisch tropfenweise auf die Zellen ein, um die Tropfengröße so anzupassen, dass sie anhaftende Zellen nicht verdrängt.
Nach sechs Stunden 1,5 Milliliter frisches Medium auf die Zellen geben. Inkubieren Sie die Zellen bei 27 Grad Celsius und überprüfen Sie die Brunnen regelmäßig alle 12 Stunden auf Anzeichen einer Virusinfektion. Am fünften Tag, entfernen Sie das Medium enthaltende Zellen, 60 bis 72 Stunden nach der Infektion.
Nach der Übertragung des Mediums in Rohre zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 500 mal g und vier Grad Celsius. Speichern Sie nach Fertigstellung den Überstand, der der P1-Virusstapel ist. Am ersten Tag wird das zuvor vorbereitete His-IKK1-Zellpellet in 40 MilliliterLysepuffer wieder ausgesetzt.
Legen Sie die Zellsuspension auf Eis und lysedien die Zellen durch Beschallung bei 60% bis 70%Zollzyklen und fünf bis zehn Impulsen mit 30-Sekunden-Dauer in einem Intervall von mehr als einer Minute. Klären Sie das Lysat durch Zentrifugation bei mehr als oder gleich 28 000 g für 45 Minuten bei vier Grad Celsius. Nach der Herstellung eines Nickel-NTA Agarose-Harzes, gemäß dem Textprotokoll, elute das His-tagged IKK1 Alpha-Protein unter Schwerkraftfluss mit 20 Milliliter Elutionspuffer.
Sammeln Sie ein bis 1,5 Milliliter Fraktionen. Nach der Kombination der Fraktionen, die das Protein enthalten, verdauen Sie die Probe mit TEV-Protease über Nacht bei vier Grad Celsius. Am Morgen des zweiten Tages das Protein mit einem Millimolar ATP in Gegenwart von Magnesiumchlorid, Beta-Glycerophosphat, Natriumfluorid und Natriumorthovanadate für eine Stunde bei 27 Grad Celsius inkubieren.
Filtern Sie die Proteinlösung nach der Inkubation durch einen 0,45-Mikron-Filter. Dann laden Sie etwa sechs Milliliter der Probe auf eine 120 Milliliter präparative Größenausschlusssäule, die an ein automatisiertes Flüssigkeitschromatographiesystem angeschlossen ist. Führen Sie nach dem Ausgleich die Größenausschlusschromatographie mit einer Durchflussrate von einem Milliliter pro Minute aus und sammeln Sie Zwei-Milliliter-Fraktionen.
Während des Laufs die Elution bei 280 und 254 Nanometern überwachen. Nach dem Ziehen der reinen Fraktionen konzentrieren Sie sich in einem 30-Kilodalton, Molekulargewicht cut-off Zentrifugalkonzentrator, nach den Anweisungen des Herstellers. Dann 25-Mikroliter-Aliquots des konzentrierten Proteins abgeben und in flüssigem Stickstoff einfrieren.
Mit einem Roboter, Pipette 80 bis 100 Mikroliter eines Kristallisationsreagenz in das Reservoir einer 96-Well-Platte. Mit einem Kristallisationsroboter 0,2 bis 0,25 Mikroliter IKK1 und dessen Inhibitorkomplex mit dem gleichen Volumen an Reservoirlösung dosieren und mischen. Unmittelbar nach dem Einstellen der Tropfen jede Platte mit optisch klaren Folien versiegeln, um Verdunstung zu vermeiden.
Eine Platte bei 18 Grad Celsius und die andere Platte bei vier Grad Celsius in einem kalten Raum bebrüten. Verwenden Sie ein Stereomikroskop mit einem Polarisator, um das Aussehen von Kristall in jedem Tropfen zu überprüfen, jeden Tag, für die ersten sieben Tage und dann in längeren Intervallen. Nach der Vorbereitung von IKK1 und seinem Inhibitorkomplex, wie zuvor beschrieben, übertragen Sie die Brunnenlösungen auf jeden Brunnen einer 24-Well-Platte.
Legen Sie ein bis 1,5 Mikroliter Brunnenlösung auf einen sauberen Glasdeckel. Fügen Sie dem Glasabdeckungsrutsch ein gleiches Volumen von IKK1 und seinem Inhibitorkomplex hinzu und mischen Sie es vorsichtig, indem Sie drei- bis viermal nach oben und unten pfeifen. Nach dem Auftragen von Fett auf die Ringe jedes Brunnens der Platte, drehen Sie die Glasabdeckung über und legen Sie auf dem jeweiligen Brunnen mit Zangen.
Dann versiegeln Sie den Brunnen, indem Sie auf den Glasdeckel drücken. Nach dem Aufstellen aller Tropfen in der 24-Well-Platte, inkubieren in der kalten Raum, im Dunkeln. Überprüfen Sie gelegentlich die Tropfen unter dem Mikroskop auf Aussehen und Wachstum von Kristallen.
Sobald das Kristallwachstum abgeschlossen ist, entfernen Sie vorsichtig den Glasdeckel, der den Kristall enthält, und legen Sie ihn auf eine feste Oberfläche mit dem Kristalltropfen nach oben. Fügen Sie vorsichtig 10 Mikroliter Kryo Eine Lösung auf dem Tropfen und sanft durch Pipettieren mischen, so dass der Kristall nicht berührt wird. Mit einem Mikroskop, langsam entfernen Sie etwas Flüssigkeit aus dem Kristall und halten Sie etwa fünf bis acht Mikroliter der Lösung.
2,5 bis vier Mikroliter Kryo-B-Lösung vorsichtig auf den Tropfen geben und vorsichtig durch Pipetieren mischen. Bedecken Sie den Glasdeckel mit einer kleinen Petrie-Schale, um einen direkten Luftstrom über den Kristall zu vermeiden. Nach fünf Minuten Wartezeit, wählen Sie vorsichtig einen einzelnen Kristall aus dem Tropfen in einem entsprechenden Kryoloop auf einer richtigen Basis montiert.
Flash-Freeze den Kristall in flüssigem Stickstoff. Dann lagern Sie den Kristall mit Kryoloop in einem Puck in flüssigen Stickstoff in einem Dewar-Kolben eingetaucht, bis sie für die Röntgenbeugung am Synchrotron bereit sind. Nach umfangreichen Versuchen mit mehreren verschiedenen IKK1-Varianten wurden Kristalle mit einem abgeschnittenen Konstrukt gewonnen, das nur in Gegenwart des IKK-Inhibitors XII geeignete Röntgeneigenschaften aufwies.
Die kombinierte Wirkung von Röntgendaten mit niedriger Auflösung mit schwachen Intensitäten, einer großen Anzahl von IKK1-Molekülen in der asymmetrischen Einheit und konformationalen Variationen des monomeric-dimerischen IKK1-Modells im Vergleich zu bekannten IKK2-Modellen erschwerte es, eine molekulare Ersatzlösung, IKK1, zu erhalten und ihre Struktur zu bestimmen. Verschiedene IKK2-Strukturen zeigten eine unterschiedliche intermonomere Ausrichtung innerhalb ihrer Dimere an, so dass der Abstand zwischen den Alpha-Kohlenstoffen von P578 in den beiden Kinase-Domänen in vier verschiedenen Dimer-Modellen zwischen 39 und 61 Angstroms variierte. Die Beschaffung eines nützlichen Suchmodells war aufgrund der low-resolution cryoelectron microscopy map und eines hochpräzisen Modells von IKK1-Domänen möglich, die auf der Grundlage einer hochauflösenden IKK2-Struktur generiert werden konnten.
Das ursprüngliche Modell zeigte eine Ausrichtung der Kinase-Domäne um 24 Grad relativ zu der eines IKK2-Monomers und einer N-Terminalöffnung von 58 Angstroms. Anhand eines der Dimer mit der 52-Angstrom-Öffnung als Modell wurden sechs Dimere in der asymmetrischen Einheit lokalisiert. Einmal gemeistert, kann diese Technik in ein paar Monaten ausgeführt werden, wenn sie ordnungsgemäß ausgeführt wird.
Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Erlangung eines löslichen, aktiven und gut erzogenen Proteins der erste kritische Schritt ist. Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein gutes allgemeines Verständnis aller Schritte haben, die in sorgfältiger Detailgenauigkeit befolgt werden müssen, um erfolgreich die Struktur des IKK1-Proteins zu kristallisieren und zu bestimmen. Wenn man dieses Verfahren lernt, gibt es immer noch Strukturen anderer Proteine der IKK-Familie, die auch bestimmt werden können, um zusätzliche Fragen zur Kinase-Mitogen-Signalisierung zu beantworten.
