Name: protective efficacy and pulmonary immune response following subcutaneous and intranasal bcg administration in mice
Uploaded: 2016-09-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protective Efficacy and Pulmonary Immune Response Following Subcutaneous and Intranasal BCG Administration in Mice at JoVE.com

This work was supported by "Spanish Ministry of Economy and Competitiveness" [grant number BIO2014-5258P], "European Commission" by the H2020 programs [grant numbers TBVAC2020 643381].

Alle Mäuse wurden unter kontrollierten Bedingungen gehalten und auf Anzeichen von Krankheit beobachtet. Experimentelle Arbeiten wurde in Übereinstimmung mit den europäischen und nationalen Richtlinien für den Schutz von Versuchstieren und mit der Zustimmung der zuständigen lokalen Ethikausschüsse durchgeführt. 1. Herstellung von Quantifizierte Glycerol Stocks von BCG dänischen und Mycobacterium tuberculosis H37Rv HINWEIS: Alle beschriebenen Protokolle wurden unter BSL3 Bedingungen durchgeführt. <ol><li> Auftau gefrorenen Glycerinstammkulturen von BCG Danish oder H37Rv Stämme und 100 &amp; mgr; l in 10 ml 7H9 - Medium 10 mit Tween-80 0,05% (v / v) und ADC (Albumin, Dextrose, Catalase) 10% (v / v) ergänzt inokulieren. </li><li> Inkubiere unter statischen Bedingungen für eine Woche bei 37 ° C, bis die Kultur in log-Phasenwachstum ist. </li><li> Scale-up Bakterienkultur durch die Übertragung der 10-ml-Kultur zu 200 ml frischem Medium. Inkubieren für 20 weitereTagen unter statischen Bedingungen. </li><li> Transfer in 50-ml-Zentrifugenröhrchen und zentrifugiere für 15 Minuten bei 2500 x g. </li><li> Entsorgen Sie Stände und Bakterienpellet im Restvolumen resuspendieren. In jedes Röhrchen sterile 3 mm Durchmesser Glasperlen (10 bis 15 pro Röhrchen). </li><li> Vortex kräftig während 1 min, um Bakterienklumpen zu distanzieren. Resuspendieren jedes Pellet in 10 ml PBS mit Tween-80 0,05% (v / v). </li><li> Lassen Sie Rohre für 10 Minuten erlaubt die größten Bakterien Aggregate und Glasperlen zu beruhigen. </li><li> Recover 9,5 ml Überstand aus jeder der vier Röhrchen, die kleine Klumpen und einzelne Bakterien und Transfervolumina zu einem einzigen frischen 50-ml-Zentrifugenröhrchen (endgültige gewonnen Volumen 38 ml). Zentrifuge für 10 min bei 400 x g. </li><li> Recover 35 ml Überstand (die hauptsächlich einzelne Bakterien) in einem einzigen frischen 50-ml-Zentrifugenröhrchen und 15 ml PBS mit Glycerin 50% (v / v), eine endgültige Glycerinkonzentration von 15% zu erhalten (v / v). </li><li> vorsichtig mischenund zum Einfrieren in 1-ml-Teilmengen in entsprechenden Röhrchen verteilen. Bei -80 ° C (ein Los liefert etwa 50 Aliquots Glycerolstammlösung). </li><li> Um Glycerin-Stamm quantifizieren, tauen Sie den Tag mit einem Glycerin nach dem Einfrieren und führen sieben zehnfache serielle Verdünnungen in separaten 1,5-ml-Röhrchen, die 900 &amp; mgr; l PBS. </li><li> Platte 100 &amp; mgr; l jeder Verdünnung in 7H10 Fest Agarmedium , ergänzt mit 10 ADC 10% (v / v) hergestellt , in 55-mm - Durchmesser - Petrischalen. </li><li> Vorsichtig 3 mm Durchmesser Glasperlen (ca.. 10 pro Platte) und sanft Platte schütteln, um gleichermaßen Volumen über Agar-Platte verteilen. Entsorgen Sie Perlen und versiegeln Agar-Platte mit Parafilm. </li><li> bei 37 ° C für 21 Tage inkubieren und koloniebildende Einheiten (CFU) in den Verdünnungen in denen Einzelkolonien genau unterschieden werden können durch Zählen von Bakterienkonzentration zu bestimmen. </li></ol> 2. Maus Impfung <ol><li> Tauen Sie eine vorher quantifiziert BCG Glycerin und verdünnen Sie es in PBS zu prepzwei Suspensionen. Endvolumen Berechnen Sie die Dosis pro Tier unter Berücksichtigung von 100 &amp; mgr; l für die subkutane Verabreichung (10 7 KBE pro ml für die subkutane Impfung) und 40 &amp; mgr; l für die intranasale Verabreichung (2,5 x 10 7 CFU für die intranasale Impfung). </li><li> Verwenden Sie eine spezielle Anästhesiearbeitsplatz für Nager mit einer Mischung von Isofluran und Sauerstoff Mäuse zu betäuben. Verwenden Isofluran 5% Anästhesie zu induzieren und 2% der Mäuse in der Anästhesiekammer aufrechtzuerhalten. (Andere akzeptierte Anästhesie Methode kann verwendet werden). </li><li> Zur subkutanen Verabreichung des Impfstoffes füllen eine 1-ml - Spritze mit einer 26 G - Nadel mit 1 ml Bakteriensuspension (10 7 KBE / ml). Luftblasen entfernen. </li><li> Legen Sie eine narkotisierten Maus auf einer ebenen Fläche in Bauchlage in einer Laminar - Flow - Haube und impfen subkutan 100 &amp; mgr; l (10 6 CFU / Dosis) des Impfstoffes in einer Flanke der Maus zurück. Bringen Sie die Maus an den Käfig und zu überwachen, um sicherzustellen, dass es Properly erholt sich von der Narkose. </li><li> Ändern Sie die Spritzennadel zwischen jeder Maus Verwaltung. Luftblasen entfernt, wie oben beschrieben. </li><li> Für die intranasale Verabreichung, im Inneren der Kapuze eine narkotisierten Maus in Rückenlage legen. </li><li> Mit einer Mikropipette nehmen 20 ul der Suspension mit 2,5 x 10 7 CFU / ml. Legen Sie das Inokulum Drop-by-Drop zwischen den beiden Nüstern, bis das gesamte Volumen abgeschieden wurde, so dass Zeit zwischen Tropfen der Maus atmen die Lautstärke in zu ermöglichen. Hinweis: Mäuse, die von Atemnot während dieses Verfahrens leiden können, so sollten sie bleiben assimilieren jeden Tropfen, bevor der nächste administrieren es so weit wie möglich zu verhindern. </li><li> Nachfüllung der Mikropipette mit einem weiteren 20 ul und den Vorgang wiederholen. Wenn die Maus aus der Narkose nach der ersten Impfung aufzuwachen beginnt, legen Sie sie in der Anästhesie Kammer vor dem zweiten. Bringen Sie die Maus an den Käfig und sicherzustellen, dass es richtig erholtaus der Narkose. </li></ol> 3. Maus intranasale Herausforderung mit Stamm H37Rv <ol><li> Tauen Sie eine vorher quantifiziert H37Rv Glycerin und verdünnen Sie es in PBS eine bakterielle Suspension von 2500 KBE pro ml herzustellen. Endvolumen Berechnen Sie die Dosis pro Tier unter Berücksichtigung beträgt 40 ul. </li><li> H37Rv intranasal geimpft wie in 2.5 beschrieben - 2.7. Endgültige Herausforderung Dosis pro Maus ist 10 2 CFU / 40 &amp; mgr; l. </li></ol> 4. Analyse der induzierten Immunantwort in Lungs <ol><li> Lung Zellsuspension HINWEIS: Beurteilung der Impfstoff-induzierte adaptive Immunantwort in der Lunge erfordert die Erzeugung von Einzelzellsuspension. Zu diesem Zweck verwenden wir ein Gewebe Dissociator wie gentleMACS. <ol><li> Opfere die Maus durch Genickbruch (oder andere anerkannte humane Methode) und gewährleisten Maus tot ist, den Augapfel zu berühren abwesend von Lidschlussreflexes zu bestätigen. </li><li> Innerhalb einer Laminar-Flow-Haube, extrahieren Sie die lungs mit einer sterilen Schere und Pinzette und legen Sie sie auf eine saubere Oberfläche. Saubere Lungen Trachea und Bindegewebe zu entfernen, und übertragen Sie die Lungen in ein 1,5-ml-Röhrchen mit PBS (halten auf Eis bis zur Verarbeitung). </li><li> Zu erzeugen , eine Zellsuspension, legen Lungen in einem geeigneten Schlauch für organ Dissoziation (C-Dissociator Rohr) , das 5 ml 10 mM HEPES-NaOH pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2 und 1,8 mM CaCl 2 Puffer. </li><li> Füge 100 &amp; mgr; l Kollagenase D 100 mg / ml (2 mg / ml Endkonzentration) und 40 &amp; mgr; l DNAse I 20.000 IU / ml (160 IU / ml Endkonzentration. HINWEIS: Stammlösungen von Kollagenase D oder DNaseI werden hergestellt , lyophilisiert Auflösen Enzyme in PBS oder Glycerol 50% (v / v), 20 mM Tris-HCl , pH 7,5 , y MgCl 2 1 mM, respectively. </li><li> Das Röhrchen wird in das Gewebe Dissociator und nutzen Sie das vordefinierte Programm m_lung_01 für Lungen Fragmentierung. Inkubieren der Röhrchen bei 37 ° C in einem Wasserbad für 30 min. </li><li> Platz the Rohr im Dissociator und nutzen Sie das vordefinierte Programm m_lung_02 für die komplette Lunge Homogenisierung in einzelne Zellsuspension. </li><li> Übergeben Sie die Zellsuspension durch ein 70 &amp; mgr; m Sieb Nylon Zelle mit einem Schlauch 50-ml-Zentrifugen ausgestattet. Waschen Sie das Sieb mit 10 ml RPMI 1640-Medium. </li><li> Centrifuge Zellen für 5 Minuten bei 400 · g und Überstand verwerfen. </li><li> 1 ml der Erythrozyten Lysepuffer, mischen durch Vortexen und Inkubation für 1 min bei Raumtemperatur. </li><li> 10 ml RPMI 1640-Medium und zentrifugieren Zellen für 5 Minuten bei 400 x g. </li><li> Die Zellen in 0,5 ml komplettem Medium RPMI 1640 mit 10% hitzeinaktiviertem fötalen Kälberserum (FCS) supplementiert, 2 mM L-Glutamin, 100 ug / ml Streptomycin, 100 IU / ml Penicillin und 50 &amp; mgr; M 2-Mercaptoethanol. HINWEIS: FCS durch Inkubation für 30 Minuten bei 56 ° C inaktiviert wird. </li><li> Zählen von Zellen und fügen vollständigen RPMI 1640 - Medium bis zur endgültigen Zelldichte von 10 7 Zellen / ml erreichen. HINWEIS: Für die Zellzahl, verwenden wir die automatische Zellzähler. </li><li> Verteilen von 100 &amp; mgr; l Zellsuspension in U-Boden - 96-Well - sterile Platte (10 6 Zellen / Vertiefung). </li><li> Werden 50 &amp; mgr; l / Vertiefung vollständigem RPMI 1640-Medium mit 15 ug / ml kommerzieller H37Rv Purified Protein Derivative (PPD) (5 ug / ml Endkonzentration). </li></ol></li><li> Supernatant Sammlung für Zytokin Bestimmung durch ELISA <ol><li> Inkubieren Platte von 4.1.14 für 48 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Zentrifugenplatte für 5 Minuten bei 400 · g und erholen 100 ul Überstand. </li><li> Bei -80 ° C. </li><li> Verdünnen Stände 1/10 und 1/2 in Testpuffer für IFNy und IL17A Bestimmung sind. Bestimmen Sie Zytokin-Konzentrationen mit im Handel erhältlichen ELISA-Kits nach den Anweisungen des Herstellers (ELISA Development Kits). </li></ol></li><li> Intrazelluläre Färbung zur Bestimmung der Zytokin-produzierenden CD4 + Zellen mittels Durchflusszytometrie <ol><li> Inkubieren Platte von 4.1.14 für 18 h bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> In 1,5 ul Brefeldin A 1 mg / ml (Lager in DMSO gelöst) in jede Vertiefung (10 ug / ml Endkonzentration) und Inkubation für weitere sechs Stunden. </li><li> Zentrifugieren Sie die Platte aus 4.3.2 für 1 min bei 3200 xg und Überstand verwerfen. </li><li> Resuspendiere Zellen in 50 ul anti-Maus-CD4-FITC, verdünnt in RPMI 1640 mit 10% FCS (1/500) und bei 4 ° C für 10 min inkubieren. </li><li> Zentrifugieren Sie die Platte aus 4.3.4 für 1 min bei 3200 × g Überstand verwerfen und mit 100 ul / Vertiefung Fixierungslösung. für 20 min bei 4 ° C inkubieren. </li><li> Waschen Sie die Zellen zweimal mit 150 &amp; mgr; l / Wäsche von Permeabilisierung Lösung. HINWEIS: 10x konzentriert Lager wird in entionisiertem Wasser verdünnt, 1x Arbeitslösung herzustellen. </li><li> Resuspendiere Zellen in 50 ul anti-Maus IFN &amp; ggr;-APC und Anti-Maus-IL17A APC.Cy7 in permeabil verdünntisierung Lösung (1/250 beide Antikörper). </li><li> Inkubieren für 1 h bei RT. </li><li> Waschen Sie die Zellen zweimal mit 150 &amp; mgr; l / Wäsche von Permeabilisierung Lösung. </li><li> Die Zellen in 200 ul PBS für die Durchflusszytometrie Akquisition. </li></ol></li></ol> 5. Analyse von Immunglobulinen in Bronchiallavage (BAL) <ol><li> Gewinnung von BAL - Proben <ol><li> Opfere die Maus durch Genickbruch (oder andere anerkannte humane Methode) und gewährleisten Maus tot ist, den Augapfel zu berühren abwesend von Lidschlussreflexes zu bestätigen. </li><li> Setzen Sie die Luftröhre unter Verwendung geeigneter Präzision einer sterilen Pinzette und Schere, und führen Sie einen kleinen Schnitt in die Luftröhre, so dass sicher nicht vollständig auszuschneiden. Achten Sie darauf, nicht zu Blutungen führen, die BAL Probe verunreinigen könnten. </li><li> Einführung in die Trachea eine Kanüle mit einer sterilen 1-ml-Spritze mit 800 ul eiskaltem PBS. </li><li> Impfen langsam die PBS in die Lungen und dann rEcover BAL Volumen der Spritze des Kolbens sehr langsam, um Zurückziehen Lungenkollaps zu vermeiden. HINWEIS: Wiederherstellung von 500 bis 600 &amp; mgr; l zufriedenstellend ist. </li><li> Übertragen BAL Volumen in ein 1,5-ml-Röhrchen und bestätigen BAL ungefärbt bleibt, was darauf hinweist, dass nicht mit Blut (halten auf Eis, bis die Verarbeitung) verunreinigt ist. </li><li> Zentrifuge BAL-Proben für 5 min bei 400 xg und Überstand in ein neues Röhrchen. </li><li> Store Überstand bei -80 ° C. </li></ol></li><li> Bestimmung von IgA in BAL Stände HINWEIS: Alle verwendeten Reagenzien bei RT sind. <ol><li> Coat High-Protein - Bindung Polystyrol - Flachboden - 96-Well - Platten mit 100 ul PPD verdünnt in PBS (10 ug / ml) für M. tuberculosis spezifisches IgA Bestimmung oder mit 100 ul Überstand BAL 10 - mal in PBS verdünnt , für Gesamt - IgA Bestimmung. </li><li> Inkubieren über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Überstand verwerfen und tippen Sie auf die Platte auf einem Papiertuch zu dry. Waschen mit 200 ul / Vertiefung PBS. </li><li> Blockieren mit 200 ul / Vertiefung einer Rinderserumalbumin (BSA) 1% (w / v) in PBS-Tween-80 0,05% (v / v) (Blockierungspuffer). </li><li> Inkubiere 1 h bei RT. </li><li> Wasche einmal mit 200 ul / Vertiefung PBS-Tween-80 0,05% (v / v) (Waschpuffer). </li><li> 100 l unverdünntem BAL-Überstand in den PPD-beschichteten Vertiefungen. Inkubiere zwei Stunden bei Raumtemperatur. HINWEIS: Wenn die gesamte IgA Bestimmung in parallel mit der PPD-spezifischen IgA, Gesamt-IgA lassen Vertiefungen mit 100 ul Waschpuffer während dieser Inkubation erfolgt. </li><li> Waschen dreimal mit 200 ul / Vertiefung Wasch buffer.0170004 </li><li> Je 100 ul Meerrettich-Peroxidase (HRP) -konjugiertem IgA-anti-Maus verdünnt in Blockierungspuffer (1 / 10.000). </li><li> Inkubiere 1 h RT. </li><li> Waschen fünfmal mit 200 ul / Vertiefung Waschpuffer. </li><li> 100 l / Vertiefung von 3,3 &#39;, 5,5&#39;-Tetramethylbenzidin (TMB). Inkubiere 20 Minuten bei Raumtemperatur in ter dunkel. </li><li> 100 l / Vertiefung von H 2 SO 4 0,5 N. Lesen Sie die Platte in einem Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 450 nm. </li></ol></li></ol> 6. Bakterienbelastung Bestimmung in der Lunge <ol><li> Lung Homogenisierung und Galvanisieren <ol><li> Vier Wochen nach der Herausforderung, opfern, um die Maus durch Genickbruch (oder andere anerkannte humane Methode) und gewährleisten Maus tot ist, den Augapfel zu berühren abwesend von Lidschlussreflexes zu bestätigen. </li><li> Platzieren Sie die Maus in Rückenlage fixiert auf einer flachen und desinfizierten Oberfläche innerhalb einer Laminarströmungsabzug. </li><li> Einen Einschnitt und entfernen Sie die Haut von Brustbereich, um den Thoraxbereich sichtbar lassen. </li><li> Schneiden Sie die Rippen und ernten die Lungen und das Herz mit einer sterilen Schere und Pinzette. Legen Organe auf eine saubere Oberfläche. </li><li> Reinigen Sie die Lunge durch Entfernen des Herzens, der Trachea und Bindegewebe und übertragen Sie die Lungen in ein 1,5-ml-Röhrchen mit 1 ml VE-Wasser(Auf Eis halten, bis die Verarbeitung). </li><li> Verwenden einer sterilen Pinzette in die Lungen jeder Maus in eine richtige Rohr für Orgel Homogenisierung zu übertragen (M - Dissociator Rohr), 1 ml VE-Wasser enthält. </li><li> Das Röhrchen wird in das Gewebe Dissociator und nutzen Sie das vordefinierte Programm RNA_1, um die Lunge zu homogenisieren. </li><li> Stellen fünf zehnfache serielle Verdünnungen in 1,5-ml-Röhrchen mit 100 ul Lungenhomogenat in 900 &amp; mgr; l verdünnt beginnen. </li><li> Platten Verdünnungen wie in 1,11-1,14 beschrieben. </li></ol></li><li> Eine Differenzierung zwischen BCG und H37Rv durch PCR HINWEIS: In den Platten von 6.1.6 auf die Gruppe mit BCG durch den intranasalen Weg geimpft entsprechenden analysierten wir eine repräsentative Anzahl von Kolonien durch eine anspruchsvolle PCR zwischen BCG und H37Rv, um sicherzustellen, dass der CFU als Impfstoff-verliehenen Schutzwirkung zu beurteilen entsprach eindeutig H37Rv. Dieses PCR-Amplifikation von Zielen RD9, eine genomische Region unterschiedlich in BCG und M. tuberkulose, so dass ein Fragment von 2618 bp für H37Rv und 465 bp für BCG 11. <ol><li> Bereiten Sie einen Master-Mix Lager für alle Proben mit einem Volumen pro Probe, wie angegeben, und verteilen dann in PCR-Röhrchen (9 ul / Probe). HINWEIS: Puffer 5x: 2 &amp; mgr; l. Forward - Primer 25 uM (GTGTAGGTCAGCCCCATCC): 0,32 &amp; mgr; l, Reverse - Primer 25 uM (GCCCAACAGCTCGACATC): 0,32 &amp; mgr; l, Taq - Polymerase 5 Einheiten / ul: 0,04 ul, Entionisiertes H 2 O: 6,32 ul. </li><li> Tippen Sie auf eine Kolonie mit einem sterilen Zahnstocher und tauchen Sie den Zahnstocher mit der Probe in einem PCR-Röhrchen mit dem Master-Mix. </li><li> Führen Sie die PCR mit dem folgenden Programm: 10 min 95 ° C (dieser Schritt ist die bakterielle Unterbrechung auszulösen), 10 min 95 ° C (dieser Schritt ist die bakterielle Unterbrechung auszulösen), 35 Zyklen (30 Sekunden bei 95 ° C, 1 min bei 58 ° C und 4 min bei 72 ° C). </li><li> Laden Sie die PCR-Proben in einem 1% igen Gel mit Ethidiumbromid und Laufproben, um die Fragmente zu visualisieren. </li&gt; </ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Although current vaccine against tuberculosis, BCG, is the most widely administered vaccine in history, tuberculosis remains one of the leading causes of death and morbidity from infectious diseases worldwide. This paradox is explained by the lack of protection of this vaccine against pulmonary tuberculosis, the responsible form of transmission. New vaccination approaches effective against pulmonary forms of the disease are urgently needed, as they would have the greatest impact on disease transmission globally.
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Tuberkulose (TB) ist einer der führenden Infektionskrankheiten verursacht mehr Todesfälle assoziiert als HIV in der Welt und in Kombination mit steigenden Zunahme von multiresistenten Stämmen macht TB eine alarmierende globales Gesundheitsproblem dar 1. Neue Diagnose-Tools, effektiver und weniger toxische Medikamente und neue sichere und wirksame TB-Impfstoffe sind ein dringender Bedarf, vor allem in den Entwicklungsländern. Lebendes attenuiertes Bazillus Calmette-Guerin (BCG) ist derzeit der einzige zugelassene Impfstoff gegen Tuberkulose, die seit den 1970er Jahren weltweit intradermal bei der Geburt verabreicht wurde. BCG als wirksam bei der Verhinderung von schweren Formen der Erkrankung (Meningitis und miliary TB) bei Kindern, hat aber inkonsistent Wirksamkeit gegen Lungentuberkulose verantwortlich für die Übertragung von Krankheiten 2 gezeigt. Pulmonale Impfung, die natürliche Weg der TB-Infektion nachahmt, stellt ein attraktiver Ansatz für die lokale Immunantwort des Wirts Grundierens. Folgende Lungen Immunisierung In dieser Hinsicht wurden verschiedene präklinische Arbeiten in verschiedenen relevanten Tiermodellen TB größer Impfstoff Wirksamkeit gezeigt , wie 3-6 zur subkutanen oder intradermalen Weg verglichen. Dennoch werden die Schutzmechanismen ausgelöst durch Lungen Impfung nicht gut verstanden. In den letzten Jahren haben mehrere Werke IL17-vermittelte Reaktion als ein wichtiger Faktor der TB-spezifische Schleimhautimmunantwort, wie sie in Mausmodellen defizienten für IL17 Schleimhaut - Impfstoff-induzierte Schutzwirkung zeigte auf 7,8 wird beeinträchtigt. Vor kurzem haben wir gezeigt , zum ersten Mal , die BCG - Administration intranasale DBA / 2 - Mäuse geschützt, eine Belastung der Maus durch den Mangel an Schutz nach subkutaner BCG Impfung 9 gekennzeichnet. Diese Ergebnisse legen nahe, dass der Atemwege TB-Impfung könnte effektiver sein Rate von TB in Endemiegebieten bei der Verringerung, wo intradermale BCG ist unwirksam gegen Pulmon betrachtetary TB.

<table><tbody><tr><td>Middlebrook 7H9 broth</td><td>BD</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook ADC Enrichment</td><td>BD</td><td>211887</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Scharlau</td><td>TW00800250</td><td></td></tr><tr><td>3-mm diameter Glass Beads</td><td>Scharlau</td><td>038-138003</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook 7H10 Agar</td><td>BD</td><td>262710</td><td></td></tr><tr><td>1-ml syringe 26GA 0.45 x 10 mm</td><td>BD</td><td>301358</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>C tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>M tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase D</td><td>Roche</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Applichem</td><td>A3778,0100</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 70 &amp;micro;m Cell Strainer</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>Red Blood Cell Lysing Buffer</td><td>Sigma</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>100x concentrated</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Solution</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>100x concentrated</td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum</td><td>Biological Industries</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M3148-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Scepter 2.0 Handheld Automated Cell Counter</td><td>Millipore</td><td>PHCC20040</td><td></td></tr><tr><td>Scepter Cell Counter Sensors, 40 &amp;micro;m</td><td>Millipore</td><td>PHCC40050</td><td></td></tr><tr><td>Mycobacterium Tuberculosis - Tuberculin PPD</td><td>Statens Serum Institut (SSI)</td><td>2390</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IFN-&amp;gamma; ELISA development kit&amp;nbsp;</td><td>Mabtech</td><td>3321-1H</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IL17A ELISA development kit&amp;nbsp;</td><td>Mabtech</td><td>3521-1H</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B7651</td><td></td></tr><tr><td>FITC Rat Anti-Mouse CD4</td><td>BD</td><td>553047</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm Kit</td><td>BD</td><td>555028</td><td></td></tr><tr><td>APC-Cy7 Rat Anti-mouse IL-17A</td><td>BD</td><td>560821</td><td></td></tr><tr><td>APC Mouse Anti-mouse IFNg</td><td>BD</td><td>554413</td><td></td></tr><tr><td>LACHRYMAL OLIVE LUER LOCK 0.60 x 30 mm. 23G x 1 1/4&amp;rdquo;</td><td>UNIMED</td><td>27.134</td><td>Used as trachea cannula for BAL</td></tr><tr><td>high-protein binding polystyrene flat-bottom 96-well plates MAXISORP</td><td>NUNC</td><td>430341</td><td></td></tr><tr><td>Albumin, from bovine serum</td><td>Sigma</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse IgA (&amp;alpha;-chain specific)&amp;minus;Peroxidase antibody</td><td>Sigma</td><td>A4789</td><td></td></tr><tr><td>3,3&amp;prime;,5,5&amp;prime;-Tetramethylbenzidine (TMB)&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T0440</td><td></td></tr><tr><td>MyTaq DNA Polymerase</td><td>Bioline</td><td>BIO-21107</td><td>The kit Includes Buffer 5x</td></tr></tbody></table>

protective efficacy and pulmonary immune response following subcutaneous and intranasal bcg administration in mice

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data have encouraged pulmonary tuberculosis vaccines as a promising strategy to prevent pulmonary disease, which is responsible for transmission. In this work, we describe the methodology used to demonstrate in the mouse model the benefits of intranasal BCG vaccination when compared to subcutaneous. Our data revealed greater protective efficacy following intranasal BCG administration. In addition, our results indicate that pulmonary vaccination triggers a higher immune response in lungs, including Th1 and Th17 responses, as well as an increase of immunoglobulin A (IgA) concentration in respiratory airways. Our data show correlation between protective efficacy and the presence of IL17-producing cells in lungs post-Mycobacterium tuberculosis challenge, suggesting a role for this cytokine in the protective response conferred by pulmonary vaccination. Finally, we detail the global workflow we have developed to study respiratory vaccination in the mouse model, which could be extrapolated to other tuberculosis vaccines, apart from BCG, targeting the mucosal response or other pulmonary routes of administration such as the intratracheal or aerosol.

Diese Arbeit beschreibt den Vergleich von zwei Arten der Verabreichung von BCG: subkutane und intranasale. Subkutanem Weg ist vergleichbar mit dem intradermal, die der aktuellen klinischen Weg für BCG weltweit ist. Die intranasale Weg der Impfung zielt darauf ab , den natürlichen Weg der Infektion von M. zu imitieren tuberculosis mit dem Ziel - Immunantwort zu induzieren , direkt in die Lunge, das Hauptzielorgan dieses Erregers. <p class="jove_content" fo:keep-tog...

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Protective Efficacy and Pulmonary Immune Response Following Subcutaneous and Intranasal BCG Administration in Mice

We herein detail the methodology followed to compare protective efficacy and lung immune response induced by intranasal and subcutaneous immunization with BCG in mouse model. Our results show the benefits of pulmonary vaccination and suggest a role for IL17-mediated response in vaccine-induced protection.

Die protektive Wirksamkeit und pulmonale Immunantwort nach subkutaner und intranasale BCG Verabreichung an Mäuse

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data ...

protective-efficacy-pulmonary-immune-response-following-subcutaneous

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.5K Aufrufe.  University of Zaragoza. We herein detail the methodology followed to compare protective efficacy and lung immune response induced by intranasal and subcutaneous immunization with BCG in mouse model. Our results show the benefits of pulmonary vaccination and suggest a role for IL17-mediated response in vaccine-induced protection.

Serie: Protective Efficacy and Pulmonary Immune Response Following Subcutaneous and Intranasal BCG Administration in Mice

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux)

Functional assays have long played a key role in measuring of immunogenicity of a given vaccine. This is conventionally expressed as serum bactericidal titers. Studies of serum bactericidal titers in response to childhood vaccines have enabled us to develop and validate cut-off levels for protective immune responses and such cut-offs are in routine use. No such assays have been taken forward into the routine assessment of vaccines that induce primarily cell-mediated immunity in the form of effector T cell responses, such as TB vaccines. In the animal model, the performance of a given vaccine candidate is routinely evaluated in standardized bactericidal assays, and all current novel TB-vaccine candidates have been subjected to this step in their evaluation prior to phase 1 human trials. The assessment of immunogenicity and therefore likelihood of protective efficacy of novel anti-TB vaccines should ideally undergo a similar step-wise evaluation in the human models now, including measurements in bactericidal assays.
Bactericidal assays in the context of tuberculosis vaccine research are already well established in the animal models, where they are applied to screen potentially promising vaccine candidates. Reduction of bacterial load in various organs functions as the main read-out of immunogenicity. However, no such assays have been incorporated into clinical trials for novel anti-TB vaccines to date.
Although there is still uncertainty about the exact mechanisms that lead to killing of mycobacteria inside human macrophages, the interaction of macrophages and T cells with mycobacteria is clearly required. The assay described in this paper represents a novel generation of bactericidal assays that enables studies of such key cellular components with all other cellular and humoral factors present in whole blood without making assumptions about their relative individual contribution. The assay described by our group uses small volumes of whole blood and has already been employed in studies of adults and children in TB-endemic settings. We have shown immunogenicity of the BCG vaccine, increased growth of mycobacteria in HIV-positive patients, as well as the effect of anti-retroviral therapy and Vitamin D on mycobacterial survival in vitro. Here we summarise the methodology, and present our reproducibility data using this relatively simple, low-cost and field-friendly model.
Note: Definitions/Abbreviations
BCG lux = M. bovis BCG, Montreal strain, transformed with shuttle plasmid pSMT1 carrying the luxAB genes from Vibrio harveyi, under the control of the mycobacterial GroEL (hsp60) promoter. 
CFU = Colony Forming Unit (a measure of mycobacterial viability).

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb BCG lux/M.Tb lux

We describe an alternative approach to the enumeration of mycobacteria in vitro, which uses reporter-gene tagged mycobacteria instead of colony-forming units (CFU). &#x201C;Survival&#x201D; of organisms as well as host response-markers are measured simultaneously, providing a low-cost, versatile and functional system for studies of host/pathogen interactions in the context of tuberculosis.

A Functional Whole Blood Assay zur Rentabilität von Mykobakterien Measure, mit Reporter-Gene BCG oder M. Tb (BCG Tagged Lux / M. Tb Lux)

Functional assays have long played a key role in measuring of immunogenicity of a given vaccine. This is conventionally expressed as serum bactericidal ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Intralymphatic Immunotherapy and Vaccination in Mice

Vaccines are typically injected subcutaneously or intramuscularly for stimulation of immune responses. The success of this requires efficient drainage of vaccine to lymph nodes where antigen presenting cells can interact with lymphocytes for generation of the wanted immune responses. The strength and the type of immune responses induced also depend on the density or frequency of interactions as well as the microenvironment, especially the content of cytokines. As only a minute fraction of peripherally injected vaccines reaches the lymph nodes, vaccinations of mice and humans were performed by direct injection of vaccine into inguinal lymph nodes, i.e.&#160;intralymphatic injection. In man, the procedure is guided by ultrasound. In mice, a small (5-10 mm) incision is made in the inguinal region of anesthetized animals, the lymph node is localized and immobilized with forceps, and a volume of 10-20 &#956;l of the vaccine is injected under visual control. The incision is closed with a single stitch using surgical sutures. Mice were vaccinated with plasmid DNA, RNA, peptide, protein, particles, and bacteria as well as adjuvants, and strong improvement of immune responses against all type of vaccines was observed. The intralymphatic method of vaccination is especially appropriate in situations where conventional vaccination produces insufficient immunity or where the amount of available vaccine is limited.

Prophylactic and therapeutic vaccination often fails to stimulate strong immune responses due to week drainage of the vaccine to lymph nodes and consequently poor involvement of immune cells. By direct injection of vaccine to lymph nodes, so-called intralymphatic injection, vaccine efficacy can be strongly improved and vaccine doses can be reduced.

Intralymphatische Immuntherapie und Impfungen bei Mäusen

Vaccines are typically injected subcutaneously or intramuscularly for stimulation of immune responses. The success of this requires efficient drainage of ...

Sublingual Immunotherapy as an Alternative to Induce Protection Against Acute Respiratory Infections

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been shown to effectively induce humoral and cellular responses at systemic and mucosal sites, namely the lungs and urogenital tract. Sublingual vaccination can promote protection against infections at the lower and upper respiratory tract; it can also promote tolerance to allergens and ameliorate asthma symptoms. Modulation of lung&#8217;s immune response by sublingual immunotherapy (SLIT) is safer than direct administration of formulations by intranasal route because it does not require delivery of potentially harmful molecules directly into the airways. In contrast to intranasal delivery, side effects involving brain toxicity or facial paralysis are not promoted by SLIT. The immune mechanisms underlying SLIT remain elusive and its use for the treatment of acute lung infections has not yet been explored. Thus, development of appropriate animal models of SLIT is needed to further explore its potential advantages. 
This work shows how to perform sublingual administration of therapeutic agents in mice to evaluate their ability to protect against acute pneumococcal pneumonia. Technical aspects of mouse handling during sublingual inoculation, precise identification of sublingual mucosa, draining lymph nodes and isolation of tissues, bronchoalveolar lavage and lungs are illustrated. Protocols for single cell suspension preparation for FACS analysis are described in detail. Other downstream applications for the analysis of the immune response are discussed. Technical aspects of the preparation of Streptococcus pneumoniae inoculum and intranasal challenge of mice are also explained.
SLIT is a simple technique that allows screening of candidate molecules to modulate lungs&#8217; immune response. Parameters affecting the success of SLIT are related to molecular size, susceptibility to degradation and stability of highly concentrated formulations.

The present work illustrates the convenience of using sublingual immunotherapy to boost the innate immune response in the lungs and confer protection against acute pneumococcal pneumonia in mouse.

Sublinguale Immuntherapie als Alternative zum Schutz vor akuten Atemwegsinfektionen ausgelöst werden

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been ...

Medizin

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph node (DLN). The mobilization of DCs to the DLN is complex and remains to be fully elucidated during infection. Herein described is the use of an innovative, simple assay that relies on the fluorochrome 5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to track the migration of DCs during footpad infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin (BCG) in C57BL/6 mice. This assay enables the characterization of skin DC sub-populations that actively relocate to the draining, popliteal LN in response to BCG. This protocol originates from a BCG model where migratory skin DCs were identified by flow cytometry. The assay is amiable to the study and identification of DCs or other cells that home to the popliteal LN after inoculation of microbes, their metabolites or other inflammatory stimuli in the footpad, and consequently to study factors that regulate the migration of these cells.

An assay in mice to track cell migration from skin to draining lymph node is described which enables the characterization of skin Dendritic cells mobilized to the lymph node after footpad infection with Bacille Calmette-Gu&#233;rin.

Ein CFSE-basierten Assay die Migration von murinen Haut Dendritischen Zellen in Lymphknoten während der Infektion zu studieren mit<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Bazillus Calmette-Guérin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

Tuberculosis (TB) is a serious infectious disease and the only available vaccine M. bovis bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is safe and effective for protection against children&#39;s severe TB meningitis and some forms of disseminated TB, but fails to protect against pulmonary TB, which is the most prevalent form of the disease. Promising strategies to improve BCG currently rely either on its transformation with genes encoding immunodominant M. tuberculosis (Mtb)-specific antigens and/or complementation with genes encoding co-factors that would stimulate antigen presenting cells. Major limitations to these approaches include low efficiency, low stability, and the uncertain level of safety of expression vectors. In this study, we present an alternative approach to vaccine improvement, which consists of BCG complementation with exogenous proteins of interest on the surface of bacteria, rather than transformation with plasmids encoding corresponding genes. First, proteins of interest are expressed in fusion with monomeric avidin in standard E. coli expression systems and then used to decorate the surface of biotinylated BCG. Animal experiments using BCG surface decorated with surrogate ovalbumin antigen demonstrate that the modified bacterium is fully immunogenic and capable of inducing specific T cell responses. Altogether, the data presented here strongly support a novel and efficient method for reshaping the current BCG vaccine that replaces the laborious conventional approach of complementation with exogenous nucleic acids.

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

A novel technique for rapid antigen display on a bacterial surface is presented, which involves surface biotinylation followed by exposure to proteins of interest in fusion with monomeric avidin. Loading BCG with selected antigens successfully improves its immunogenicity, suggesting that surface decoration can replace traditional genetic approaches.

Ausdruck der exogene Antigene im Mycobacterium Bovis BCG Impfstoff über nicht-genetische Oberfläche Dekoration mit dem Avidin-Biotin-System

Tuberculosis (TB) is a serious infectious disease and the only available vaccine M. bovis bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is safe and effective for ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model offers accessibility to rare populations of antigen-specific T-cells representative of the cellular memory response as well as the cytokine microenvironment in situ.
This report describes the practical procedure of a cutaneous recall, an SB induction, and a harvest of antigen-specific T-cells. To exemplify the method, the tuberculin skin test is used for antigenic recall in individuals who, prior to this study, underwent a Bacillus Calmette-Gu&#233;rin vaccination against an infection with Mycobacterium tuberculosis. Finally, examples of multiplex and flow cytometric analyses of SB specimens are provided, illustrating high fractions of antigen-specific polyfunctional CD4+ T-cells available by this sampling method compared with cells isolated from the blood.
The method described here is safe and minimally invasive, provides a unique opportunity to study both innate and adaptive immune responses in vivo, and may be beneficial to a broad community of researchers working with cell-mediated immunity and human memory responses, in the context of vaccine development.

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Here, we provide a demonstration of the suction blister cutaneous recall model. The model allows a simple access to study human in vivo adaptive immune responses, for instance in the context of vaccine development.

Ein Saug Blister-Protokoll, menschliche T-Zelle Recall Antworten In Vivo zu studieren

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Bewertung der Wirt-Pathogen-Antworten und Wirksamkeit des Impfstoffes bei Mäusen

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria

Most bacteria, including mycobacteria, generate extracellular vesicles (EVs). Since bacterial EVs (bEVs) contain a subset of cellular components, including metabolites, lipids, proteins, and nucleic acids, several groups have evaluated either the native or recombinant versions of bEVs for their protective potency as subunit vaccine candidates. Unlike native EVs, recombinant EVs are molecularly engineered to contain one or more immunogens of interest. Over the last decade, different groups have explored diverse approaches for generating recombinant bEVs. However, here, we report the design, construction, and enrichment of recombinant mycobacterial EVs (mEVs) in mycobacteria. Towards that, we use Mycobacterium smegmatis (Msm), an avirulent soil mycobacterium as the model system. We first describe the generation and enrichment of native EVs of Msm. Then, we describe the design and construction of recombinant mEVs that contain either mCherry, a red fluorescent reporter protein, or EsxA (Esat-6), a prominent immunogen of Mycobacterium tuberculosis. We achieve this by separately fusing mCherry and EsxA N-termini with the C-terminus of a small Msm protein Cfp-29. Cfp-29 is one of the few abundantly present proteins of MsmEVs. The protocol to generate and enrich recombinant mEVs from Msm remains identical to the generation and enrichment of native EVs of Msm.

This protocol details the enrichment of native mycobacterial extracellular vesicles (mEVs) from axenic cultures of Mycobacterium smegmatis (Msm) and how mCherry (a red fluorescent reporter)-containing recombinant MsmEVs can be designed and enriched. Lastly, it verifies the novel approach with the enrichment of MsmEVs containing the EsxA protein of Mycobacterium tuberculosis.

Anreicherung nativer und rekombinanter extrazellulärer Vesikel von Mykobakterien

Most bacteria, including mycobacteria, generate extracellular vesicles (EVs). Since bacterial EVs (bEVs) contain a subset of cellular components, ...

Beschleunigung der Tuberkulosebestimmung mit der Mikro-KBE-Methode

Micro-Colony Forming Unit Assay for Efficacy Evaluation of Vaccines Against Tuberculosis

Tuberculosis (TB), the leading cause of death worldwide by an infectious agent, killed 1.6 million people in 2022, only being surpassed by COVID-19 during the 2019-2021 pandemic. The disease is caused by the bacterium Mycobacterium tuberculosis (M.tb). The Mycobacterium bovis strain Bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG), the only TB vaccine, is the oldest licensed vaccine in the world, still in use. Currently, there are 12 vaccines in clinical trials and dozens of vaccines under pre-clinical development. The method of choice used to assess the efficacy of TB vaccines in pre-clinical studies is the enumeration of bacterial colonies by the colony-forming units (CFU) assay. This time-consuming assay takes 4 to 6 weeks to conclude, requires substantial laboratory and incubator space, has high reagent costs, and is prone to contamination. Here we describe an optimized method for colony enumeration, the micro-CFU (mCFU), that offers a simple and rapid solution to analyze M.tb vaccine efficacy results. The mCFU assay requires tenfold fewer reagents, reduces the incubation period threefold, taking 1 to 2 weeks to conclude, reduces lab space and reagent cost, and minimizes the health and safety risks associated with working with large numbers of M.tb. Moreover, to evaluate the efficacy of a TB vaccine, samples may be obtained from a variety of sources, including tissues from vaccinated animals infected with Mycobacteria. We also describe an optimized method to produce a unicellular, uniform, and high-quality mycobacterial culture for infection studies. Finally, we propose that these methods should be universally adopted for pre-clinical studies of vaccine efficacy determination, ultimately leading to time reduction in the development of vaccines against TB.

Autor im Rampenlicht: Optimierung der KBE-Bestimmung für eine effiziente Bewertung der Wirksamkeit von TB-Impfstoffen und der Analyse der Antigenpräsentation 

The determination of colony-forming units (CFU) is the gold-standard technique for quantifying bacteria, including Mycobacterium tuberculosis which can take weeks to form visible colonies. Here we describe a micro-CFU for CFU determination with increased time efficiency, reduced lab space and reagent cost, and scalability to medium and high throughput experiments.

Mikrokoloniebildender Unit-Assay zur Wirksamkeitsbewertung von Impfstoffen gegen Tuberkulose

Tuberculosis (TB), the leading cause of death worldwide by an infectious agent, killed 1.6 million people in 2022, only being surpassed by COVID-19 during ...

Die protektive Wirksamkeit und pulmonale Immunantwort nach subkutaner und intranasale BCG Verabreichung an Mäuse

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A Functional Whole Blood Assay zur Rentabilität von Mykobakterien Measure, mit Reporter-Gene BCG oder M. Tb (BCG Tagged Lux / M. Tb Lux)

Intralymphatische Immuntherapie und Impfungen bei Mäusen

Sublinguale Immuntherapie als Alternative zum Schutz vor akuten Atemwegsinfektionen ausgelöst werden

Ein CFSE-basierten Assay die Migration von murinen Haut Dendritischen Zellen in Lymphknoten während der Infektion zu studieren mit

Ausdruck der exogene Antigene im Mycobacterium Bovis BCG Impfstoff über nicht-genetische Oberfläche Dekoration mit dem Avidin-Biotin-System

Ein Saug Blister-Protokoll, menschliche T-Zelle Recall Antworten In Vivo zu studieren

Bewertung der Wirt-Pathogen-Antworten und Wirksamkeit des Impfstoffes bei Mäusen

Anreicherung nativer und rekombinanter extrazellulärer Vesikel von Mykobakterien

Mikrokoloniebildender Unit-Assay zur Wirksamkeitsbewertung von Impfstoffen gegen Tuberkulose

Mikrokoloniebildender Unit-Assay zur Wirksamkeitsbewertung von Impfstoffen gegen Tuberkulose