Name: layered alginate constructs: a platform for co-culture of heterogeneous cell populations
Uploaded: 2016-08-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations at JoVE.com

This work was funded by the National Science Foundation (CBET 0845754, AHH).

1. Vorbereitung für die Bildung von Alginate Discs <ol><li> Vorbereiten eines 4% (w / v) Alginatlösung in 1x Dulbecco-Phosphat-gepufferter Saline ohne Zusatz von Calciumchlorid oder Magnesiumchlorid und in einem 37 ° C Wasserbad. Konzentrationen der Alginatlösung kann variieren, aber von 1 bis 4% (w / v) Alginatlösungen werden empfohlen. </li><li> Mischen Sie die Alginat - Lösung in einem Verhältnis von 1: 1 mit warmem Zellkulturmedien Base (beispielsweise Dulbeccos modifiziertes Eagle - Medium.) Für den gewünschten Zelltyp. Die Alginat - Konzentration ist jetzt die Hälfte der ursprünglichen Konzentration, dh., 2% (w / v). Sterilisieren Alginat / Media-Lösung steril 0,2 um Nylonspritzenfilter verwenden. </li><li> Bereiten Sie ein Bad aus sterilen 102 mM Calciumchloriddihydrat in sterilem Wasser mit genug Lösung Formen zu versenken (~ 200 bis 300 ml). </li><li> Sammeln Sie die sterile &quot;Gelbildung Form&quot; (6 mm Durchmesser x 3 mm groß zylindrischen Vertiefungen in einer 3 in x 3 in Aluminiumplatte, siehe <strong&gt; Abbildung 1) und Endplatten (Unten: ein 3 in x 3 in Aluminium - Platte, oben: eine 1,5 in x 3 in Aluminiumplatte) und Formen herzustellen , wie folgt: <ol><li> Schneiden dick Filterpapier (blotter Filterpapier) und die Zelle Mikrosieb Membran (10 &amp; mgr; m Porengröße) zu den Größen der oberen und unteren Endplatten und legen Sie sie in das Bad Calciumchlorid bis zur Sättigung, ca. 1 min. Falls gewünscht, sterilisiert die dicke Filterpapier und die Membran über Mikrosieb Autoklaven oder ultraviolettem Licht für 30 min vor der Verwendung. </li><li> Set-up die Hälfte (die untere Hälfte) des Form Konstrukt. <ol><li> Legen Sie die folgenden Elemente übereinander in der folgenden Reihenfolge und glätten einen sterilen Spatel mit: große Endscheibe (3 in x 3 Zoll), dickes Filterpapier, und dann die Mikrosieb Membran. </li><li> Umkehren und drücken Sie die Form auf einen Stapel von Papierhandtüchern Verlust von überschüssigem Calciumchloridlösung zu gewährleisten. </li><li> Legen Sie die &quot;Gel-Bildung Form&quot; mit den zylindrischen Vertiefungen auf der Oberseite des cell Mikrosieb Membran und befestigen Sie sanft die Form zusammen auf zwei Seiten mit Binder Clips auf der linken und rechten Seite. Achten Sie darauf, genügend Platz für die obere Endscheibe (1,5 Zoll x 3 Zoll) zu verlassen, die Vertiefungen vollständig später zu decken. </li></ol></li><li> Set-up in der zweiten Hälfte (die obere Hälfte) des Form Konstrukt. <ol><li> Legen Sie die folgenden Elemente übereinander in der folgenden Reihenfolge und glätten: kleine Endscheibe, dickes Filterpapier, Mikrosieb Membran. </li><li> Umkehren und drücken Sie diese Hälfte der Form auf einen Stapel von Papierhandtüchern Verlust von überschüssigem Calciumchloridlösung zu gewährleisten. mit Binder Clips zu diesem Zeitpunkt nicht über diese Hälfte der Form zu befestigen. </li></ol></li></ol></li><li> Kulturzellen als den Anweisungen des Herstellers empfohlen. Ernten Sie die gewünschten Zellen in den geschichteten Alginat Hydrogele einbetten. Die empfohlene Zelldichte von 1 bis 2 x 10 6 Zellen / ml, dies kann jedoch je nach gewünschter Experimenten variiert werden. Hinweis: Bei Verwendung dieser Methodefür Schichten mit unterschiedlichen Zelltypen zu machen, machen die Kultur zwei Zelltypen parallel sicher für die Schichtung. Mesenchymale Stammzellen (MSCs) in einer Zelldichte von 1 x 10 6 Zellen / ml wird als ein Beispiel für das folgende Protokoll verwendet werden. Die Zellzahl und Disc-Nummer kann für Experimente skaliert werden nach Bedarf. <ol><li> Ein bis zwei Wochen vor dem Einbetten, seed mesenchymalen Stammzellen in einer Zelldichte von 3000 - 5000 Zellen / cm 2 in 10 ml basale Wachstumsmedien (Dulbeccos Modified Eagle Medium, das 10% fötales Rinderserum, 2% L-Glutamin, 1 % nicht-essentielle Aminosäuren, 1% Penicillin / Streptomycin) in T-75-Flaschen. </li><li> Entfernen Sie verbrauchte Medien alle 2 - 3 Tage und ersetzen mit 10 ml basale Wachstumsmedium, bis die Zellen 80 sind - konfluenten 90%. </li><li> Ernten Zellen, verbrauchtes Medium zu entfernen, und die Pipette 3 ml 1x Dulbecco-Phosphat-gepufferter Saline ohne Zusatz von Calciumchlorid oder Magnesiumchlorid zu spülen Zellen. Entfernen Sie diese Lösung, Pipette 3 ml 0,25% VersuchenPSIN-EDTA auf Zellen in T-75-Kolben wachsen, und bei 37 ° C für 5 min inkubiert. Nachdem die Zellen von der Haftfläche angehoben haben, fügen Sie 6 - 9 ml basale Wachstumsmedien. </li><li> Zentrifuge MSCs bei 600 xg für 5 min bei Raumtemperatur, saugt den Überstand und resuspendiere in 1 bis 5 ml der basalen Wachstumsmedien. Zählen Sie die Zellen unter Verwendung eines Zählkammer Gerät Anweisungen. </li><li> Entfernen Sie 1 x 10 6 Zellen aus der gesamten Zelle Aufwirbelung, Zentrifuge die gleichen Bedingungen verwendet, und den Überstand aspirieren. </li></ol></li></ol> 2. Bildung von Zell Gesetzt Alginate Discs <ol><li> Resuspendieren des Zellpellets mit 1 ml der sterilen Alginat / Medien - Lösung mit einer Zelldichte von 1 x 10 6 Zellen / ml zu erreichen. Das Zell-Alginat-Gemisch wird in Aussehen homogen trübe sein, wenn die Zellen in geeigneter Weise gemischt werden. </li><li> Pipette 130 ul der Zell-Alginat-Mischung in sechs 6 mm Durchmesser x 3 mm tall Vertiefungen in der unteren Hälfte der FormKonstrukt tropft, um keine Luftblasen zu erzeugen. Ein leicht konvexer Meniskus sollte über dem Rand jeder Vertiefung sichtbar. </li><li> Sorgfältig glätten sie über die obere Hälfte der Form Konstrukt, das eine sterile Spachtel und drehen, so dass die Zelle Mikrosieb Membran auf der Oberseite der Brunnen ist. Legen Sie die Form auf der Oberseite der Brunnen bauen, um sicherzustellen, die Vertiefungen, die die Zelle und Alginat-Gemisch vollständig zu bedecken. </li><li> Heben Sie die beschickte Form Konstrukt und unten drücken und fest auf der Mitte, Heftklammer, die verbleibenden zwei Seiten (oben und unten), um die oberen und unteren Hälften der Form Konstrukt zu befestigen. Die Zell-Alginat-Lösungen sollten sicher in den Vertiefungen zu diesem Zeitpunkt eingebettet werden. </li><li> Tauchen Sie die befestigte Form Konstrukt in der 102 mM Calciumchlorid-Bad, um sicherzustellen, dass das gesamte Konstrukt eingetaucht ist. Inkubieren der Zellkultur Haube bei Raumtemperatur für 90 min. </li><li> Am Ende der 90 Minuten, entfernen Sie das Form Konstrukt aus dem 102 mM CalciumchloridBad und auf einen Stapel von Papierhandtüchern in der Zellkultur Kapuze. Entfernen Sie alle vier Binder Clips und trennen die beiden Hälften der Form Konstrukt. Hydrogele in den Vertiefungen gebildet werden, sollten keine Blasen haben und die Vertiefungen vollständig ausfüllen sollte. </li><li> Mit einem Spatel, Spuren sorgfältig den Rand der Vertiefungen der Hydrogele enthaltend die Hydrogele sorgfältig lösen und Keil aus. Nachdem die Hydrogele aus der Form Konstrukts Entfernen Drop die Hydrogele direkt in ein Bad aus 1x Dulbecco Phosphat-gepufferte Saline mit Calciumchlorid und Magnesiumchlorid. Decken Sie die Gele vollständig abzuwaschen das überschüssige Calciumchloridlösung für 1 - 5 min. </li><li> Übertragen Sie die Hydrogele in basalen Nährmedien Lösung in gewünschte Schale (z. B. 6 - Well - Platten) , die vollständig der Hydrogele abdeckt. Mindestens 1 Stunde in der Zellkulturbrutschrank bei 37 ° C und 5% CO 2 für vor zur Schichtungsschritt fort. Anmerkung: Hydrogele Zellen enthält, kann gehalten werden indie Zellkultur-Inkubator auf unbestimmte Zeit zu dieser Zeit, bis der Gele mit einem anderen Zellpopulation Schichtung gewünscht wird, vorausgesetzt, dass Medienwechsel alle 2 abgeschlossen sind - 3 Tage. </li></ol> 3. Layering von Alginate Discs <ol><li> Während der letzten halben Stunde der 1-stündigen Inkubation sammeln und bereiten sterile Formen und Lösung für die Gele Glühen. <ol><li> Bereiten Sie die &quot;Stanzform&quot; durch eine Form Befestigung, die Vertiefungen der Hälfte der Höhe der &quot;Gelbildung Form&quot; (6 mm Durchmesser x 1,5 mm groß Brunnen in einem 3 in x 3 in Aluminiumplatte) zu einer Endscheibe (3 in x hat 3 in Aluminiumplatte) -Bindemittel Clips auf der linken und rechten Seite verwendet wird. </li><li> Bereiten Sie die &quot;annealing mold&quot; durch eine Formbefestigungs, die 3 mm im Durchmesser größer als der &quot;Gelbildung mold&quot; (9 mm Durchmesser x 3 mm tall Vertiefungen in einer 3 in x 3 in Aluminiumplatte) zu einer Endplatte (3 in x 3 in Aluminiumplatte) -Bindemittel Clips auf der linken und rechten Seite verwendet wird. </li><li> Eine Lösung aus100 mM Natriumcitrat / 30 mM EDTA (Natriumcitrat-Dihydrat, dihydrat Ethylendiamintetraessigsäure-Tetranatriumsalz) in sterilem Wasser. </li></ol></li><li> Entfernen Sie Gele der gewünschten Zellpopulationen (in diesem Beispiel zwei Scheiben mit hMSCs) von den Medien in der Schale, und legen Sie in die &quot;Stanzform&quot; Brunnen. Jedes Gel sollte eng anliegen in die Vertiefungen mit der Hälfte des Gels über der Form vorsteht. </li><li> Mit einem Skalpell schneiden, das Gel auf der Oberfläche der Form (dies wird das Hydrogel in Hälften geschnitten). Drehen Sie die obere Hälfte des Gels und legen Sie sie in eine offene Form gut. Die Hälfte des Gels sollte auch eng in die Form passt gut, aber jetzt beide Halb Gele sollte die Höhe der Form mit dem ausgeschnittenen Innenfläche sichtbar sein. Wiederholen Sie mit dem zweiten Gel. Hinweis: Achtung: Es werden nur die inneren Schnittflächen werden geschichteten Scheiben bilden. die Außenflächen Verwendung in der Hälften Trenn führen. Es ist diese Textur aus der Mikrosieb Membran auf die Geloberfläche übertragen Verdacht verhindernDer Erfolg des Wärmebehandlungsprozesses. </li><li> Legen Sie ein Stück Trockenzelle Mikrosieb Membran auf der Oberseite der Vertiefungen, um sicherzustellen, dass die Mikrosieb Membran in Kontakt mit allen der Gel-Hälften werden geglüht und bedeckt sie vollständig. Legen Sie dickes Filterpapier auf der Oberseite der Mikrosieb Membran, um sicherzustellen, die Gele vollständig zu bedecken. </li><li> Pipettieren einer Lösung von 100 mM Natriumcitrat / 30 mM EDTA (Natriumcitratdihydrat, dihydrat Ethylendiamintetraessigsäure -tetranatriumsalz) auf den dicken Filterpapier, bis er gesättigt ist. Ungefähr 750 &amp; mgr; l ist für vier Brunnen ausreichend. </li><li> Inkubieren der Gele für 1 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie dann die Zelle Mikrosieb Membran und dicke Filterpapier und entsorgen Sie sie. Entfernen Sie die Binder Clips und öffnen Sie die Form. </li><li> Für jede geglüht Gel, Transfer ein Natriumcitrat / EDTA-behandelten Hälfte des Hydrogels auf die vorbereitete &quot;Glühen Form&quot; mit der Schnittfläche nach oben. Dies wird eine Hälfte des geglüht const seinein- em. </li><li> Mit einem Spatel, Lift und legen Sie eine zweite Natriumcitrat / EDTA-behandelten Halb Gel (eine andere Zelltyp enthalten kann) auf das Gel bereits in der &quot;Glühen Form&quot;, diese zweite Halb Gel Spiegeln, so dass die Schnittfläche in ist Kontakt mit der Schnittfläche des Gels bereits in der &quot;Glühen Form&quot;. </li><li> Drücken Sie vorsichtig auf die beiden Gele mit einem Spatel keine Blasen zwischen den beiden Gele zu entfernen verwenden. Auch neu positionieren die Gele nach Bedarf, um sicherzustellen, dass sie direkt auf voneinander. </li><li> Heben Sie die &quot;Glühen mould&quot; und es in der 102 mM Calciumchlorid-Bad für 30 Minuten untertauchen. Sie nicht die Brunnen mit einer Endscheibe decken. </li><li> Nach der 30 Minuten Inkubation, entfernen Sie das &quot;Glühen mould&quot; und es auf Papiertücher legen. Entfernen Sie die Binder Clips und trennen Sie die Form von der Endscheibe. </li><li> Mit einem Spatel, sammeln die geglüht Gele und sie in einer phosphatgepufferten Salz des 1x Dulbecco mit Calciumchlorid und magnesium Chlorid-Bad die Gele zu waschen. Anschließend übertragen geglüht Hydrogele Zellkulturmedien in einer gewünschten Schale (z. B. 6-well - Platte) für die Kultur. </li></ol>

<ol>
	<li>Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Basic+Science+of+Articular+Cartilage.">The Basic Science of Articular Cartilage.</a> Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).</li><li>Neidlinger-Wilke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+loading+of+the+intervertebral+disc:+from+the+macroscopic+to+the+cellular+level.">Mechanical loading of the intervertebral disc: from the macroscopic to the cellular level.</a> Eur. Spine J. 23 (3), 333-343 (2013).</li><li>Klein, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+of+stratified+articular+cartilage+from+chondrocyte+subpopulations.">Tissue engineering of stratified articular cartilage from chondrocyte subpopulations.</a> Osteoarth. Cartilage. 11 (8), 595-602 (2003).</li><li>Han, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-free+Grafts+for+Articular+Cartilage+Defects.">Scaffold-free Grafts for Articular Cartilage Defects.</a> Clin. Orthop. Relat. R. 466 (8), 1912-1920 (2008).</li><li>Ng, K. W., Ateshian, G. A., Hung, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zonal+chondrocytes+seeded+in+a+layered+agarose+hydrogel+create+engineered+cartilage+with+depth-dependent+cellular+and+mechanical+inhomogeneity.">Zonal chondrocytes seeded in a layered agarose hydrogel create engineered cartilage with depth-dependent cellular and mechanical inhomogeneity.</a> Tissue Eng. A. 15 (9), 2315-2324 (2009).</li><li>Ng, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+layered+agarose+approach+to+fabricate+depth-dependent+inhomogeneity+in+chondrocyte-seeded+constructs.">A layered agarose approach to fabricate depth-dependent inhomogeneity in chondrocyte-seeded constructs.</a> J. Orthop. Res. 23 (1), 134-141 (2005).</li><li>Nguyen, L. H., Kudva, A. K., Saxena, N. S., Roy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+articular+cartilage+with+spatially-varying+matrix+composition+and+mechanical+properties+from+a+single+stem+cell+population+using+a+multi-layered+hydrogel.">Engineering articular cartilage with spatially-varying matrix composition and mechanical properties from a single stem cell population using a multi-layered hydrogel.</a> Biomaterials. 32 (29), 6946-6952 (2011).</li><li>Leone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+multilayered+composite+hydrogel+as+osteochondral+substitute.">Continuous multilayered composite hydrogel as osteochondral substitute.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 103 (8), 2521-2530 (2015).</li><li>Lai, J. H., Kajiyama, G., Smith, R. L., Maloney, W., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+catalyze+cartilage+formation+by+neonatal+articular+chondrocytes+in+3D+biomimetic+hydrogels.">Stem cells catalyze cartilage formation by neonatal articular chondrocytes in 3D biomimetic hydrogels.</a> Sci. Rep. 3, (2013).</li><li>Vigf&#250;sd&#242;ttir, &. #. 1. 9. 3. ;. T., Pasrija, C., Thakore, P. I., Schmidt, R. B., Hsieh, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Pericellular+Matrix+in+Mesenchymal+Stem+Cell+Deformation+during+Chondrogenic+Differentiation.">Role of Pericellular Matrix in Mesenchymal Stem Cell Deformation during Chondrogenic Differentiation.</a> Cell. Mol. Bioeng. 3 (4), 387-397 (2010).</li><li>Lee, C. S. D., Gleghorn, J. P., Won Choi, N., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+layered+chondrocyte-seeded+alginate+hydrogel+scaffolds.">Integration of layered chondrocyte-seeded alginate hydrogel scaffolds.</a> Biomaterials. 28 (19), 2987-2993 (2007).</li><li>Gleghorn, J. P., Lee, C. S. D., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesive+properties+of+laminated+alginate+gels+for+tissue+engineering+of+layered+structures.">Adhesive properties of laminated alginate gels for tissue engineering of layered structures.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 85 (3), 611-618 (2008).</li><li>Gharravi, A. M., Orazizadeh, M., Ansari-Asl, K., Banoni, S., Izadi, S., Hashemitabar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+Fabrication+of+Anatomical+Bioreactor+Systems+Containing+Alginate+Scaffolds+for+Cartilage+Tissue+Engineering.">Design and Fabrication of Anatomical Bioreactor Systems Containing Alginate Scaffolds for Cartilage Tissue Engineering.</a> Avicenna J. Med. Biotechnol. 4 (2), 65-74 (2012).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenic+Differentiation+of+Human+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Three-Dimensional+Alginate+Gels.">Chondrogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells in Three-Dimensional Alginate Gels.</a> Tissue Eng. A. 14 (5), 667-680 (2008).</li><li>Yeatts, A. B., Gordon, C. N., Fisher, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+an+aggregated+alginate+construct+in+a+tubular+perfusion+system.">Formation of an aggregated alginate construct in a tubular perfusion system.</a> Tissue Eng. C, Methods. 17 (12), 1171-1178 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Bildung von geschichteten Alginat Hydrogelscheiben zur Untersuchung Kokulturen von mehreren Zellpopulationen, wie sie in physiologisch geschichteten Geweben, beispielsweise Knorpel. Schichtstrukturen, wie beispielsweise die Kulturplattform beschrieben, kann das Zusammenspiel zwischen zwei verschiedenen Zellpopulationen zu derselben Kulturumgebung oder unter Belastung zu untersuchen, verwendet werden. Alginate ein anionisches lineares Polysaccha...

Auflast Lager Gewebe wie Gelenkknorpel oder Bandscheiben bestehen aus heterogenen Gewebebereiche, die sowohl für biomechanische Funktion und geeignete mechano-Übertragung im Gewebe entscheidend sind. Nicht nur zelluläre Organisation und Funktion verschieden in den verschiedenen Regionen, aber die extrazellulären Matrizes (ECM) sind ebenfalls in der Zusammensetzung und Organisation variieren. Zum Beispiel besteht Gelenkknorpel von drei primären Zonen mit unterschiedlichen Zellmorphologie, mechanische Funktion und ECM. Die Unterschiede in ihren ECM führen tragende Verantwortung Differential; die oberflächliche Schicht wird in Zugwirkung zu laden, während die mittleren und tiefen Zonen sind in erster Linie verantwortlich für die Reaktion auf Kompression 1 in erster Linie beteiligt. Ebenso in der Bandscheibe, eine gelartige Nucleus pulposus durch eine lamellar Annulus fibrosis und die Zellen in diesen zwei unterschiedlichen Bereichen erfahren verschiedene Arten von Stimuli biophysikalischen umgeben2. In dieser Art von Gewebe, Zellen und der extrazellulären Matrix innerhalb der Gewebeschichten miteinander interagieren , wenn das Gewebe unterzogen wird und reagiert auf mechanische Kräfte. Rekapitulation eines solchen heterogenen Gewebestrukturen bleibt eine Herausforderung im Tissue Engineering und der regenerativen Medizin und unser Verständnis für ihre biologische Bedeutung ist begrenzt. Es besteht ein Bedarf für die Kultivierung von Plattformen für die geschichtete Gewebe sowie Co-Kulturen von verschiedenen Populationen von Zellen innerhalb eines Konstrukts analysiert. Im Gelenkknorpel Tissue Engineering , gerüstlosen Schichtaufbauten wurden durch die Nutzung der Fähigkeit der zonalen Chondrozyten zu deponieren variiert ECM zu imitieren , die verschiedenen Schichten dieses Gewebes 3,4 aufgebaut. Jedoch liefern geschichtete Hydrogels Konstrukten eine Möglichkeit für das Zusammenspiel von verschiedenen Arten von Zellpopulationen untersucht, der die Fähigkeit fehlt, unabhängig eine robuste Gewebe zu bilden. Zum Beispiel können verschiedene Populations von mesenchymalen Stammzellen können in Schichtkonstrukten co-kultiviert werden. Solche Schicht Gerüste wurden mit beiden Chondrozyten und Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen für eine verbesserte Tissue Engineering 5 verwendet. Nicht nur können unterschiedliche Zellpopulationen in ähnlicher Hydrogelschichten co-kultiviert werden, aber ein Zelltyp kann auch innerhalb der Schichten gezüchtet werden , die manipuliert wurden variierende Steifheit oder biochemische Gehalt zu haben , um verschiedene Antworten von Zellen 6,7 hervorzurufen. Viele verschiedene Biomaterial Hydrogele wurden 7-9 zu Schicht Zellpopulationen für die Knorpelgewebetechnik , wie sie unter Verwendung von Polyethylenglykol oder Polyvinylalkohol Basen verwendet. Jedoch Alginat-Hydrogele sind eine der einfachsten Biomaterialien, aus denen für die Untersuchung heterogene Zellpopulationen in Kokultur geschichtete Gerüste zu schaffen. Während Agarose Hydrogele auch leicht gebildet werden, weisen Alginat-Hydrogele den zusätzlichen Vorteil, dass einfach ist,polation von Zellen aus dem 3-D - Konstrukt für die Analyse von einzelnen Zellen , wie bereits zuvor beschrieben 10. In früheren Studien wurden zweischichtige Alginat - Hydrogele wurden in dünnen Blechen gebildet und aus diesen Folien wurden die Schnitte geschnitten (z. B. eine Biopsie Stanze verwendet wird ) für bestimmte Anwendungen , wie beispielsweise für die Analyse von biochemischen Inhalte oder Grenzflächenschereigenschaften 11,12. Ein anderes Verfahren zur Bildung dünner Blätter Alginat wurde mit dem Potential für Schichtung in mehreren Schichten beschrieben, aber dennoch würde Veränderung des Hydrogels für die Verwendung in mechanischen Prüfung 13 erfordern. Hier stellen wir ein Verfahren zur zweischichtigen Alginat Hydrogelscheiben zur Verwendung in Co-Kultivierung von verschiedenen Populationen von Zellen reproduzierbar zu schaffen. Diese Alginat-Disc-Plattform besitzt mehrere Vorteile. In erster Linie die reproduzierbare Form und die geringe Größe ist für die mechanische Stimulation der eingebetteten Zellen förderlich, ohne eine Biopsie pu erfordernnch oder andere physikalische Veränderung des Hydrogels für viele Anwendungen. Darüber hinaus bleibt die Lebensfähigkeit der Zellen während des Beschichtungsprozesses hoch, und nach der Gelbildung eine klare Trennung der beiden Zellpopulationen innerhalb des Gels ist sichtbar ohne anfängliche Überlappungsbereich.

<table><tbody><tr><td>Alginic Acid sodium salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1112</td><td>Solution made in wt% using DPBS (-/-)</td></tr><tr><td>1x Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline (-/-)</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>1x Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline (+/+)</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>11965</td><td>Example. Use desired medium type</td></tr><tr><td>Syringe Filters (0.02 &amp;#956;m Nylon)</td><td>FisherBrand</td><td>0979C</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride Dihydrate</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP510</td><td>Prepare solution in sterile water</td></tr><tr><td>Criterion Blotter Filter Paper</td><td>Biorad</td><td>1704085</td><td>Cut to size of endplates for mold formation</td></tr><tr><td>Cell Microsieve Membrane (10 &amp;#956;m pore size)</td><td>Biodesign Inc of New York</td><td>N10R</td><td>Cut to size of endplates for mold formation</td></tr><tr><td>Sodium citrate dihydrate</td><td>FisherScience</td><td>S93364</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate (EDTA)</td><td>FisherBioreagent</td><td>BP121</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&amp;nbsp;</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>26140</td><td>Used in example mesenchymal stem cell basal growth media</td></tr><tr><td>Penicilin/Streptomycin (10,000 U/ml)</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>15140</td><td>Used in example mesenchymal stem cell basal growth media</td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>25030081</td><td>Used in example mesenchymal stem cell basal growth media</td></tr><tr><td>Non-essential Amino Acids (100x)</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>11140050</td><td>Used in example mesenchymal stem cell basal growth media</td></tr></tbody></table>

layered alginate constructs: a platform for co-culture of heterogeneous cell populations

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential mechanosensing characteristics. Engineering and analysis of these tissue types remain a challenge. Layered hydrogel constructs provide an opportunity for investigating the interactions among multiple cell populations within single constructs. Alginate hydrogels are both biocompatible and allow for easy isolation of cells after experimentation. Here, we describe a method for the development of small sized dual layered alginate hydrogel discs. This process maintains high cell viability of human mesenchymal stem cells during the formation process and these layered discs can withstand unconfined cyclic compression, commonly used for stimulation of hMSCs undergoing chondrogenesis. These layered constructs can potentially be scaled up to include additional levels, and also be used to segregate cell populations initially after layering. This dual layer alginate hydrogel culture platform can be used for many different applications including engineering and analysis of cells of load bearing tissues and co-cultures of other cell types.

1 zeigt die Bildung und die Schichtung der Alginat - Hydrogele. Abgeschlossen zweischichtigen Gele zeigen eine vollständige anfängliche Trennung von Zellpopulationen , wie in 2 gezeigt. Die Lebensfähigkeit der Zellen von humanen mesenchymalen Stammzellen) eingebettet in diesen Hydrogelen und geschichtete bleibt hoch und vergleichbar mit den bulk Hydrogele wie in Figur 3 gezeigt ist . Die Lebensfähigkeit wurde bewertet nach dem Temper...

Watch this Scientific Journal Video about Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations at JoVE.com

Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct.

Layered Alginate Konstrukten: Eine Plattform für Co-Kultur von heterogenen Zellpopulationen

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

layered-alginate-constructs-platform-for-co-culture-heterogeneous

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.8K Aufrufe.  University of Maryland. Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct. 

Serie: Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

Mikrofabrizierten Plattformen für Mechanisch Dynamische Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Forschung

Biotechnik

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ovarian cancers is still in question and might be either the ovarian surface epithelium (OSE) or the distal epithelium of the fallopian tube fimbriae2,3. Culturing the normal cells as a primary culture in vitro will enable scientists to model specific changes that might lead to ovarian cancer in the distinct epithelium, thereby definitively determining the cell type of origin. This will allow development of more accurate biomarkers, animal models with tissue-specific gene changes, and better prevention strategies targeted to this disease.
Maintaining normal cells in alginate hydrogels promotes short term in vitro culture of cells in their three-dimensional context and permits introduction of plasmid DNA, siRNA, and small molecules. By culturing organs in pieces that are derived from strategic cuts using a scalpel, several cultures from a single organ can be generated, increasing the number of experiments from a single animal. These cuts model aspects of ovulation leading to proliferation of the OSE, which is associated with ovarian cancer formation. Cell types such as the OSE that do not grow well on plastic surfaces can be cultured using this method and facilitate investigation into normal cellular processes or the earliest events in cancer formation4.
Alginate hydrogels can be used to support the growth of many types of tissues5. Alginate is a linear polysaccharide composed of repeating units of &beta;-D-mannuronic acid and &alpha;-L-guluronic acid that can be crosslinked with calcium ions, resulting in a gentle gelling action that does not damage tissues6,7. Like other three-dimensional cell culture matrices such as Matrigel, alginate provides mechanical support for tissues; however, proteins are not reactive with the alginate matrix, and therefore alginate functions as a synthetic extracellular matrix that does not initiate cell signaling5. The alginate hydrogel floats in standard cell culture medium and supports the architecture of the tissue growth in vitro.
A method is presented for the preparation, separation, and embedding of ovarian and oviductal organ pieces into alginate hydrogels, which can be maintained in culture for up to two weeks. The enzymatic release of cells for analysis of proteins and RNA samples from the organ culture is also described. Finally, the growth of primary cell types is possible without genetic immortalization from mice and permits investigators to use knockout and transgenic mice.

Culture of normal cells in their three-dimensional context represents an alternative method to study early events required for cellular transformation and tumorigenesis. This method is used to grow normal ovarian and oviductal cells to study early events in ovarian cancer formation.

Alginat Hydrogele für Three-Dimensional Organ Culture der Eierstöcke und Eileitern

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening. However, the development of a mass culture system would be required for using PS cells in these applications. Suspension culture is one promising culture method for the mass production of PS cells, although some issues such as controlling aggregation and limiting shear stress from the culture medium are still unsolved. In order to solve these problems, we developed a method of calcium alginate (Alg-Ca) encapsulation using a co-axial nozzle. This method can control the size of the capsules easily by co-flowing N2 gas. The controllable capsule diameter must be larger than 500 &#181;m because too high a flow rate of N2 gas causes the breakdown of droplets and thus heterogeneous-sized capsules. Moreover, a low concentration of Alg-Na and CaCl2 causes non-spherical capsules. Although an Alg-Ca capsule without a coating of Alg-PLL easily dissolves enabling the collection of cells, they can also potentially leak out from capsules lacking an Alg-PLL coating. Indeed, an alginate-PLL coating can prevent cellular leakage but is also hard to break. This technology can be used to research the stem cell niche as well as the mass production of PS cells because encapsulation can modify the micro-environment surrounding cells including the extracellular matrix and the concentration of secreted factors.

We established a method of encapsulating pluripotent stem cells (PS cells) into alginate hydrogel capsules using a co-axial nozzle. This prevents cells from aggregating excessively and limits the shear stress experienced by cells in suspension culture. The technique is applicable to the mass production of PS cells as well as research on stem cell niche.

Alginat Encapsulation pluripotenter Stammzellen Mit einer Co-Axial Düsen

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Entwicklungsbiologie

Generation of Alginate Microspheres for Biomedical Applications

Alginate-based materials have received considerable attention for biomedical applications because of their hydrophilic nature, biocompatibility, and physical architecture. Applications include cell encapsulation, drug delivery, stem cell culture, and tissue engineering scaffolds. In fact, clinical trials are currently being performed in which islets are encapsulated in PLO coated alginate microbeads as a treatment of type I diabetes. However, large numbers of islets are required for efficacy due to poor survival following transplantation. The ability to locally stimulate microvascular network formation around the encapsulated cells may increase their viability through improved transport of oxygen, glucose and other vital nutrients. Fibroblast growth factor-1 (FGF-1) is a naturally occurring growth factor that is able to stimulate blood vessel formation and improve oxygen levels in ischemic tissues. The efficacy of FGF-1 is enhanced when it is delivered in a sustained fashion rather than a single large-bolus administration. The local long-term release of growth factors from islet encapsulation systems could stimulate the growth of blood vessels directly towards the transplanted cells, potentially improving functional graft outcomes. In this article, we outline procedures for the preparation of alginate microspheres for use in biomedical applications. In addition, we describe a method we developed for generating multilayered alginate microbeads. Cells can be encapsulated in the inner alginate core, and angiogenic proteins in the outer alginate layer. The release of proteins from this outer layer would stimulate the formation of local microvascular networks directly towards the transplanted islets.

In the following sections, we outline procedures for the preparation of alginate microspheres for use in biomedical applications. We specifically illustrate a technique for creating multilayered alginate microspheres for the dual purpose of cell and protein encapsulation as a potential treatment for type 1 diabetes.

Erzeugung von Alginat-Mikrokugeln für biomedizinische Anwendungen

Alginate-based materials have received considerable attention for biomedical applications because of their hydrophilic nature, biocompatibility, and ...

Medizin

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

Zelle Co-Kultur Strukturierung mit wässrigen Zwei-Phasen-Systeme

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue geometry. The resulting 3D hydrogel-based cellular constructs have been introduced as an alternative to animal experiments for advanced biological studies, pharmacological assays and organ transplant applications. Although hydrogel-based particles and fibers can be easily fabricated, it is difficult to manipulate them for tissue reconstruction. In this video, we describe a fabrication method for micropatterned alginate hydrogel sheets, together with their assembly to form a macro-scale 3D cell culture system with a controlled cellular microenvironment. Using a mist form of the calcium gelling agent, thin hydrogel sheets are easily generated with a thickness in the range of 100 - 200 &#181;m, and with precise micropatterns. Cells can then be cultured with the geometric guidance of the hydrogel sheets in freestanding conditions. Furthermore, the hydrogel sheets can be readily manipulated using a micropipette with an end-cut tip, and can be assembled into multi-layered structures by stacking them using a patterned polydimethylsiloxane (PDMS) frame. These modular hydrogel sheets, which can be fabricated using a facile process, have potential applications of in vitro drug assays and biological studies, including functional studies of micro- and macrostructure and tissue reconstruction.

We describe the fabrication of micropatterned hydrogel sheets using a simple process, which can be assembled and manipulated in a freestanding form. Using these modular hydrogel sheets, a simple macro-scaled 3D cell culture system can be generated with a controlled cellular microenvironment.

Bau von Modular Hydrogel Blätter für mikrostrukturierten Makro skaliert 3D Cellular Architektur

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Ultrathin Porated Elastic Hydrogels As a Biomimetic Basement Membrane for Dual Cell Culture

The basement membrane is a critical component of cellular bilayers that can vary in stiffness, composition, architecture, and porosity. In vitro studies of endothelial-epithelial bilayers have traditionally relied on permeable support models that enable bilayer culture, but permeable supports are limited in their ability to replicate the diversity of human basement membranes. In contrast, hydrogel models that require chemical synthesis are highly tunable and allow for modifications of both the material stiffness and the biochemical composition via incorporation of biomimetic peptides or proteins. However, traditional hydrogel models are limited in functionality because they lack pores for cell-cell contacts and functional in vitro migration studies. Additionally, due to the thickness of traditional hydrogels, incorporation of pores that span the entire thickness of hydrogels has been challenging. In the present study, we use poly-(ethylene-glycol) (PEG) hydrogels and a novel zinc oxide templating method to address the previous shortcomings of biomimetic hydrogels. As a result, we present an ultrathin, basement membrane-like hydrogel that permits the culture of confluent cellular bilayers on a customizable scaffold with variable pore architectures, mechanical properties, and biochemical composition.

Current bilayer culture models do not allow for functional in vitro studies that mimic in vivo microenvironments. Using polyethylene glycol and a zinc oxide templating method, this protocol describes the development of an ultrathin biomimetic basement membrane with tunable stiffness, porosity, and biochemical composition that closely mimics in vivo extracellular matrices.

Ultradünne derzei-elastischen Hydrogele als eine biomimetische Basalmembran für Dual Zellkultur

The basement membrane is a critical component of cellular bilayers that can vary in stiffness, composition, architecture, and porosity. In vitro studies ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

Dreidimensionale Alginat-Perle Kultur der Menschen Hypophysenadenom Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the interface with a liquid core. The latter is removed post-printing, leaving behind a hollow tube. Integrating an additive manufacturing technique (like the one described here with tailor-made [bio]inks, which structurally and biochemically mimic the native extracellular matrix [ECM]) is an important step towards advanced tissue engineering. However, precise fabrication of well-defined structures requires tailored fabrication strategies optimized for the material in use. Therefore, it is sensible to begin with a set-up that is customizable, simple-to-use, and compatible with a broad spectrum of materials and applications. This work presents an easy-to-manufacture core/shell nozzle with luer-compatibility to explore core/shell printing of woodpile structures, tested with a well-defined, alginate-based scaffold material formulation.

Presented here is a simple-to-use, core/shell, three-dimensional bioprinting set-up for one-step fabrication of hollow scaffolds, suitable for tissue engineering of vascular and other tubular structures.

Core/Shell DruckGerüste für Tissue Engineering von Röhrenstrukturen

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the ...

Microgel-Extracellular Matrix Composite Support for the Embedded 3D Printing of Human Neural Constructs

The embedded 3D printing of cells inside a granular support medium has emerged in the past decade as a powerful approach for the freeform biofabrication of soft tissue constructs. However, granular gel formulations have been restricted to a limited number of biomaterials that allow for the cost-effective generation of large amounts of hydrogel microparticles. Therefore, granular gel support media have generally lacked the cell-adhesive and cell-instructive functions found in the native extracellular matrix (ECM).
To address this, a methodology has been developed for the generation of self-healing annealable particle-extracellular matrix (SHAPE) composites. SHAPE composites consist of a granular phase (microgels) and a continuous phase (viscous ECM solution) that, together, allow for both programmable high-fidelity printing and an adjustable biofunctional extracellular environment. This work describes how the developed methodology can be utilized for the precise biofabrication of human neural constructs.
First, alginate microparticles, which serve as the granular component in the SHAPE composites, are fabricated and combined with a collagen-based continuous component. Then, human neural stem cells are printed inside the support material, followed by the annealing of the support. The printed constructs can be maintained for weeks to allow the differentiation of the printed cells into neurons. Simultaneously, the collagen continuous phase allows for axonal outgrowth and the interconnection of regions. Finally, this works provides information on how to perform live-cell fluorescence imaging and immunocytochemistry to characterize the 3D-printed human neural constructs.

This work describes a protocol for the freeform embedded 3D printing of neural stem cells inside self-healing annealable particle-extracellular matrix composites. The protocol enables the programmable patterning of interconnected human neural tissue constructs with high fidelity.

Mikrogel-extrazelluläre Matrix-Komposit-Unterstützung für den eingebetteten 3D-Druck menschlicher neuronaler Konstrukte

The embedded 3D printing of cells inside a granular support medium has emerged in the past decade as a powerful approach for the freeform biofabrication ...