This work was funded by The MITRE Corporation through the MITRE Innovation Program (Project 25MSR621-CA). The authors would like to thank Mark Maybury, Ph.D., Richard Games, Ph.D., James Patton, Ellen Mac Garrigle, Ph.D., Carl Picconatto, Ph.D., and Caroline Gary for their support and review of this work.

1. Herstellung von Bakterien- und Peptidoglycan Substrate Hinweis: Ganzzellbakterien Substrate und gereinigte Peptidoglykanen verwendet werden als Enzymsubstrate sowohl in der Mikrodia Diffusionstest und dem Farbstoff-Freisetzungstest. Diese Substrate erfordern Vorbereitung vor der Enzymreaktionen durchzuführen. Das folgende Protokoll beschreibt ihre Herstellung. <ol><li> Whole bakterielle Zell Substrat <ol><li> Produzieren Bakterienzellsubstrat durch Animpfen mit 500 ml Nährlösung mit einer 2 ml Übernachtkultur von Bacillus subtilis 168 (American Type Culture Collection, ATCC 23857). bei 30 ° C inkubieren unter Schütteln (125 rpm), bis die Kultur eine exponentielle Wachstumsphase erreicht, als eine schnelle Wachstumsphase definiert, in der Verdoppelung der Bakterienkultur resultiert. Für die Kultivierung von Salmonella enterica subsp. Enterica (ATCC 10708), verwenden Nährbrühe als Wachstumsmedium bei 37 ° C unter Schütteln (125 rpm). </li&gt; <li> Hitze töten jede Kultur durch 10 min Autoklavieren bei 121 ° C unter 3 atm Druck. </li><li> Ernten Sie die Hitze abgetötete Bakterien-Substrat durch Zentrifugation für 20 min bei 5.000 x g. Waschen Sie das Pellet dreimal mit Typ 1 Wasser und Resuspendieren in einer minimalen Menge Wasser. In dieser Studie unterbrechen die Substrate in 1200 ul. </li><li> Aliquot 300 ul der Bakterienzellsubstrate zu 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und lagern bei 20 ° C. </li></ol></li><li> Gereinigtes Peptidoglycan Substrat <ol><li> Reinige Peptidoglycan aus dem Zielsubstrat Bakterium 7-10 oder zu erwerben , von einem Anbieter (siehe Materialien und Geräte Tabelle). Reinige rohe peptidoglycan Präparate aus Zubehörzellwandpolymere. </li></ol></li></ol> 2. Qualitative Mikrodia Diffusionstest [Geändert von Lachica, et al. 11] Hinweis: Der Mikroobjektdiffusionsassay istein qualitatives Verfahren zur in einer Probe die Anwesenheit von antimikrobiellen Enzym zu detektieren. Da das Enzym durch eine Agarose-Matrix enthält Substrat diffundiert, entwickelt sich eine Zone von Clearing als das Enzym das Substrat hydrolisiert. Das folgende Protokoll beschreibt die Herstellung und Leistung des Mikroobjektdiffusionsassay für qualitativ die Anwesenheit von Protein antimikrobiellen Mitteln zu detektieren. <ol><li> Bestimmung der Konzentration des antimikrobiellen Enzym zu evaluierenden eine Bicinchoninsäure (BCA) Protein Assay Kit nach Herstellerprotokoll. </li><li> Verwenden phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) als Enzympuffer; jedoch empirisch den Puffer angemessen für das jeweilige Enzym bestimmen. </li><li> Durchführen einer seriellen Verdünnung der antimikrobiellen Enzym Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) als Reaktionspuffer. Die serielle Verdünnung in diesen Mikrodia Diffusions Assays verwendet produziert endgültigen Testproteinmassen von 0 pg, 10 pg, 100 pg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 1 &amp; mgr; g und 10 ug pro Reaktionsvolumen. </li><li> Dispense Proteinmassen in einzelne Mikrozentrifugenröhrchen und stellen Proteinmengen bis 20 &amp; mgr; l unter Verwendung von PBS in Vorbereitung für das Hinzufügen Reaktionsvertiefungen zu Mikrodia. </li><li> Machen Sie eine 0,5% Agarose-Lösung durch Auflösen von 0,25 g Agarose in 50 ml PBS. Die Lösung wird zum Sieden, bis die Agarose vollständig gelöst ist. Bestimmen Sie Wasser während des Schmelzprozesses durch Gewicht verloren und zu der Lösung zurück. </li><li> Werden 50 ul 10% Natriumazid in Wasser zu der Agarose-Lösung und Einstellen der Temperatur der Lösung auf 50 ° C in einem Wasserbad. Das Natriumazid zugegeben während der Inkubation des Mikroobjektdiffusionsassay bakterielles Wachstum kontaminierender zu hemmen. Wenn lebende Zellen als Substrat verwendet werden, lassen Sie das Natriumazid aus der Agarose-Lösung. </li><li> Auftauen durch Hitze abgetötete Bakterien Substrat auf Eis. </li><li> Re-suspendieren des bakteriellen Substrat in 12 ml der Agarose-Lösung auf etwa die Trübung einer 2,0 McF übereinarland Äquivalenz - Standard (siehe Materialien Tabelle). Vergleichen Sie die Trübungen der Lösungen durch eine schwarze Linie auf weißem Hintergrund durch die Lösungen zu visualisieren, das Hinzufügen bakterielle Substrat zu dem Agarose, bis die ungefähre Trübung erreicht wird. </li><li> Pipettieren sofort 3 ml der Agarose-Substratlösung zu jedem Mikroobjekt (25 x 75 x 1 mm 3). </li><li> Nachdem die Objektträger zu verfestigen, Punsch drei Brunnen in der Agarose-Substratschicht jedes Mikrodia eines Korkbohrers (4,8 mm Durchmesser) verwenden. In 20 ul jeder eingestellten Protein serielle Verdünnung auf ihre jeweiligen Vertiefungen. </li><li> Verwenden PBS (20 ul) oder Rinderserumalbumin (5 ug in 20 ul PBS) in einer negativen Kontrollvertiefung. Verwenden bekannt bakteriolytischen Enzyme geeignet für das Substrat, beispielsweise Lysozym, als eine positive Kontrolle. </li><li> Inkubieren der Objektträger in einer feuchten Kammer bei 37 ° C oder die optimale Aktivierungstemperatur des Enzyms. Die Länge der Inkubation ist abhängig von der Konzentration undspezifische Aktivität des antimikrobiellen Enzyms. Eine typische Reaktionszeit ist über Nacht (ca. 16 h). </li><li> Nach der Inkubation beobachten die Folien unter indirektem Licht und die Aufnahmen des Entwicklungs Assay eine digitale Spiegelreflexkamera mit einem 60-mm-Objektiv mit einer Brennweite von ca. 30 cm verwendet wird. Anmerkung: Die enzymatische Aktivität des Proteins antimikrobielle für das gegebene Substrat wird mit der Entwicklung einer klaren Zone der Hydrolyse korreliert, die um das Bohrloch bildet, wie das Enzym in die Agarose diffundiert. </li><li> Um die enzymatische Aktivität zu qualifizieren, beachten Sie die Größen der Zonen, die gut um jeden bilden. Hohe enzymatische Aktivität bezieht sich qualitativ auf eine größere Zone, während niedrige enzymatische Aktivität qualitativ zu einem kleineren Bereich bezieht. </li></ol> 3. Substrat Beschriften - Remazol Brilliant Blue R Dye Labeling [Geändert von Zhou 12] Anmerkung: In dem Farbstoff-Freisetzungsassay ist das Substrat kovalent linked REMAZOL Brillantblau R-Farbstoff. Das folgende Protokoll beschreibt die Herstellung von gefärbten Enzymsubstrate. <ol><li> Machen Sie eine 250 mM Natriumhydroxid (NaOH) Lösung durch Auflösen von 1 g NaOH in 99 ml Typ I Wasser werden zur Herstellung einer 200 mM Remazol Farbstoff Brillantblau R (RBB) Lösung eingesetzt. </li><li> Machen Sie eine 200 mM RBB-Lösung durch Auflösen von 1,25 g RBB in 98,75 ml ± 1 ml einer frischen 250 mM NaOH-Lösung (Schritt 3.1). </li><li> Hitze abgetöteten Bakterienzellen bei einer Konzentration von 0,5 g Naßgewicht in 30 ml RBB Lösung Re-suspendieren. Für gereinigte Peptidoglycan, resuspendieren die Peptidoglycan in einer Konzentration von 0,3 g Naßgewicht in 30 ml RBB-Lösung. </li><li> Inkubieren des Reaktionsgemisches in einem Erlenmeyerkolben auf einer rotierenden Plattform für 6 h bei 37 ° C unter vorsichtigem Mischen. </li><li> Übertragen das Reaktionsgemisch auf eine 4 &amp; deg; C-Inkubator, und Inkubation für weitere 12 h unter vorsichtigem Mischen. </li><li> Nach der Inkubation ernten das gefärbte Substrat durch Zentrifugation bei 3000 · gfür 30 min. Man dekantiert die Farbstofflösung aus dem Substrat Pellets. </li><li> Entfernen nicht-kovalent gebundene lösliche Farbstoff aus der Substrate durch Waschen der farbstoffmarkierten Zellen oder Peptidoglycan wiederholt (etwa 3-5 Waschungen) mit Typ I Wasser, gefolgt von Zentrifugation. Mit jeder Wasserzugabe wieder aussetzen gründlich das Pellet. Hinweis: Wenn Sie nicht gebundenen, löslichen Farbstoff in der Wasserwäsche nach dem Zentrifugieren nicht mehr sichtbar ist. Das Substrat sollte eine zusätzliche Wäsche gegeben werden. Beachten Sie, dass das Substrat blau bleiben wird, während der Überstand der letzten Wäsche klar sein wird. </li><li> Speichern der gefärbten Substrate in einer minimalen Menge Wasser bei -20 ° C suspendiert für die spätere Verwendung. </li></ol> 4. Quantitative Dye-Release-Assay Anmerkung: Während der Farbstoff-Freisetzungsassays, die Hydrolyse von RBB-gefärbtes Substrat in der enzymatischen Reaktion Meldungen Produkte in die Reaktionsüberstand gefärbt. Kolorimetrische Messung der Menge an Farbstoff freigesetzt zeigt die amount der enzymatischen Aktivität, die innerhalb der Probe für ein bestimmtes Enzym. Die quantitative Methode erlaubt den Vergleich verschiedener Enzyme auf Substrate und ermöglicht eine Variation der Umgebungsbedingungen um die enzymatische Reaktion zu beeinflussen (zB Temperatur, Salzgehalt und pH - Wert). Das folgende Protokoll beschreibt die Herstellung und Leistung des Farbstoff-Freisetzungsassay zur quantitativen Bestimmung der enzymatischen Aktivität von Protein antimikrobiellen Mitteln zu detektieren. <ol><li> Testvorbereitung Farbstoff-Freisetzung <ol><li> Erlauben es dem gefrorenen gefärbten Substrates auf Raumtemperatur zurückkehren und zweimal mit Assaypuffer (PBS) waschen, die empirisch für die gegebene Enzym bestimmt wird. </li><li> Berechnen des Volumens der Substratsuspension, die durch Multiplizieren der 200 &amp; mgr; l Reaktionsvolumen durch die Anzahl der Farbstofffreisetzungsassays benötigt wird, durchgeführt werden. </li><li> Vorbereiten der Substratsuspension durch gefärbten Substrates zum Volumen des Assaypuffer Zugabe, bestimmt in 4.1.2, bis eine optische Dichte (OD) von 2,0 bei 595 nm unter Verwendung eines Spektrophotometers erreicht. Bleiben innerhalb der funktionellen Grenzen des Spektrophotometers, messen die 2,0 OD 595 als 1,0 für eine 1: 1 - Verdünnung der konzentrierten Lösung. Verwenden Sie Testpuffer als leer. Hinweis: Das Substrat Trübung für die Reaktion kann über 2,0 angehoben werden, um die Aktivitätsniveaus von hoch effizienten Enzymen passen. </li><li> Suspendiere das Protein antimikrobielle werden in Assaypuffer bei einer geschätzten Konzentration von 1 mg / ml bewertet. </li><li> Verwendung des Mikroplatten-Assay eines BCA Protein Assay Kit nach Herstellerprotokoll entsprechend bestimmen die tatsächliche Konzentration der Proteinprobe untersucht werden. Stellen Sie die Konzentration der Stoffsuspension zu 1 mg / ml Testpuffer verwendet. </li></ol></li><li> Unter Verwendung des Dye-Release-Assay, um die optimale Inkubationsbedingungen Bestimmen Sie für ein Protein Antimicrobial <ol><li> Von der Stamm Protein antimikrobielle Suspension auf 100 ng / ul. Diese Konzentration gibt afMasse inal Reaktion von 1 ug Protein pro Volumen (10 ul) hinzugefügt, um die Testreaktion. </li><li> Ermitteln des thermischen Bereich für das bakteriolytisch Protein zu bewerten. Der thermische Bereich in diesen Assays eingeschlossen 5 ° C, 15 ° C, 25 ° C, 35 ° C, 45 ° C, 55 ° C und 65 ° C. </li><li> Führen Sie die Reaktionstests in 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Für jeden thermischen Zustand, mit 10 &amp; mgr; l des Aktien Protein zu 200 ul der vorbereiteten Substratsuspension. </li><li> Inkubiere in einem Thermozykler für 8 h unter Mischen durch Inversion einmal pro Stunde. </li><li> Nach der Inkubation verhaften die Reaktionen durch Zugabe von 25 &amp; mgr; l Ethanol. </li><li> Entfernen unverdauten, unlösliches Substrat durch Zentrifugation bei 3000 × g für 2 min und übertragen 150 &amp; mgr; l des Reaktionsüberstand für jede Reaktionsmischung auf eine 96-Well-Flachboden-Mikroplatte, dabei nicht des Pellets von unverdauten Substrat zu stören. </li><li> Messung der enzymatischen Aktivität des Proteins Antimicrobial für das gegebene Substrat durch die Menge an löslichem Farbstoff RBB Bestimmung dissoziiert von dem Substrat nach der enzymatischen Hydrolyse. Um die enzymatische Aktivität zu quantifizieren, messen die Absorption des Überstands bei 595 nm im Mikrotiterplatten-Spektrophotometer verwendet wird. Erhöhte Absorption durch den Farbstoff löslich in den Überstand von dem markierten Substrat freigesetzt ist eine quantitative Messung der enzymatischen Aktivität. Hinweis: Die Änderung der Absorption von Aktivitätseinheiten (AU) dargestellt wird, wobei 1 AU Ergebnisse in einer 0,01 Zunahme der optischen Dichte der Farbstofffreisetzungsreaktion Überstand bei 595 nm. Eine Blindreaktion, wobei alle Reaktionskomponenten außer Enzym inkubiert wird verwendet, um alle Farbstoff zu subtrahieren, die durch die Inkubation aus der RBB-markiertes Substrat freigibt. Die optimale enzymatische Temperatur liefert die Spitzenaktivität Einheit Messung. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 4.2.1 bis 4.2.7 verschiedene Inkubationspuffer verwendet, um die optimalen Pufferbedingungen für die antimikrobielle Enzyms zu bestimmen. in tiese Assays verwenden PBS. </li></ol></li><li> Unter Verwendung des Dye-Release-Test zur Bestimmung der minimalen Wirkstoffkonzentration bei der optimalen Inkubationstemperatur für ein Protein Antimicrobial <ol><li> Führen Sie eine serielle Verdünnung der Stamm antimikrobiellen Proteinsuspension unter Verwendung von Assay-Puffer. Die Verdünnungsreihe Bereich wird mit der Aktivität des antimikrobiellen Enzym variieren. Die serielle Verdünnung in diesen Assays verwendet hergestellten endgültigen Testproteinmengen von 0 pg, 10 pg, 100 pg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 1 ug und 10 ug. </li><li> Führen Sie jede Reaktionstest in einer 48-Well-Flachboden-Mikrotiterplatte. Für jeden Test erhalten, fügen Sie 10 ul der jeweiligen Proteinsuspension zu 200 ul der vorbereiteten Substratsuspension. Einstellen Variation des Volumens der Proteinlösung zu dem Reaktions bis 10 &amp; mgr; l Reaktionspuffer verwendet. </li><li> Verschließen Sie die Mikrotiterplatte mit Plattensiegelfolie Volumenänderung durch Verdunstung zu vermeiden. Inkubieren in einem Schüttelinkubator bei der ermittelten optimalen incubation Temperatur für die gegebene Protein antimikrobielle für 16 Stunden unter Schütteln. </li><li> Nach der Inkubation verhaften, die Reaktion durch 25 &amp; mgr; l Ethanol Zugabe zu jeder Vertiefung und entfernen unverdaute Substrat durch Zentrifugation bei 3000 × g für 2 min. </li><li> Übertragung von 150 &amp; mgr; l des Reaktionsüberstand für jede Reaktionsmischung auf eine 96-Well-Flachboden-Mikroplatte, dabei nicht des Pellets des unverdaute Substrat zu stören. </li><li> Um die enzymatische Aktivität zu quantifizieren, messen die Absorption des Überstands bei 595 nm im Mikrotiterplatten-Spektrophotometer verwendet wird. Eine Blindreaktion, wobei alle Reaktionskomponenten außer Enzym inkubiert wird verwendet, um alle Farbstoff zu subtrahieren, die durch die Inkubation aus der RBB-markiertes Substrat freigibt. Erhöhte Absorption durch den Farbstoff löslich in den Überstand von dem markierten Substrat freigesetzt liefert ein quantitatives Maß der enzymatischen Aktivität. Hinweis: Die Änderung der Absorption von Aktivitätseinheiten (AU) dargestellt wird, wobei 1 AU Ergebnisse ina 0,01 Erhöhung der optischen Dichte der Farbstofffreisetzungsreaktion Überstand bei 595 nm. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben. Die MITRE Corporation ist eine not-for-Profit-Unternehmen, das mehrere staatlich finanzierten Forschungs- und Entwicklungszentren (FFRDCs) tätig ist.

Der Mikrodia Diffusionstest und der Farbstoff-Freisetzungstest bieten Vorteile für den Nachweis und die zuvor nicht identifizierte Protein antimikrobielle Substanzen zu charakterisieren. Diese schnelle und empfindliche Methoden ermöglichen Hochdurchsatzscreening von Organismus-Source-Bibliotheken für die Identifizierung von Enzymen von Interesse vor der größeren Forschungsressourcen zu investieren. Als Hochprofil Zielenzyme identifiziert sind, können Variationen der Nachweistests verwendet werden, um schnell das Enzym nachzuweisen oder biochemischen Eigenschaften des Enzyms zu bestimmen. Zum Beispiel kann der Mikroobjektdiffusionsassay erkennen während eines vielstufigen Proteinreinigungsschema, schnell Fraktionen, die das Enzym von Interesse enthält. Zusätzlich Reaktions optima für das Enzym kann durch Änderung der Reaktionspuffer und Inkubationstemperaturen in dem Farbstoff-Freisetzungstest bestimmt werden. Der Bereich der Enzymmasse erforderlich für die Detektion in dem Mikroobjektdiffusionsassay ist eine Funktion der Enzym CHARAKTERIstics. Detektions Einschränkungen des Assays erfordern im allgemeinen die Verwendung von höheren Mengen an Enzym als die Farbstoff-Freisetzungsassay. In dieser Studie wurde ein Vergleich der Nachweisgrenzen des Mikroobjektdiffusionstest (Figur 1) zu dem Farbstoff-Freisetzungs - Assay (Figur 4) veranschaulicht , dass der Mikroobjektdiffusionstest eine weniger empfindliche Technik ist als der Farbstoff-Freisetzungsassay ist. Wenn Enzymkonzentration kein Problem ist, kann der Mikrodia Test für schnelle anfängliche Screening von Bibliotheken für die Herstellung von Protein antimikrobielle Wirkstoffe gegen Zielsubstrate mit geringer Arbeit und Ausrüstung verlangt. Obwohl mehr Aufwand und Ausrüstung erfordern, wird das Farbstoff-Freisetzungs-Assay empfindlicher und reproduzierbarer und ergab quantitative Ergebnisse, die einen Vergleich zwischen Farbstofffreisetzungstests der gleichen oder verschiedene Enzyme für ein gegebenes Substrat zu ermöglichen. Die beiden Methoden sind leicht für hoch spezialisierte Instrumentierung, ohne dass in den meisten mikrobiologischen Laboratorien durchgeführt. In der Vertretive Assays, die Steuer Enzym α-Chymotrypsin, wurde bei Mengen so niedrig wie 100 ng (Abbildung 5) unter Verwendung der Farbstofffreisetzungsassay detektiert wird , während die minimale Menge in dem Mikroobjektdiffusionsassay detektiert 1 &amp; mgr; g (Daten nicht gezeigt). Bereitstellen Brauchbarkeit als qualitative Nachweistest für antimikrobielle Enzyme, wurden eine Reihe von Variationen des Diffusionstest wurden 11,13 gemeldet. Bei der Überprüfung dieser Assays wurde die Mikroobjektdiffusionsassay für seine relativ hohe Empfindlichkeit als Anfangsbild und für seine einfache Reaktions Einhaltung entwickelt. Modifizierte aus der Arbeit von Lachica et al. 11, bei der Agarose - Overlays wurden verwendet , um die Produktion von Nukleasen durch Stämme von Staphylococcus aureus zu erfassen, arbeitet der Mikroobjektdiffusionstest ähnlich zu der radialen Immundiffusionsverfahren 14 , wie das Protein aus dem Bohrloch in das diffundiert Agarose, enthaltend das Substrat. Die radiale immunodiffusion Verfahren hält die Ausdehnung der Zone der Immunpräzipitation, wenn das System eine komplexe Bildung Gleichgewicht zwischen dem diffundierenden Antigen und Antikörper in der Agarose erreicht. Im Gegensatz dazu ist das Substrat des Mikroobjektdiffusionsassay anfänglich durch die diffundierende Protein antimikrobielles in einer ständig wachsenden Zone der Lyse umgebenden gut verdaut. Der zunehmende Durchmesser der Zone fortgesetzt, bis die Enzymaktivität oder das Substrat verliert erschöpft ist. Die Rate der Erzeugung der Zone der Lyse wird als die Reinheit beschleunigt und damit die spezifische Aktivität des Enzyms oder der Konzentration des Enzyms zu den gut zunimmt zugegeben. Für die enzymatische Aktivität von Protein antimikrobielle Mittel gegen Hitze abgetöteten B. quantitativ beurteilen subtilis, wobei das Farbstoff-Freisetzungsassay wurde ausgewählt. Kolorimetrische Assays Remazol Farbstoff Brillantblau R (RBB) mit -markierten Substraten vielseitig und sensibel Bewertung von Protein antimikrobiellen activi erlaubenty. Enzymatische Hydrolyse von RBB-markiertes Substrat führt zur Freisetzung von löslichen blauen Produkte, die leicht durch ein Spektrophotometer bei 595 nm gemessen werden kann. Mehrere Variationen des RBB Farbstoff-Freisetzungstest, andere Protein antimikrobielle Enzyme zur Charakterisierung entwickelt, zeigen die Flexibilität dieses Tests für die Anwendung mit anderen Substraten. Zum Beispiel, um die Auswirkungen von Lysostaphin bakteriolytisch Aktivität bei der Bestimmung, Zhou et al., Berichtet ein Farbstoff-Freisetzungstest RBB-gefärbten Staphylokokken - Zellen und Staphylokokken peptidoglycan als Substrate 12 verwendet wird . In einer Abwandlung der Anwendung dieses RBB Farbstoff-Freisetzungstest, Micrococcus-RBB markierte luteus Substrat wurde für die Verwendung als schnelle und empfindliche Mittel vorgeschlagen zu diagnostizieren und Bildschirm für Krankheiten wie bakterielle Infektion und das Vorhandensein eines bösartigen Karzinom, dem die menschliche Lysozym - Expressionsniveaus im Blutserum 15 korreliert werden. Darüber hinaus RBB-markierte Bakterienzellsubstrate haben eineLSO wurde in einem Zymogramm Verfahren zum Nachweis von Lysozym 16 verwendet. Wir zeigen die Nachweisgrenze gesenkt, Bequemlichkeit und Reproduzierbarkeit des Farbstoff-Freisetzungstest, so dass für eine schnelle Bibliothek-Screening für die Enzymproduktion. Modifikationen des Assays ermöglichen nachgeschalteten quantitative biochemische Charakterisierung Assays, einschließlich der Auswirkungen von Temperatur, pH und Salzgehalt , sowie die Auswirkungen anderer proteolytischer Enzyme auf die Aktivität von antimikrobiellen Proteinen 6. Darüber hinaus kann die quantitative Farbstofffreisetzungsassay verwendet werden, die Aktivitäten mehrerer Enzyme, die für ein gegebenes Substrat zu vergleichen. Der RBB Farbstoff-Freisetzungstest wurde auf die Charakterisierung und Nachweis von Protein antimikrobielle Mittel zusätzlich Dienstprogramm für Enzyme mit Aktivität gegen Polysaccharide berichtet. Pettersson und Eriksson berichtet einen Test zum Nachweis von Endoglycanase Aktivität unter Verwendung von amorphen, RBB-gefärbten Polysaccharidkügelchen aus Cellulose, Xylan, Mannan und Chitin 17. In einer Erweiterung dieser Feststellungen, ein empfindliches Verfahren zum Nachweis von Chitinase von Bacillus thuringiensis Bt-107 produzierten Enzyme wurde 18 unter Verwendung von kolloidalem Chitin , markiert mit RBB entwickelt. Aus diesen und anderen Studien, im Handel erhältliche Quellen von RBB-gefärbten Substrate wurden für die Verwendung beim Nachweis von glykolytischen Aktivität, einschließlich solcher gegen Keratin, Amylopektin, Amylose, Glycogen, Laminarin, D-Xylan, Azo-barley Glucan und Stärke entstanden. In dieser Studie zeigen wir die Nützlichkeit des Farbstoff-Freisetzungs-Assay in einem Mikroplattenformat, das Volumen des RBB-markiertem Substrat und Enzym erforderlich ist, reduziert die kolorimetrische Ergebnis zu erzeugen. Wie in 4 veranschaulicht und Figur 5 stellt die Mikrotiterplatte Farbstofffreisetzungsassay eine untere Nachweisgrenze als die Mikroobjektdiffusionsassay für die enzymatische Aktivitätserkennung. Im Hinblick auf den schnellen Einsatz, die Erhaltung der Arbeit und der Leichtigkeit der Interpretation, die microslide Diffusionsassay liefert Dienstprogramm in anfänglichen Hochdurchsatz-Screens für die Anwesenheit antimikrobieller Aktivität sowie die Angabe des antimikrobiellen Proteins in Anwesenheit nachgeschalteten Protein Isolierungs- und Reinigungsschritte. Die Kombination dieser beiden Assays ergänzen sich in der ersten Screening und ultimative Charakterisierung neuartiger Protein antimikrobielle Wirkstoffe

Antimicrobial agents play an essential role in targeting a wide range of microorganisms such as viruses, fungi, and bacteria. The antimicrobial activities produced by various bacteria range in target specificity from broad-spectrum to species-specific, including clinically relevant bacterial pathogens 1. In nature, protein antimicrobial compounds like bacteriocins and lysins represent a microbial arsenal of tools for self-defense, replication, and nutrient acquisition 2,3. Serving as mediators of population dynamics within microbial communities, protein antimicrobials provide a competitive advantage to the producing organism over nonproducing, sensitive species 4. As recombinant enzymes and probiotics, these proteins also have an economic and societal importance as the need for new sources of pathogen control increases with each new expansion of antimicrobial resistance within the bacterial population 5.
The first evaluations of newly discovered protein antimicrobials include determining the basic physical characteristics that are inherent to the enzyme. Methods for rapid screening of potential antimicrobials allow selection of candidates with hydrolytic activities against the desired target substrates. The microslide diffusion assay and the quantitative dye-release assay allow for the use of a variety of substrates in the detection of enzymatic hydrolysis. For protein antimicrobial enzymes with activity against the bacterial cell wall, the versatility of these assays allow rapid and effective, qualitative and quantitative screening against viable bacterial cells (microslide assay only), heat-killed whole bacterial cell substrates, or purified peptidoglycan from the target bacterium. These assays have utility in antimicrobial enzyme discovery for use in fields such as alternative therapeutics, food supplements, and inhibitors of biofilm production.
The microslide diffusion assay and the dye-release assay are demonstrated methods for detection and characterization of novel protein antimicrobials. The microslide diffusion assay provides a relative (qualitative) estimate of antimicrobial activity and allows for minimal inference of enzyme concentration and activity. Using this method, activity is readily visualized as the development of a zone of lysis with the absence of activity resulting in a lack of zone formation. The rate of zone development and the zone diameter are indicative of the amount and purity of the enzyme present in the sample; however, this rate and the quality of the substrate clearing within the zone can also be affected by the presence of contaminants, the completeness of the hydrolysis reaction, and the type of substrate. Interfering contaminants can affect the rate of enzyme diffusion from the well, while incomplete hydrolysis or variation of the substrate type can result in a turbid zone of lysis 6.
The dye-release assay quantitatively assesses the amount of covalently-linked Remazol brilliant blue R dye products released into the reaction supernatant from the enzymatically hydrolyzed substrate. The method has only slight variability associated with a difference in substrate, thus allowing greater sensitivity for detection of hydrolysis as compared to the microslide diffusion assay. These properties allow the method to have utility in the characterization of biochemical properties of the enzyme and in the standardization of the assay for comparison between different antimicrobial enzymes.
In this protocol, we provide methods to perform the basic microslide diffusion assay and dye-release assay, while demonstrating the scale of detection limits and variability for each. The assays are used to perform basic evaluations of an unknown protein antimicrobial purified from the culture supernatant of an uncharacterized soil bacterial isolate. Observed activities against bacterial cell substrates within the assays allow comparison of reaction activities between a previously uncharacterized protein antimicrobial and &#945;-chymotrypsin, a control proteolytic enzymes. These protocols provide a foundation for the application of the two techniques that can be expanded and modified to accommodate varied applications.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>48-well flat-bottom microplate with low evaporation lid</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>3078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well flat-bottom microplate (Costar 3595)</td>
			<td>Corning, Inc.</td>
			<td>3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP162-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-chymotrypsin</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>215227205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacillus subtilis 168</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>23857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cork borer</td>
			<td>Humboldt</td>
			<td>H-9661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McFarland equivalence standard (2.0)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>R20412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microslides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-38-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nutrient broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25959B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peptidoglycan of Bacillus subtilis 168</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>69554-10MG-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline (1&#215;)</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>P0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy HT microplate spectrophotometer</td>
			<td>BioTek Instruments, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Remazol brilliant blue R dye (RBB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmonella enterica subsp. enterica</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>10708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S227-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titer Tops pre-cut adhesive polyethylene film</td>
			<td>Diversified Biotechnology</td>
			<td>T-TOPS-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agarose solution 
			50 ml PBS 
			0.25 g agarose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 10% sodium azide to the molten PBS/agarose solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nutrient broth medium 
			4 g nutrient broth 
			500 ml Type I water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250mM sodium hydroxide (NaOH) solution 
			1 g NaOH 
			99 ml Type I water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200mM Remazol brilliant blue R dye (RBB) 
			1.25 g RBB 
			98.75 ml 250 mM NaOH solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

qualitative and quantitative assays for detection and characterization of protein antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Der Mikrodia Diffusionstest und die quantitative Farbstoff-Freisetzungstest sind wirksame Methoden für das Screening und erste Untersuchungen neuer Protein antimikrobielle Substanzen zu messen. Jeder Test hat Vorteile und Grenzen; aber wenn sie in Verbindung durchgeführt werden, ermöglichen sie schnelle anfängliche Screening und die grundlegende Charakterisierung eines antimikrobiellen. Der Mikrodia Diffusionstest ermöglicht es effizient für das schnelle Screening von mikrobiellen Bibliotheken, Protein antimikrobielle Substanzen produzieren. Wenn die Enzymkonzentration bedenklichen Werte sind, die Empfindlichkeit der Detektionsbeschränkungen kann der Test zu begrenzen, eine größere Menge an Enzym erforderlich, um die Reaktion hinzugefügt werden und als der Farbstoff-Freisetzungsassay. Wie in Abbildung 1 dargestellt ist , erlauben die qualitativen Eigenschaften des Assays der Beobachter relativ Enzymmengen und innerhalb jeder Gegenwart zu vergleichen. 1A (25 &amp; mgr; g Enzym), zeigt die Vorderkante der Zone trübe oder unvollständige Lyse des Substrats, während die Zone zur nächsten gut zeigt ein vollständigeres Substrat Lyse. Dieses Phänomen, das ein Produkt der abnehmenden Konzentration des streuenden Enzyms an der Vorderkante, erschwert die genaue Messung der Zonendurchmesser. Da die Vertiefungen B (15 &amp; mgr; g), C (10 ug), D (5 ug), E (1,0 ug) und F (0,1 &amp; mgr; g) in 1 beobachtet werden, verflüchtigt sich der Durchmesser der Zone der vollständigen Lyse Extinktion die reduzierte Menge des Enzyms korreliert. Für Zustand F (0,1 &amp; mgr; g) ist die Enzymkonzentration in der Agarose unter der Grenze, die die Diffusions Enzym erlauben wird, sichtbar gemacht werden, wie es durch die Agarose sich bewegt, um das Substrat zu hydrolysieren. Der Mikrodia Diffusionstest wurde durchgeführt , auch gereinigte Bacillus subtilis Pepti mitdoglycan als Substrat (Abbildung 2). Während die Zone als die mit ganzen Zelle Salmonella enterica , um die Reluktanz des Peptidoglycan aufgrund beobachtet weniger definiert ist , gleichmäßig in der Agarose suspendieren, ist die Hydrolyse des Peptidoglycan durch die unbekannte antimikrobielles Enzym offensichtlich. Der Farbstoff-Freisetzungs-Assay ist ein empfindlicher und vielseitiger Test als der Mikrodia Diffusionstest, eine niedrigere Nachweisgrenze und Variation von Umweltfaktoren ermöglicht die Enzymreaktion zu beeinflussen. In den repräsentativen Assays wurde, die Temperatur , die optimale Temperatur für die antimikrobiellen Enzyms zu bestimmen variiert, bestimmt 35 ° C in PBS werden (Abbildung 3). Dieses Optimum wird als erhöhte Mengen an blauen Farbe (3B) sowie dargestellt in Aktivitätseinheiten , abgeleitet von Absorptionsmessungen bei 595 nm (3A) deutlich in den Reaktionsüberstand gesehen. DasVielseitigkeit des Farbstoff-Freisetzungsassay erlaubt es dem Forscher nicht nur die Temperaturen variieren, aber die Reaktionspuffer und Pufferkomponenten auch eine optimale Inkubationsbedingungen für ein gegebenes Enzym schnell zu bestimmen. Das Aktivitätsniveau des unbekannten antimikrobiell Enzym (Abbildung 4) und der α-Chymotrypsin Steuer Enzym (Figur 5) wurden in der bestimmten optimalen Inkubationstemperatur von 35 ° C in PBS gegen RBB-markiertem Bacillus subtilis hitzegetöteten Substrat gemessen. Vergleich der Ergebnisse von 4 und 5 zeigt an, daß das unbekannte antimikrobielles Enzym hat fast die doppelte Affinität für die B. subtilis Substrat. Darüber hinaus hat die α-Chymotrypsin Kontrolle nicht vollständig verdauen die durch Hitze abgetöteten B. subtilis Substrat innerhalb der Vertiefung (Daten nicht gezeigt). Die Aktivität der α-Chymotrypsin Steuerung beginnt zu plattierenau rund 0,3 ug im Vergleich zu der fortgesetzten Anstieg der Aktivitätseinheiten in allen Enzymmengen für das unbekannte antimikrobielle Enzym (Abbildung 4 und Abbildung 5). Dies kann darauf hindeuten , dass das unbekannte Enzym eine größere anhaltende Aktivität aufweist oder , dass es eine größere Anzahl von Spaltstellen zur Verfügung zu dem Enzym innerhalb der B. subtilis Substrat. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53819/53819fig1.jpg" /> Abb . 1: Enzymaktivität gegen Salmonella enterica Ganze Zellsubstrat Der Mikrodia Diffusionstest wurde verwendet , um die Aktivität eines unbekannten Proteins antimikrobielle gegen Hitze abgetötete Salmonella enterica subsp qualitativ bewerten ente (ATCC 10708).. Die Proteinmassen des unbekannten antimikrobiell suspendiert in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), die zu den jeweiligen Vertiefungen zugegeben wurdendie Folien enthalten 25 ug (gut A), 15 &amp; mgr; g (gut B), 10 &amp; mgr; g (gut C), 5 ug (gut D), 1 &amp; mgr; g (gut E) und 0,1 ug (gut F). PBS allein wurde für die negativen Kontrollen der Assays verwendet. Zonen der Lyse nach einer 6 - stündigen Inkubation abgebildet wurden. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53819/53819fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53819/53819fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53819/53819fig2.jpg" /> Fig . 2: Enzym - Aktivität gegen Bacillus subtilis Zellwand - Peptidoglycan Der Mikroobjektdiffusionsassay wurde verwendet , um qualitativ die Aktivität eines unbekannten Proteins antimikrobiell gegen Peptidoglycan von Bacillus subtilis 168 auszuwerten. Suspendiert in 20 &amp; mgr; l PBS, 10 &amp; mgr; g des unbekannten antimikrobiell wurde gut A der Mikroobjekt zugegeben. PBS allein wurde als negative verwendetKontrolle für den Test (gut B). Die Zone der Lyse nach einer 6-stündigen Inkubation bei 37 ° C abgebildet wurde. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53819/53819fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53819/53819fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53819/53819fig3.jpg" /> Fig . 3: Optimale Reaktionstemperatur für ein Protein Antimicrobial Die Vielseitigkeit des Farbstoff-Freisetzungsassay erlaubt die Veränderung der physikalischen und chemischen Parameter, wie Inkubationstemperaturen und Puffer, um deren Einflüsse auf die Aktivität des Enzyms von Interesse 6 bestimmen. Wie in dieser Figur dargestellt ist , die Aktivität des unbekannten Proteins antimikrobielle (1 ug) wurde in PBS gegen RBB-markiertem Hitze abgetöteten Bacillus subtilis unter verschiedenen Inkubationstemperaturen ausgewertet. Angezeigt als Aktivitätseinheiten (AU) in (A), die Absorption von RBB-bound Produkte in den Überstand freigesetzt nach Hydrolyse bei 595 nm unter Verwendung eines Mikroplatten-Spektrophotometer gemessen wurde. Bei jedem Temperaturzustand, Reaktionen ohne zugegebenes Enzym wurden verwendet, um die Auswirkungen eines freigesetzten Farbstoffes zu subtrahieren, die von der Inkubation bei verschiedenen Temperaturen geführt. Die Reaktionsüberstand auf jeder Inkubationstemperatur entsprechen , wurden vor der Absorptionsmessung (B) abgebildet. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53819/53819fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53819/53819fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/53819/53819fig4.jpg" /> Abbildung 4:. Aktivitätsbereich für ein Protein Antimicrobial Der Aktivitätsbereich für das unbekannte Protein antimikrobielle wurde als Aktivitätseinheiten nach über Nacht Inkubationen gemessen für 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 und 1000 ng , wie von der BCA prot gemessenein Test (A). Für diese Reaktionen, die RBB-markiertes B. subtilis Substratniveau erhöht wurde eine optische Dichte von 5,0 bei 595 nm zu geben , um sicherzustellen , daß die Reaktion mit der höchsten Menge an Enzym (1000 ng) nicht vollständig den gesamten verfügbaren Substrat innerhalb der Reaktions Inkubationsperiode hydrolysieren. Kontrollreaktionen ohne zugegebenes Enzym wurden verwendet, um die Auswirkungen eines freigesetzten Farbstoffes durch die Inkubation allein verursacht zu subtrahieren. Die Reaktionsstände zu jedem Enzymmenge entsprechen , wurden vor der Absorptionsmessungen (B) abgebildet. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53819/53819fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53819/53819fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/53819/53819fig5.jpg" /> Abbildung 5:. Aktivitätsbereich für α-Chymotrypsin der Aktivitätsbereich für α-Chymotrypsin wurde als activ gemessenkeit Einheiten nach über Nacht Inkubationen für 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 und 1000 ng Enzym (A). Für diese Reaktionen, die RBB-markiertes B. subtilis Substratniveau erhöht wurde eine optische Dichte von 5,0 bei 595 nm zu geben , um sicherzustellen , daß die Reaktion mit der höchsten Menge an Enzym (1000 ng) nicht vollständig den gesamten verfügbaren Substrat innerhalb der Reaktions Inkubationsperiode hydrolysieren. Kontrollreaktionen ohne zugegebenes Enzym wurden verwendet, um die Auswirkungen eines freigesetzten Farbstoffes durch die Inkubation allein verursacht zu subtrahieren. Die Reaktionsstände zu jedem Enzymmenge entsprechen , wurden vor der Absorptionsmessungen (B) abgebildet. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53819/53819fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53819/53819fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Qualitative und quantitative Assays zur Detektion und Charakterisierung von Protein Antimikrobielle

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Serie: Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

Kombination von Klebstoff-tape-basierten Sampling und Fluoreszenz In situ Hybridisierung zum schnellen Nachweis von Salmonellen On Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Protocol for Recombinant RBD-based SARS Vaccines: Protein Preparation, Animal Vaccination and Neutralization Detection

Based on their safety profile and ability to induce potent immune responses against infections, subunit vaccines have been used as candidates for a wide variety of pathogens 1-3. Since the mammalian cell system is capable of post-translational modification, thus forming properly folded and glycosylated proteins, recombinant proteins expressed in mammalian cells have shown the greatest potential to maintain high antigenicity and immunogenicity 4-6.
Although no new cases of SARS have been reported since 2004, future outbreaks are a constant threat; therefore, the development of vaccines against SARS-CoV is a prudent preventive step and should be carried out. The RBD of SARS-CoV S protein plays important roles in receptor binding and induction of specific neutralizing antibodies against virus infection 7-9. Therefore, in this protocol, we describe novel methods for developing a RBD-based subunit vaccine against SARS. Briefly, the recombinant RBD protein (rRBD) was expressed in culture supernatant of mammalian 293T cells to obtain a correctly folded protein with proper conformation and high immunogenicity 6. The transfection of the recombinant plasmid encoding RBD to the cells was then performed using a calcium phosphate transfection method 6,10 with some modifications. Compared with the lipid transfection method 11,12, this modified calcium phosphate transfection method is cheaper, easier to handle, and has the potential to reach high efficacy once a transfection complex with suitable size and shape is formed 13,14. Finally, a SARS pseudovirus neutralization assay was introduced in the protocol and used to detect the neutralizing activity of sera of mice vaccinated with rRBD protein. This assay is relatively safe, does not involve an infectious SARS-CoV, and can be performed without the requirement of a biosafety-3 laboratory 15.
The protocol described here can also be used to design and study recombinant subunit vaccines against other viruses with class I fusion proteins, for example, HIV, respiratory syncytial virus (RSV), Ebola virus, influenza virus, as well as Nipah and Handra viruses. In addition, the methods for generating a pseudovirus and subsequently establishing a pseudovirus neutralization assay can be applied to all these viruses.

This protocol describes a general procedure for studying recombinant receptor-binding domain (RBD)-based subunit vaccines against SARS. It includes methods for transfection and expression of RBD protein in 293T cells, immunization of mice with RBD and detection of neutralization activity of mouse sera using an established SARS pseudovirus neutralization assay.

Protokoll für die rekombinante RBD-basierte Impfstoffe SARS: Protein Preparation, Animal Impfung und Neutralisation Erkennung

Based on their safety profile and ability to induce potent immune responses against infections, subunit vaccines have been used as candidates for a wide ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

Quantitative Analysen aller Influenza Typ A Viral Hämagglutininen und Neuraminidasen mit Universal Antikörper in Einfache Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

To identify potential antivirals against BTV, we have developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based assay was the first assay developed to evaluate whether a compound showed any antiviral efficacy and have been used to screen large compound library. Meanwhile, cytotoxicity of antivirals could also be evaluated using the CPE-based assay. The dose-response assay was designed to determine the range of efficacy for the selected antiviral, i.e. 50% inhibitory concentration (IC50) or effective concentration (EC50), as well as its range of cytotoxicity (CC50). The ToA assay was employed for the initial MoA study to determine the underlying mechanism of the novel antivirals during BTV viral lifecycle or the possible effect on host cellular machinery. These assays are vital for the evaluation of antiviral efficacy in cell culture system, and have been used for our recent researches leading to the identification of a number of novel antivirals against BTV.

Three assays, including the cytopathic effect (CPE)-based assay, dose-response assay and Time-of-Addition (ToA) assay have been developed, optimized, validated and utilized to identify novel antivirals against Bluetongue virus (BTV), as well as to determine the possible Mechanism-of-Action (MoA) for newly identified antivirals.

Tests für die Identifizierung neuer Antivirale gegen Blauzungenvirus

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver (extravascular hemolysis) or leading to intravascular lysis of RBCs. Alloantibodies (e.g. ABO) or autoantibodies to RBC antigens (as seen in autoimmune hemolytic anemia, AIHA) leading to complement activation are potentially harmful and can be - especially when leading to intravascular lysis - fatal1. Currently, complement activation due to (auto)-antibodies on RBCs is assessed in vitro by using the Coombs test reflecting complement deposition on RBC or by a nonquantitative hemolytic assay reflecting RBC lysis1-4. However, to assess the efficacy of complement inhibitors, it is mandatory to have quantitative techniques. Here we describe two such techniques. First, an assay to detect C3 and C4 deposition on red blood cells that is induced by antibodies in patient serum is presented. For this, FACS analysis is used with fluorescently labeled anti-C3 or anti-C4 antibodies. Next, a quantitative hemolytic assay is described. In this assay, complement-mediated hemolysis induced by patient serum is measured making use of spectrophotometric&#160;detection of the released hemoglobin. Both of these assays are very reproducible and quantitative, facilitating studies of antibody-induced complement activation.

Here we describe two assays for measuring complement activation induced by antibodies against red blood cells. The major advantage over the current assays is their quantitative and easy-to-interpret nature.

Methoden für die quantitative Bestimmung von Antikörper-induzierte Komplementaktivierung auf Red Blood Cells

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver ...

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the absence of effective control clinical coccidiosis can be devastating. Resistance to the chemoprophylactics frequently used to control Eimeria is common and sub-clinical infection is widespread, influencing feed conversion ratios and susceptibility to other pathogens such as Clostridium perfringens. Despite the availability of polymerase chain reaction (PCR)-based tools, diagnosis of Eimeria infection still relies almost entirely on traditional approaches such as lesion scoring and oocyst morphology, but neither is straightforward. Limitations of the existing molecular tools include the requirement for specialist equipment and difficulties accessing DNA as template. In response a simple field DNA preparation protocol and a panel of species-specific loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays have been developed for the seven Eimeria recognised to infect the chicken. We now provide a detailed protocol describing the preparation of genomic DNA from intestinal tissue collected post-mortem, followed by setup and readout of the LAMP assays. Eimeria species-specific LAMP can be used to monitor parasite occurrence, assessing the efficacy of a farm&#8217;s anticoccidial strategy, and to diagnose sub-clinical infection or clinical disease with particular value when expert surveillance is unavailable.

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Diagnosis of Eimeria infection in chickens remains demanding. Parasite morphology- and host pathology-led approaches are commonly inconclusive, while molecular approaches based on PCR have proven demanding in cost and expertise. The aim of this protocol is to establish loop-mediated isothermal amplification (LAMP) as a straightforward molecular diagnostic for eimerian infection.

Loop-vermittelte isothermen Amplifikation (LAMP) Assays für die artspezifischen Nachweis von<em&gt; Eimeria</em&gt;, Die Hühner infizieren

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins towards the immune synapse to assure a stable binding and signal exchange. Classical confocal, TIRF, or super-resolution microscopy have been used to study the immune synapse. Since these methods require manual image acquisition and time-consuming quantification, the imaging of rare events is challenging. Here, we describe a workflow that enables the morphological analysis of tens of thousands of cells. Immune synapses are induced between primary human T cells in pan-leukocyte preparations and Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB)-loaded Raji cells as APCs. Image acquisition is performed with imaging flow cytometry, also called In-Flow microscopy, which combines features of a flow cytometer and a fluorescence microscope. A complete gating strategy for identifying T cell/APC couples and analyzing the immune synapses is provided. As this workflow allows the analysis of immune synapses in unpurified pan-leukocyte preparations and hence requires only a small volume of blood (i.e., 1 mL), it can be applied to samples from patients. Importantly, several samples can be prepared, measured, and analyzed in parallel.

Here, we describe a complete workflow for the qualitative and quantitative analysis of immune synapses between primary human T cells and antigen-presenting cells. The method is based on imaging flow cytometry, which allows the acquisition and evaluation of several thousand cell images within a relatively short period of time.

Qualitative und Quantitative Analyse der immun Synapse im menschlichen System mit Hilfe von Imaging Durchflusszytometrie

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic immune response. The activation of MCs via the cross-linking of surface IgE bound to high affinity IgE receptor (Fc&#949;RI), as well as through the stimulation of several other receptors, initiates the rise of the free intracellular Ca2+ level ([Ca2+]i) that promotes the release of inflammatory and allergic mediators. The identification of molecular constituents involved in these signaling pathways is crucial for understanding the regulation of MC function. In this article, we describe a protocol for the isolation of murine connective tissue type MCs by peritoneal lavage and cultivation of peritoneal MCs (PMCs). Cultures of MCs from various knockout mouse models by this methodology represent a useful approach to the identification of proteins involved in MC signaling pathways. In addition, we also describe a protocol for single cell Fura-2 imaging as an important technique for the quantification of Ca2+ signaling in MCs. Fluorescence-based monitoring of [Ca2+]i is a reliable and commonly used approach to study Ca2+ signaling events, including store-operated calcium entry, which is of utmost importance for MC activation. For the analysis of MC degranulation, we describe a &#946;-hexosaminidase release assay. The amount of &#946;-hexosaminidase released into the culture medium is considered as a degranulation marker for all three different secretory subsets described in MCs. &#946;-hexosaminidase can easily be quantified by its reaction with a colorigenic substrate in a microtiter plate colorimetric assay. This highly reproducible technique is cost-effective and requires no specialized equipment. Overall, the provided protocol demonstrates a high yield of MCs expressing typical MC surface markers, displaying typical morphological and phenotypic features of MCs, and demonstrating highly reproducible responses to secretagogues in Ca2+-imaging and degranulation assays.

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Here, we present a protocol to isolate and cultivate murine peritoneal mast cells. We also describe two protocols for their functional characterization: a fluorescent imaging of intracellular free Ca2+ concentration and a degranulation assay based on colorimetric quantification of the released &#946;-hexosaminidase.

Isolierung von Mastzellen Bauchfell abgeleitet und deren funktionelle Charakterisierung mit Ca2 +-imaging und Degranulation Assays

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ECL assay is a nonradioactive fluid phase assay for islet autoantibodies with higher sensitivity and specificity than the current 'gold' standard radio-binding assay (RBA). ECL assays can more precisely define the onset of presymptomatic T1D by distinguishing the high-risk, high-affinity autoantibodies from the low-risk, low-affinity autoantibodies generated in RBAs, and conventional enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). The antigen protein used in this ECL assay is labeled with Sulfo-tag and Biotin, respectively. Each ECL autoantibody assay that uses a particular antigen protein needs an optimization step before it can be used for laboratory application. This step is especially vital in determining the requirements for serum acid treatments, concentrations, and ratios of the two different antigens labeled with Sulfo-tag and Biotin. To perform the assay, serum samples are mixed with Sulfo-tag-conjugated and biotinylated capture antigen protein in phosphate buffered solution (PBS), containing 5% Bovine Serum Albumin (BSA). Afterwards, the samples are incubated overnight at 4 &#176;C. The same day, a streptavidin-coated plate is prepared with blocker buffer and incubated overnight at 4 &#176;C. On the second day, wash the streptavidin plate and transfer the serum-antigen mixture onto the plate. Place the plate on the plate shaker, set it at low speed, and incubate at room temperature for 1 h. Subsequently, the plate is washed again, and reader buffer is added. The plate is then counted on the plate reader machine. The results are conveyed through an index, which is generated from internal standard positive and negative control serum samples.

Here, we presented the methods to detect human islet autoantibodies using electrochemiluminescence (ECL) assays. The protocol, used to predict type 1 diabetes, can be expanded upon to detect autoantibodies for other autoimmune diseases.

Electrochemiluminescence-Assays für menschliche Insel-Autoantikörper

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Eine High-Throughput-Plattform für das Screening von Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Qualitative und quantitative Assays zur Detektion und Charakterisierung von Protein Antimikrobielle

Zusammenfassung

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