Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse NIH R21 DE023311 (APM), R56 AI111836 (APM &amp; SGF), R01 AI054928 (SGF) und R01 DE017088 (SGF) unterstützt.

Alle tierischen Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee auf der Los Angeles Biomedical Research Institute bestätigt (Protokoll 011.000) und nach den National Institutes of Health (NIH) Leitlinien für die ethische Behandlung von Tieren durchgeführt. Die Mäuse wurden in einer AAALAC-akkreditierten Einrichtung auf dem Campus der Harbor-UCLA Research and Education Institute liegt im Käfig. Ein Vollzeit-Tierarzt, der in der Versuchstiermedizin spezialisiert beaufsichtigte ihre Pflege. Käfighaltung und Tierhaltung wurde nach den Richtlinien der US Public Health Service Publikation &quot;Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren&quot; zur Verfügung gestellt. Jeder Versuch unternommen wurde, um die Mäuse mit Menschlichkeit zu behandeln. Das Überleben und die Gesundheit der Mäuse wurde dreimal täglich überwacht. Offensichtlich wurden krank, lethargisch Mäusen aus der Gruppe getrennt und eingeschläfert, Leiden zu minimieren. Die Mäuse wurden durch Überdosis Pentobarbital (210 mg / kg) getötet, wie der Ausschuss für Euthanas empfohlenia der American Veterinary Medical Association. 1. Herstellung von Gewebe, Reagenzien und Instrumente <ol><li> Verwenden männliche Balb / c-Mäusen, 20-22 g Gewichtung für alle Studien. Impfen drei Mäusen pro Versuchsgruppe intravenös mit 1 x 10 6 Hefe-Phase C albicans-Zellen. Opfern Tiere und Ernte Nieren zu bestimmten Zeitpunkten nach der Infektion. Platzieren Sie jede Niere in einen Schraubverschluss Rohr, Snap freeze in flüssigem Stickstoff, und bei -80 ° C für die spätere RNA-Extraktion 6. Anmerkung: Die Tierversuche wurden wie im Detail in Xu et al beschrieben durchgeführt. 6. </li><li> Bereiten Sie die folgenden Reagenzien und Instrumente vor dem Entfernen der Nieren aus dem -80 ° C Gefrierschrank: <ol><li> Öffnen Sie eine Gesamt-RNA-Extraktions-Kits. In 2-Mercaptoethanol (1% v / v) zu RLT-Puffer und gut mischen (Vorbereitung 2 ml für jede Probe). </li><li> Vorbereitung Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol 25: 24: 1 (600 ul müssen für jede Probe). </li><li> Label M-Typ Homogenisierung Rohre (M-Rohr) und Chill auf Eis. </li><li> Label 2 ml Schraubverschluss Röhrchen, und fügen Sie ca. 300 &amp; mgr; l Zirkonia-Perlen in jedes Röhrchen. </li><li> Check Instrumente stehen zur Verfügung: Gewebe Dissociator, BeadBeater, Tischzentrifuge mit Adapter für 50 ml-Röhrchen und Platten mit 96 Vertiefungen, Photometer. </li></ol></li></ol> 2. RNA-Extraktion aus infizierten Geweben <ol><li> Röhrchen, die Nieren von -80 ° C Gefrierschrank zu entfernen und legen auf Eis. Mit 1,2 ml RLT mit 2-Mercaptoethanol zu jeder Niere puffern. Dekantier-Niere mit Puffer in eine M-Typ Homogenisierung Rohre. </li><li> Homogenisieren die Niere unter Verwendung eines gewebe Dissociator auf vorinstallierten Einstellung RNA_02.01. </li><li> Zentrifuge bei 1000 × g für 1 min in einer Tischzentrifuge bei RT. </li><li> Übertragen Sie 600 ul Homogenat zu der Schraubkappe Röhrchen mit Zirkonia-Perlen. Speichern Sie die verbleibenden Homogenat auf Eis. </li><li> Mit 600 &amp; mgr; l Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol 25: 24: 1 bisdie Rohre aus dem vorhergehenden Schritt. </li><li> Schließen Sie den Deckel fest und Wirbel auf BeadBeater für 3 Minuten in einer 4 ° C kalten Raum. </li><li> Zentrifugieren der Röhrchen bei 15.000 xg für 5 min in einem 4 ° C kalten Raum. </li><li> Die wässrige Phase in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen vorsichtig zu übertragen, gut mischen mit gleichen Volumen von 70% Ethanol, dann auf die Spin-Säule zu laden (load zweimal). </li><li> Einmal Waschen Sie die Spin-Säule mit 700 &amp; mgr; l Puffer RW, gefolgt von zweimal mit 500 &amp; mgr; l Puffer RPE. Zentrifuge eine zusätzliche Minute in einem trockenen Sammelröhrchen, um restliche Flüssigkeit in der Spin-Säule entfernen. Führen Sie alle Zentrifugationsschritte bei 8000 x g. </li><li> Eluieren RNA mit 50 &amp; mgr; l H 2 O. Messen Sie RNA-Konzentration bei OD 260 mit einem Spektralphotometer. </li></ol> 3. Genexpressions Mit Digital-Strichcode- <ol><li> Thaw Reporter codeset (grüner Deckel Rohr) und Capture-Codesatz (graue Kappe Rohr) auf Eis. </li><li> Add 130 ul Hybridisierungspuffer zur Wiederporter codeset, umzukehren, zu mischen und Spin-Down. </li><li> Mit 20 &amp; mgr; l des Gemisches zu jeder der 12 Reaktionsrohren. </li><li> Zugabe von 10 ug Gesamt-Gewebe-RNA (in einem Volumen von 5 ul) in jedes Röhrchen. Mischen durch Pipettieren. </li><li> Plus 5 ul Erfassungscodesatz in jedes Röhrchen. Mischen Sie, indem Sie den Rohr, gefolgt von einer schnellen Spin-Down. </li><li> Die Reaktionen bei 65 ° C inkubieren in einem Thermocycler mit Heizdeckel O / N (~ 18 h). </li><li> Entfernen Sie eine Probenkassette von -20 ° C und lassen Sie es auf RT erwärmen. </li><li> Entfernen zwei Reagenz Platten von 4 ° C und Zentrifugation bei 670 × g für 2 min in einer Tischzentrifuge. </li><li> Einrichten der Vorbereitungsstation folgenden Schritt-für-Schritt-Anleitungen auf dem Bildschirm, wählen Sie die Option, eine hohe Empfindlichkeit. </li><li> Entfernen Sie die Reaktionen aus dem Thermocycler und sofort auf dem Vorbereitungsstation laden. Wählen Sie, um die hohe Empfindlichkeit Programm (3 h) laufen. </li><li> Wenn die Vorbereitungsstation Programm abgeschlossen ist, entfernen Sie die Kassette und dichten die Bahnen mit einem klaren Klebeband. ApLagen Mineralöl auf die Unterseite der Patrone (zur Erzeugung einer nCounter nur, spätere Generationen diesen Schritt nicht erforderlich), dann wird die Kassette laden auf den Digital-Analysator. </li><li> Einrichten des digitalen Analysators folgenden Schritt-für-Schritt-Anleitungen auf dem Bildschirm, wählen Sie die Scan-Option Hochauflösung. </li><li> Wählen Sie den (600 Felder) Option hohe Auflösung, führen Sie den Scan-Programm (~ 4,5 h). </li><li> Wenn das Scan-Programm abgeschlossen ist, laden Sie die Ergebnisse (oder wählen Sie, um die Ergebnisse per E-Mail) und Rohdaten Import in Herstellersoftware. Die Software überprüft automatisch die Datenqualität und erhöhen Flags, wenn die Qualität der Daten aus dem normalen Bereich fällt. Führen technische Anpassung mit Hilfe der eingebauten Funktion (optional, befolgen Sie die Anweisungen in der Software), dann die Daten zu exportieren als Excel-Datei. </li><li> Normalisieren die Daten mit Hilfe einer der folgenden Methoden: Gesamtaktivität aller Gene im Codesatz; einem oder wenigen internen Kontrollgenen; geometrisches Mittelvon hoch exprimierten Genen (siehe Diskussion). </li><li> Berechnet den Mittelwert Expressionswerte für jedes Gen (wenn das Experiment wurde in Wiederholungen oder dreifach durchgeführt), dann wird das Verhältnis der Expressionsniveaus zwischen den verschiedenen Versuchsgruppen. </li><li> (optional) Analyse und Visualisierung der Profilierung Ergebnisse durch integrierte Funktionen im nSolver Software oder einer Clustering-Programm wie MultiExperiment Viewer-10. </li></ol>

<ol>
	<li>Cairns, T., Minuzzi, F., Bignell, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host-infecting+fungal+transcriptome.">The host-infecting fungal transcriptome.</a> FEMS Microbiol Lett. 307 (1), 1-11 (2010).</li><li>Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+RNA-seq+of+pathogen+and+host.">Dual RNA-seq of pathogen and host.</a> Nat Rev Microbiol. 10 (9), 618-630 (2012).</li><li>Creecy, J. P., Conway, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bacterial+transcriptomics+with+RNA-seq.">Quantitative bacterial transcriptomics with RNA-seq.</a> Curr Opin Microbiol. 23C, 133-140 (2015).</li><li>Geiss, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+multiplexed+measurement+of+gene+expression+with+color-coded+probe+pairs.">Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs.</a> Nat Biotechnol. 26 (3), 317-325 (2008).</li><li>Malkov, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+measurements+of+gene+signatures+in+different+analytes+using+the+Nanostring+nCounter+Assay+System.">Multiplexed measurements of gene signatures in different analytes using the Nanostring nCounter Assay System.</a> BMC Res Notes. 2, 80 (2009).</li><li>Xu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+Alliance+of+Regulatory+Pathways+in+C.+albicans+during+Mammalian+Infection.">Activation and Alliance of Regulatory Pathways in C. albicans during Mammalian Infection.</a> PLoS Biology. 13, e1002076 (2015).</li><li>O'Meara, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cryptococcus+neoformans+Rim101+Transcription+Factor+Directly+Regulates+Genes+Required+for+Adaptation+to+the+Host.">The Cryptococcus neoformans Rim101 Transcription Factor Directly Regulates Genes Required for Adaptation to the Host.</a> Mol Cell Biol. 34 (4), 673-684 (2014).</li><li>Cheng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+Candida+albicans+Gene+Expression+During+Intra-Abdominal+Candidiasis+Identifies+Biologic+Processes+Involved+in+Pathogenesis.">Profiling of Candida albicans Gene Expression During Intra-Abdominal Candidiasis Identifies Biologic Processes Involved in Pathogenesis.</a> J Infect Dis. 208 (9), 1529-1537 (2013).</li><li>Fanning, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+Targets+of+Candida+albicans+Biofilm+Regulator+Bcr1+in+Vitro+and+In+Vivo.">Divergent Targets of Candida albicans Biofilm Regulator Bcr1 in Vitro and In Vivo.</a> Eukaryot Cell. 11 (7), 896-904 (2012).</li><li>Saeed, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TM4:+a+free,+open-source+system+for+microarray+data+management+and+analysis.">TM4: a free, open-source system for microarray data management and analysis.</a> Biotechniques. 34 (2), 374-378 (2003).</li></ol>

This protocol is developed in the laboratory of Dr. Aaron P. Mitchell at Carnegie Mellon University. The publication of this manuscript is sponsored by NanoString Technologies.

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um Transkriptionsprofilierung infizieren Mikroben mit einem nano nCounter Plattform zu optimieren. Das gesamte Verfahren, vom Gewebesammel um Expressionsdaten, benötigt weniger als 48 Stunden. Die Hands-on-Zeit beträgt etwa 4 Stunden für 12 Proben. Eine Schlüsselvariable in diesem Protokoll ist die Menge an Puffer RLT auf das Gewebe bei der ersten Stufe zugegeben. Zu viel Puffer das Homogenat zu verdünnen und zu einer RNA-Konzentration zu senken, während zu wenig Puffer kann zur Bildung von viskosen Gele nach dem Phenol-Chloroform-Extraktionsschritt zu führen und keinen Wasserphase für die RNA-Wiederherstellung. Die empirisch ermittelt optimale Volumen Puffer RLT für Mausgeweben (vorausgesetzt typischen Größen) sind: Nieren (1,2 ml), die Zunge (1,0 ml) und Lungenkrebs (2,0 ml). Für mikrobielle Krankheitserreger, vor allem in Fadenform davon gewachsen, der Wulst-zu schlagen Schritt hilft, offene dicke Zellwand zu brechen, um Zellinhalt vollständig freizugeben. In der Elutionsschritt, um die endgültige RNA zu erhöhenKonzentration kann die erste Runde Eluates wieder auf die Säule gegeben werden und ein zweites Mal eluiert. Etwa 100 ug Gesamt-RNA Gewebe kann von einem RNeasy Spinsäule (~ 2 ug / ul x 50 &amp; mgr; l) wiederhergestellt werden. Wenn größere Menge an RNA benötigt wird, kann eine zweite prep vom verbleibenden Gewebehomogenat erfolgen. Haben der verbleibenden Homogenat nicht weg, bis RNA-Konzentration gemessen wurde, nur für den Fall. Je nach Infektionsmodell, das Inokulum Größe und der Erreger-Stamm, der Anteil der Pathogen-RNA insgesamt Gewebe RNA im Bereich von 0% bis 2%, und fällt in den 0,05% -0,5% Reichweite in der Regel. Beispielsweise 10 ug Gesamt-RNA aus Gewebe C. albicans infiziert Nieren könnten rohes zählt gleich derjenigen der 10 ng reiner C erzeugen albicans RNA aus einer in vitro-Kultur (10 ng / 10 &amp; mgr; = 0,1%). Weil der Anteil der Pathogen-RNA insgesamt Gewebe RNA variiert in einem weiten Bereich, ist es schwierig, die Menge des pathoge wissenn -RNA in einer gegebenen Menge an Gesamt-RNA. Um Verschwendung zu vermeiden Codesatz (für 250 Gene x 192 Reaktionen, die Kosten pro Reaktion liegt bei etwa $ 200) an Proben mit Pathogen-RNA unter der Nachweisgrenze kann ein RNA Qualitätskontrollschritt durchgeführt, um den Erreger RNA-Ebene in jeder Probe zu bestimmen. Dies kann entweder durch Q-RTPCR oder eine kleine Codesatz mit ein paar Haushaltsgenen durchgeführt werden. Die Normalisierung mit pathogen-Gene ist ein kritischer Schritt, bevor die Expressionsprofile können unter den verschiedenen Proben verglichen werden. Es gibt drei allgemein verwendeten Verfahren zur Normalisierung. 1. Verwenden Sie die Gesamtaktivität von allen Genen im Codesatz. 2. Verwenden Sie eine oder wenige &quot;Housekeeping&quot; Genen. 3. Mit dem geometrischen Mittelwert (N-te Wurzel des Produkts der Anzahl N) von hoch exprimierten Genen. Für eine große Codesatz (&gt; 100 Genen), die nach dem Zufallsprinzip ausgewählten Sonden unter Verwendung von Gesamtaktivität für die Normierung kann eine gute Wahl sein, weil die Gesamtaktivität von einer großen Anzahl von nicht verwandten Gene Glaubevollständig widerspiegeln die Menge an RNA-Eingang. Für ein kleines codeset (&lt;100 Gene) enthalten Sonden, die auf einen bestimmten Prozess konzentriert (wie Hyphenwachstum, da Hyphenwachstums Genen zusammen reguliert werden tendieren), die Auswahl einer oder wenigen Haushaltsgenen als Kontrolle zur Normalisierung ist wesentlich. TDH3 ein robust ausgedrückt Stoffwechselgens hat auch die Kontrolle für viele Experimente serviert. Das dritte Verfahren ist ein Hybrid aus Verfahren 1 und 2, mit einem Schwerpunkt für gleiche Beitrag hoch exprimierten Genen. Obwohl die nCounter Plattform nicht genomweiten ermöglicht sie die Quantifizierung der Expressionsniveau für bis zu 800 Gene in einem einzigen Assay. Deshalb ist die Wahl der informativsten Gene zu analysieren, ist entscheidend für den Erfolg der Profilierung. Zwei Ansätze für Sonden ausgewählt wurden verwendet. Der erste Ansatz ist &quot;Kenntnisse&quot;. Informationen aus veröffentlichten Expression und funktionelle Daten an Bildschirm nach Genen, die von potenziellem Interesse an den aktuellen zusammengestelltzu untersuchen, wie die Umweltantwortgene 6-9. Dieser Ansatz ermöglicht den einfachen Vergleich von in-vivo-Profiling-Daten in viele bestehende Datensätze, also die Bereitstellung Zusammenhang auf die Interpretation der Daten. Der zweite Ansatz ist &quot;Exploration basiert&quot;. Eine Kategorie von Genen im Genom eines Mikroorganismus, wie beispielsweise alle Gene spezifiziert Transkriptionsfaktoren, Kinasen oder Zellwand-Proteine ​​für Sonden ausgewählt. Dieser Ansatz ermöglicht die Identifizierung neuer Virulenzfaktoren und Identifizierung neuartiger Regulierungs Beziehungen auf der Grundlage der in vivo Profildaten 6.

Genexpression Dynamik hält wichtige Informationen darüber, wie eine Zelle auf Umweltveränderungen reagiert. Im Fall eines infizierenden Mikroben könnte Genexpressionsdaten klinisch relevanten Erkenntnisse darüber, wie ein Pathogen passt sich der Infektion Umwelt und verursacht Schäden an den Host liefern. In den vergangenen zwei Jahrzehnten haben Genexpressionsstudien in vitro und in vivo große Menge von Daten erzeugt und legte eine Grundlage für das Verständnis der Infektionsbiologie 1-3. Doch aktuelle Profilierung Technologien wie Mikroarrays und RNAseq, sind nicht optimal für die Profilierung des Erregers Genexpression während der Infektion. Wirts-RNA stellt eine überwiegende Teil (in der Regel&gt; 99%) der Gesamt-RNA aus infizierten Gewebeproben isoliert. Der Host-RNA trägt zu hohen Hintergrund auf Mikroarrays, und dominiert Folge liest aus RNAseq. Pathogen Zellisolierung aus infiziertem Gewebe, in der Theorie, kann dazu beitragen, für die Pathogen-RNA zu bereichern, aber es stellt sich zusätzlichal-Probleme: es große Mengen von infiziertem Gewebe erfordert; das Verfahren kann langwierig sein; und was am wichtigsten ist, ist es schwierig, den nativen Zustand oder Integrität der RNA während der langwierigen Prozess zu sparen. Um umfassendere und genaue Daten über Krankheitserreger Genexpression während der reale Infektionen erzeugen, machten wir uns auf ein Protokoll, zuverlässige und kosteneffektive Quantifizierung von Minderheits RNA-Spezies in einer gemischten RNA-Population ermöglicht zu entwickeln. Nano nCounter ist eine kürzlich entwickelte Plattform, die eine direkte Messung von gemultiplexten Genexpression macht Verwendung digitaler barcodierten Sondenpaare 4, 5. Diese Plattform hat eine Empfindlichkeit vergleichbar mit der qRT-PCR, aber nicht enzymatische Amplifikation erforderlich. Die Technologie nicht genomweite es Detektion von bis zu 800 verschiedene Gene in jedem Assay ermöglicht. Daher ist es entscheidend, informativen Genen als Sonden für die Profilierung aus. Hier verwenden wir Genexpressionsstudie einer großen humein Pathogen Candida albicans, während eine invasive Infektion als ein Beispiel, um zu zeigen: 1) Technische Einzelheiten der experimentellen Verfahren (Protokoll), 2) die Empfindlichkeit, Reproduzierbarkeit und der dynamische Bereich dieser Methode (repräsentative Ergebnisse) und 3) Wichtig Überlegungen für die Gestaltung und Durchführung von Experimenten auf der Grundlage dieses Protokolls (Diskussion). Dieses Protokoll kann leicht für verschiedene Krankheitserreger angepasst werden und wurde erfolgreich in einer Reihe von Infektionsmodellen 6-9 angewendet.

<table><tbody><tr><td>gentleMACS Dissociator</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>gentelMACS M tube</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M-3148</td><td></td></tr><tr><td>Phenol:CHCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;:IAA</td><td>Sigma</td><td>P-2069</td><td></td></tr><tr><td>Zirconia beads</td><td>Biospec Products</td><td>11079110zx</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater-16</td><td>Biospec Products</td><td>607</td><td></td></tr><tr><td>nCounter Analysis system</td><td>nanoString Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>nCounter Gene Expression Codesets</td><td>nanoString Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>nSolver Analysis tool</td><td>nanoString Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

gene expression profiling of infecting microbes using a digital bar-coding platform

Bei den meisten Säugetieren Erreger haben Genexpressionsstudien durch technische Schwierigkeiten begrenzt worden, um genau zu quantifizieren Erreger Gentranskripten aus infizierten Geweben. Pathogen-RNA bildet einen kleinen Teil der Gesamt-RNA aus infizierten Gewebeproben isoliert. Beide Mikroarray und RNAseq Technologien haben Schwierigkeiten bei der Erzeugung zuverlässiger liest für schwach ausgeprägt Erreger Gene. Mutant Erregerstämme mit reduzierten in vivo-Proliferation stellen eine noch größere Herausforderung. Hier beschreiben wir ein in vivo Genexpressions Protokoll, das sehr schnelle, hochempfindliche und sehr gut reproduzierbar ist. Wir dieses Protokoll entwickelt, während unserer Untersuchung der pilzlichen Pathogens Candida albicans in einem Mausmodell der hämatogen disseminierte Candidiasis. Mit diesem Protokoll haben wir Zeitverläufe der dynamisch geregelten C. dokumentiert albicans Genexpression während der Nieren-Infektion, und entdeckte unerwartete MerkmaleGenexpression Antworten auf medikamentöse Behandlung in vivo Antimykotika.

Eine große Herausforderung für die Erreger von Genexpressionsprofilen in vivo ist es, genug liest aus Pathogen-RNA. Angesichts der geringen Prozentsatz der Pathogen-Transkripte in Gesamt-RNA, große Mengen an Gesamt-RNA (&gt; 10 ug) muss für jede Reaktion verwendet werden. Die Plattform hat einen einzigartigen Vorteil in dieser Hinsicht: Es verwendet sowohl eine Einfangsonde und eines Berichts Sonde, die Spezifität zu erhöhen, so dass die überwiegende Menge der Wirts-RNA ist ein erhebliches Maß an Lärm verursachen. Wie in Abbildung 1 gezeigt (aus Lit.. 6), waren Hintergrund rohes zählt von einem nicht infizierten Gewebeprobe (rote Punkte) alle unter 10, während rohe zählt von zwei infizierte Gewebeproben (blaue Punkte) waren alle über 10 Expression Daten erzeugt mit diesem Protokoll sind hoch reproduzierbar. Wie in Abbildung 1 gezeigt (aus Lit.. 6), roh zählt von zwei biologischen Replikaten (blaue Punkte, 48 Stunden nach der Infektion Nierenproben) hatte sehr good Korrelation mit R-Quadrat-Wert gleich 0,945. Die Plattform bietet auch ausreichenden dynamischen Bereich, um natürliche biologische Expressionsniveaus umfassen (Abbildung 1, reichten Rohzählungen zwischen 10 1 und 10 6). Mit Hilfe eines Sondensatz Angabe 248 Umweltantwortgene, waren wir in der Lage, zwei Phasen des Erregers Genexpression (Abbildung 2, aus Lit. 6.) Zu erkennen: eine frühe Genexpression als Reaktion umfasst Gene, die mit RNA-Spiegel signifikant unterschiedlich zwischen Inokulum und 12 h nach der Infektion Proben (P &lt;0,05 und&gt; 2-fache Veränderung der Expression) und einem späten Genexpression als Reaktion umfasst Gene, die mit RNA-Spiegel, die signifikant verschieden zwischen den 12 h Zeitpunkt, zu 48 Stunden nach der Infektion Proben (P &lt;0,05 und&gt; 2-fache Veränderung der Expression). Diese Ergebnisse zeigen, daß C. albicans Genexpression dynamisch während invasive infectio geregeltn eines Säugetierwirts. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53460/53460fig1.jpg" /> Abbildung 1. Raw zählt von infizierten und nicht infizierten Nierengewebe (aus Lit.. 6). Sonde zählt für zwei infizierte (48 Stunden nach der Infektion, blauen Datenpunkte) und einem nicht infizierten (rote Datenpunkte) Nierenproben werden als Streu vorgestellt Plot. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53460/53460fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53460/53460fig2.jpg" /> Abbildung 2. Die Expression von C albicans umwelt responsive Gene bei invasiven Infektionen (aus Lit.. 6). Veränderungen im Expressionsniveaus während der Mausniere Invasion für 248 C. albicans-Gene sind in einer Wärme m vorgestelltap-Format. Mittelwerte der biologischen Triplikaten für Hochregulierung (gelb) dargestellt und Down-Regulation (blau) von Genen bei 12, 24 und 48 Stunden nach der Infektion relativ zu Inokulum Ebenen (0 h) bedeuten. Farbsättigung stellt das Ausmaß der Expression Änderung, mit voller Sättigung bei 10 fach Up- oder Down-Regulation. Teile der Heatmap werden erweitert, um repräsentative frühe up-regulierte Gene (oben), späte Gene (Mitte), und Anfang herunterreguliert Gene (unten) zu veranschaulichen. In diesen Abschnitten werden die einzelnen Proben gesondert ausgewiesen, um die Reproduzierbarkeit zu veranschaulichen. Wir definieren frühen Ausdruck ändert sich signifikante Unterschiede zwischen der Impfkultur und 12 h Proben. Wir definieren Spätausdruck ändert sich signifikante Unterschiede zwischen den 12 und 48 Stunden Proben. Bedeutung bezieht sich auf Veränderungen von&gt; 2-fachen und einem p-Wert &lt;0,05. Die Daten für jede Probe wurden die RNA-Niveaus von Kontrollgens TDH3 normalisiert, bevor Mittelwerte wurden berechnet. Unsere Zuordnungskriterien ermöglichen eine dynamically regulierten Gene in beiden frühen und späten Expression Klassen fallen. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53460/53460fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Gene Expression Profiling of Infecting Microbes Using a Digital Bar-coding Platform

We developed a protocol that is fast, sensitive and reproducible for pathogen gene expression profiling during an infection.

Gene Expression Profiling von Infecting Mikroben Mit einem Digital-Strichcode-Plattform

For most mammalian pathogens, gene expression profiling studies have been limited by technical difficulties to accurately quantify pathogen gene ...

gene-expression-profiling-infecting-microbes-using-digital-bar-coding

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.0K Aufrufe.  Carnegie Mellon University. We developed a protocol that is fast, sensitive and reproducible for pathogen gene expression profiling during an infection.

Serie: Gene Expression Profiling of Infecting Microbes Using a Digital Bar-coding Platform

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in a single reaction. The miRNA assay counts transcripts by directly imaging and digitally counting miRNA molecules that are labeled with color-coded fluorescent barcoded probe sets (a reporter probe and a capture probe). Barcodes are hybridized directly to mature miRNAs that have been elongated by ligating a unique oligonucleotide tag (miRtag) to the 3&#39; end. Reverse transcription and amplification of the transcripts are not required. Reporter probes contain a sequence of six color positions populated using a combination of four fluorescent colors. The four colors over six positions are used to construct a gene-specific color barcode sequence. Post-hybridization processing is automated on a robotic prep station. After hybridization, the excess probes are washed away, and the tripartite structures (capture probe-miRNA-reporter probe) are fixed to a streptavidin-coated slide via the biotin-labeled capture probe. Imaging and barcode counting is done using a digital analyzer. The immobilized barcoded miRNAs are visualized and imaged using a microscope and camera, and the unique barcodes are decoded and counted. Data quality control (QC), normalization, and analysis are facilitated by a custom-designed data processing and analysis software that accompanies the assay software. The assay demonstrates high linearity over a broad range of expression, as well as high sensitivity. Sample and assay preparation does not involve enzymatic reactions, reverse transcription, or amplification; has few steps; and is largely automated, reducing investigator effects and resulting in high consistency and technical reproducibility. Here, we describe the application of this technology to identifying circulating miRNA perturbations in irritable bowel syndrome.

We describe the use of a multiplexed high-throughput gene expression platform that quantitates gene expression by barcoding and counting molecules in biological substrates without the need for amplification. We used the platform to quantitate microRNA (miRNA) expression in whole blood in subjects with and without irritable bowel syndrome.

Störeinflüsse von Zirkulierende miRNAs in Irritable Bowel Syndrome erkannt einen Multiplexed Hochdurchsatz-Gene Expression-Plattform

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

Forschung

Genetik

Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated to a microbiota dominated by a number of bacterial species, including Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, and others1-3. This condition is associated with a range of negative health outcomes, including HIV acquisition4, and it can be difficult to manage clinically5. Furthermore, diagnosis of BV has relied on the use of Gram stains of vaginal swab smears that are scored on various numerical criteria6,7. While this diagnostic is simple, inexpensive, and well suited to resource-limited settings, it can suffer from problems related to subjective interpretations and it does not give a detailed profile of the composition of the vaginal microbiota8. Recent deep sequencing efforts have revealed a rich, diverse vaginal microbiota with clear differences between samples taken from individuals that are diagnosed with BV compared to those individuals that are considered normal9,10, which has resulted in the identification of a number of potential targets for molecular diagnosis of BV11,12. These studies have provided a wealth of useful information, but deep sequencing is not yet practical as a diagnostic method in a clinical setting. We have recently described a method for rapidly profiling the vaginal microbiota in a multiplex format using oligonucleotide-coupled fluorescent beads with detection on a Luminex platform13. This method, like current Gram stain-based methods, is rapid and simple but adds the additional advantage of exploiting molecular knowledge arising from sequencing studies in probe design. This method therefore provides a way to profile the major microorganisms that are present in a vaginal swab that can be used to diagnose BV with high specificity and sensitivity compared to Gram stain while providing additional information on species presence and abundance in a semi-quantitative and rapid manner. This multiplex method is expandable well beyond the range of current quantitative PCR assays for particular organisms, which is currently limited to 5 or 6 different assays in a single sample14. Importantly, the method is not limited to the detection of bacteria in vaginal swabs and can be easily adapted to rapidly profile nearly any microbial community of interest. For example, we have recently begun to apply this methodology to the development of diagnostic tools for use in wastewater treatment plants.

We describe a multiplex method for the detection of microorganisms within a sample using oligonucleotide-coupled fluorescent beads. Amplicon from all organisms within a sample is hybridized to a panel of probe-coupled beads. A Luminex or Bio-Plex instrument is used to query each bead for bead type and hybridization signal.

Multiplex Nachweis von Bakterien in komplexen Clinical and Environmental Proben mit Oligonukleotid-gekoppelten Fluoreszenz-Mikrosphären

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated ...

Immunologie und Infektion

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to perform and its ability to standardize the fitness of many strains to a wild-type organism. The technique is limited, however, by available phenotypic markers and the number of strains that can be assessed simultaneously, creating the need for a great number of replicate experiments. Concurrent with large numbers of experiments, the labor and material costs for quantifying bacteria based on phenotypic markers are not insignificant. To overcome these negative aspects while retaining the positive aspects, we have developed a molecular-based approach to directly quantify microorganisms after engineering genetic markers onto bacterial chromosomes. Unique, 25 base pair DNA barcodes were inserted at an innocuous locus on the chromosome of wild-type and mutant strains of Salmonella. In vitro competition experiments were performed using inocula consisting of pooled strains. Following the competition, the absolute numbers of each strain were quantified using digital PCR and the competitive indices for each strain were calculated from those values. Our data indicate that this approach to quantifying Salmonella is extremely sensitive, accurate, and precise for detecting both highly abundant (high fitness) and rare (low fitness) microorganisms. Additionally, this technique is easily adaptable to nearly any organism with chromosomes capable of modification, as well as to various experimental designs that require absolute quantification of microorganisms.

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

This molecular-based approach for determining bacterial fitness facilitates precise and accurate detection of microorganisms using unique genomic DNA barcodes that are quantified via digital PCR. The protocol describes calculating the competitive index for Salmonella strains; however, the technology is readily adaptable to protocols requiring absolute quantification of any genetically-malleable organism.

Digitaler PCR-basierter Wettbewerbsindex für High-Throughput-Analyse der Fitness bei Salmonellen

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...

Multiplexed Barcoding Image Analysis for Immunoprofiling and Spatial Mapping Characterization in the Single-Cell Analysis of Paraffin Tissue Samples

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is an effective methodology for tumor evaluation that improves the understanding of the tumor microenvironment. The visualization of protein expression in formalin-fixed, paraffin-embedded&#160;tissues is achieved when a specific fluorophore is annealed to an antibody-bound barcode via complementary oligonucleotides and then sample imaging is performed; indeed, this method allows for the use of customizable panels of more than 40 antibodies in a single tissue staining reaction. This method is compatible with fresh frozen tissue, formalin-fixed, paraffin-embedded tissue, cultured cells, and peripheral blood mononuclear cells, meaning that researchers can use this technology to view a variety of sample types at single-cell resolution. This method starts with a manual staining and fixing protocol, and all the antibody barcodes are applied using an antibody cocktail. The staining fluidics instrument is fully automated and performs iterative cycles of labeling, imaging, and removing spectrally distinct fluorophores until all the biomarkers have been imaged using a standard fluorescence microscope. The images are then collected and compiled across all the imaging cycles to achieve single-cell resolution for all the markers. The single-step staining and gentle fluorophore removal not only allow for highly multiplexed biomarker analysis but also preserve the sample for additional downstream analysis if desired (e.g., hematoxylin and eosin staining). Furthermore, the image analysis software enables image processing-drift compensation, background subtraction, cell segmentation, and clustering-as well as the visualization and analysis of the images and cell phenotypes for the generation of spatial network maps. In summary, this technology employs a computerized microfluidics system and fluorescence microscope to iteratively hybridize, image, and strip fluorescently labeled DNA probes that are complementary to tissue-bound, oligonucleotide-conjugated antibodies.

Multiplexed barcoding image analysis has recently improved the characterization of the tumor microenvironment, permitting comprehensive studies of cell composition, functional state, and cell-cell interactions. Herein, we describe a staining and imaging protocol using the barcoding of oligonucleotide-conjugated antibodies and cycle imaging, which allows for the use of a high-dimensional image&#160;analysis technique.

Multiplex-Barcoding-Bildanalyse zur Immunprofilierung und räumlichen Kartierung bei der Einzelzellanalyse von Paraffingewebeproben

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is ...

Krebsforschung

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental biology. It has been successfully used to identify rare cell populations, discover novel marker genes, and decode spatial and temporal developmental information. The single cell method has also evolved from the microfluidic based Fluidigm C1 technology to the droplet-based solutions in the last two to three years. Here we used the heart as an example to demonstrate how to profile the mouse embryonic tissue cells using the droplet based scRNA-Seq method. In addition, we have integrated two strategies into the workflow to profile multiple samples in a single experiment. Using one of the integrated methods, we have simultaneously profiled more than 9,000 cells from eight heart samples. These methods will be valuable to the developmental biology field by providing a cost-effective way to simultaneously profile single cells from different genetic backgrounds, developmental stages, or anatomical locations.

Here we presented a multiplexed single cell mRNA sequencing method to profile gene expression in mouse embryonic tissues. The droplet-based single cell mRNA sequencing (scRNA-Seq) method in combination with multiplexing strategies can profile single cells from multiple samples simultaneously, which significantly reduces reagent costs and minimizes experimental batch effects.

Multiplexed Single Cell mRNA Sequenzierungsanalyse von Mausembryonalzellen

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

Entwicklungsbiologie

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

Eine höchste Durchsatz mikrofluidischen Plattform für einzellige Genom-Sequenzierung

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

Biotechnik

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Competitive Genomic Screens von Barcoded Hefe Bibliotheken

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Biologie

High-Throughput Transcriptome Analysis for Investigating Host-Pathogen Interactions

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of the disease.&#160;To study such processes, researchers can use high-throughput sequencing techniques (RNA-seq) that measure the dynamic changes of the host transcriptome at different stages of infection, clinical outcomes, or disease severity.This investigation can lead to a better understanding of the diseases, as well as uncovering potential drug targets and treatments. The protocol presented here describes a complete pipeline to analyze RNA-sequencing data from raw reads to functional analysis. The pipeline is divided into five steps: (1) quality control of the data; (2) mapping and annotation of genes; (3) statistical analysis to identify differentially expressed genes and co-expressed genes; (4) determination of the molecular degree of the perturbation of samples; and (5) functional analysis. Step 1 removes technical artifacts that may impact the quality of downstream analyses. In step 2, genes are mapped and annotated according to standard library protocols.&#160;The statistical analysis in step 3 identifies genes that are differentially expressed or co-expressed in infected samples, in comparison with non-infected ones. Sample variability and the presence of potential biological outliers are verified using the molecular degree of perturbation approach in step 4. Finally, the functional analysis in step 5 reveals the pathways associated with the disease phenotype. The presented pipeline aims to support researchers through the RNA-seq data analysis from host-pathogen interaction studies and drive future&#160;in vitro or in vivo experiments, that are essential to understand the molecular mechanism of infections.

The protocol presented here describes a complete pipeline to analyze RNA-sequencing transcriptome data from raw reads to functional analysis, including quality control and preprocessing steps to advanced statistical analytical approaches.

Hochdurchsatz-Transkriptomanalyse zur Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

Next-Generation-Sequenzierung der ribosomalen 16S-RNA Gene Amplikons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery of fluorescent proteins and their genes have enabled the engineering of protein fusions for localization, the analysis of transcriptional activation and translation of proteins of interest, or the general tracking of individual cells and cell populations. The use of fluorescent protein genes in combination with retroviral technology has further allowed the expression of these proteins in mammalian cells in a stable and reliable manner. Shown here is how one can utilize these genes to give cells within a population of cells their own biosignature. As the biosignature is achieved with retroviral technology, cells are barcoded &#180;indefinitely&#180;. As such, they can be individually tracked within a mixture of barcoded cells and utilized in more complex biological applications. The tracking of distinct populations in a mixture of cells is ideal for multiplexed applications such as discovery of drugs against a multitude of targets or the activation profile of different promoters. The protocol describes how to elegantly develop and amplify barcoded mammalian cells with distinct genetic fluorescent markers, and how to use several markers at once or one marker at different intensities. Finally, the protocol describes how the cells can be further utilized in combination with cell-based assays to increase the power of analysis through multiplexing.

Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications.

Genetische Barcoding mit Fluoreszierende Proteine ​​für Multiplex-Anwendungen

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

Gene Expression Profiling von Infecting Mikroben Mit einem Digital-Strichcode-Plattform

Zusammenfassung

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Störeinflüsse von Zirkulierende miRNAs in Irritable Bowel Syndrome erkannt einen Multiplexed Hochdurchsatz-Gene Expression-Plattform

Multiplex Nachweis von Bakterien in komplexen Clinical and Environmental Proben mit Oligonukleotid-gekoppelten Fluoreszenz-Mikrosphären

Digitaler PCR-basierter Wettbewerbsindex für High-Throughput-Analyse der Fitness bei Salmonellen

Multiplex-Barcoding-Bildanalyse zur Immunprofilierung und räumlichen Kartierung bei der Einzelzellanalyse von Paraffingewebeproben

Multiplexed Single Cell mRNA Sequenzierungsanalyse von Mausembryonalzellen

Eine höchste Durchsatz mikrofluidischen Plattform für einzellige Genom-Sequenzierung

Competitive Genomic Screens von Barcoded Hefe Bibliotheken

Hochdurchsatz-Transkriptomanalyse zur Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen

Next-Generation-Sequenzierung der ribosomalen 16S-RNA Gene Amplikons

Genetische Barcoding mit Fluoreszierende Proteine für Multiplex-Anwendungen

Gene Expression Profiling von Infecting Mikroben Mit einem Digital-Strichcode-Plattform

Zusammenfassung

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Störeinflüsse von Zirkulierende miRNAs in Irritable Bowel Syndrome erkannt einen Multiplexed Hochdurchsatz-Gene Expression-Plattform

Multiplex Nachweis von Bakterien in komplexen Clinical and Environmental Proben mit Oligonukleotid-gekoppelten Fluoreszenz-Mikrosphären

Digitaler PCR-basierter Wettbewerbsindex für High-Throughput-Analyse der Fitness bei Salmonellen

Multiplex-Barcoding-Bildanalyse zur Immunprofilierung und räumlichen Kartierung bei der Einzelzellanalyse von Paraffingewebeproben

Multiplexed Single Cell mRNA Sequenzierungsanalyse von Mausembryonalzellen

Eine höchste Durchsatz mikrofluidischen Plattform für einzellige Genom-Sequenzierung

Competitive Genomic Screens von Barcoded Hefe Bibliotheken

Hochdurchsatz-Transkriptomanalyse zur Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen

Next-Generation-Sequenzierung der ribosomalen 16S-RNA Gene Amplikons

Genetische Barcoding mit Fluoreszierende Proteine ​​für Multiplex-Anwendungen

Genetische Barcoding mit Fluoreszierende Proteine für Multiplex-Anwendungen