Name: isolation of leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface
Uploaded: 2015-05-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
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NGL wurde von der Wayne State University in Perinatal Initiative von Müttern, Perinatal and Child Health. Wir danken Maureen McGerty und Amy E. Furcron (Wayne State University) für die kritische Durchsicht des Manuskripts.

Vor der Arbeit mit den in diesem Protokoll genannten Proben müssen Tier ethische Genehmigung durch die lokalen Forschungsethikkommission und der Institutional Review Boards gegeben. Bei der Arbeit mit Tierblut, Zellen oder gefährliche Mittel, wie in diesem Protokoll erwähnt, müssen die richtige biologische Sicherheit und Laborsicherheitsmaßnahmen eingehalten werden. 1. Maus Handhabung und Gewebeentnahme <ol><li> Bereiten Sie eine sterile Arbeitsstation und erhalten sterile Werkzeuge für Gewebesammlung. Diese Werkzeuge sind große und kleine chirurgische Scheren, Pinzetten, und Feinspitze Pinzette. Umfassen kleine Petrischalen mit dem entsprechenden Gewebe-Namen versehen, mit 1 x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gefüllt (3-5 ml) auf Raumtemperatur äquilibriert (20-22 ° C). Auch eine große Petrischale, unbeschriftet, mit 1x PBS-Lösung gefüllt (10-15 ml). </li><li> Euthanize einer schwangeren Maus (10,5 bis 19,0 Tage nach coitum (dpc) oder vor der Abgabe) unter Verwendung von Kohlendioxid (CO 2). Um sicherzustellen, dass die Maus getötet, verwenden Sie den Genickbruch-Technik. Hinweis: Vor 10,5 dpc, ist es schwierig, die Dezidua-Gewebe aus der Uterusgewebe von Hand zu trennen. Wenn die Isolierung der Dezidua-Leukozyten nicht erforderlich ist, Leukozyten aus den Uterusgewebe von nicht-schwangeren Mäusen oder von Mäusen, denen in &lt;10,5 dpc kann auch über diesen Protokoll durchgeführt werden. </li><li> Verwendung eines Paares von sterilen OP-Schere, die unteren Bauchteil der Haut und Muskelgewebe vollständig zu entfernen. Mit einer Pinzette, bewegen beiseite alle anderen Organe, bis die Gebärmutter und Eierstöcke sichtbar sind. Mit der Uterus noch angebracht, verwenden Sie die Zange, um sie außerhalb der Bauchhöhle (Abbildung 1A) zu bewegen. </li><li> Suchen Sie die Eierstöcke distal der Eileiter und uterotubalen Verbindungs ​​jedes Uterushorn. Mit den kleinen chirurgischen Schere, einen Einschnitt an der uterotubalen Verbindungs ​​und trennen Sie die Gebärmutterhörner aus dem Mesenterium, die die Gebärmuttergefäße; dann,Verbrauch an der Cervix, die Gebärmutterhörner von der Peritonealhöhle (1B) zu lösen. </li><li> Mit kleinen chirurgischen Schere, einen Einschnitt zwischen dem Gebärmutterhals und dem unteren Segment der Uterushörner. Leave befestigt einen Teil des Gebärmutterhalses während dieses Prozesses (1C), um zu vermeiden Öffnen des Uterushorns. </li><li> Einzutauchen Uterushörner (einschließlich dem Gebärmutterhals) in einer großen Petrischale mit 1x PBS-Lösung gefüllt (10-15 ml), um die Implantationsstellen hydratisieren. </li><li> Während noch in 1x PBS-Lösung eingetaucht, schneiden Sie Fett aus den Uterushörner mit den kleinen chirurgische Scheren. Halten Sie die in 1x PBS-Lösung in der gesamten Präparation eingetaucht Gewebe. </li><li> Halten Sie die Gebärmutterhörner an Ort und Stelle mit der Zange, entfernen Sie eine der Implantationsstellen aus der Gebärmutter mit einem quer durch die inter-Implantationsbereich schneiden, mit den kleinen chirurgische Scheren (1D). Die Implantationsstelle enthält den Fötus durch die umgebenChorioallantoismembran und die uterine, Dezidua und Plazenta-Gewebe. </li><li> Unter Verwendung der Zange, halten Sie die Website vorhanden und machen einen kleinen Schnitt in der Gebärmutterwand neben der Plazenta und Dezidua-Gewebe (1E). Ordnung um den Umfang der Plazenta / Dezidua bis diese sowohl von der Uteruswand und der Chorioallantoismembran dass der Fötus umfasst (1F) getrennt werden. </li><li> Entfernen Sie die Plazenta und die angeschlossenen dezidualen Gewebe und in 1x PBS-Lösung (3-5 ml; siehe Schritt 1.12). </li><li> Platzieren Sie den Fötus durch die Chorioallantoismembran den Uterusgeweben in einer Petrischale mit 1x PBS-Lösung gefüllt befestigt umgeben (3-5 ml). Die Hydratisierung von diesen Geweben wird die Trennung der Chorioallantoismembran von der Gebärmutterwand zu erleichtern (siehe Schritt 1.14). </li><li> Verwendung eines Paares von Fein Spitze Pinzette, ziehen Sie vorsichtig die Decidua (weiß-grau-Schicht) aus der Plazenta Oberfläche. Führen Sie dieseSchritt sorgfältig, um die Integrität der Plazenta und Dezidua-Gewebe (1G) zu halten. </li><li> Legen Sie die Plazenta und Dezidua-Gewebe in zwei separat markierten Gerichte Petri mit 1x PBS-Lösung gefüllt (3-5 ml jeweils). </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Gebärmutterwand vom Chorioallantoismembran mit feinen Spitze Pinzette. Dies sind die Uterusgeweben. </li><li> Legen Sie die uterine Gewebe in einer Petrischale mit 1x PBS-Lösung gefüllt (3-5 ml). </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.8 bis 1.15, bis alle Implantationsstellen verarbeitet worden sind. </li><li> Sammeln Sie mehrere uterine, Dezidua und Plazenta-Gewebe, die Ausbeute an Zellen während enzymatische Verdauung zu verbessern. Die Menge an Gewebe ist abhängig von der Wurfgröße; aber Leukozyten Isolierung erfordert&gt; 2 Stück Gewebe. Hinweis: Weitere detaillierte Informationen über die Präparation der Implantationsstellen auf verschiedenen Schwangerschafts Tage, sehen die Bilder in Kapitel zwei der Guide to Investigati gefundenauf der Maus 42 Schwangerschaft. </li></ol> 2. Uterine, Deziduale und Plazentagewebe Dissoziation <ol><li> Beschriften Sie mehrere sterile 2 ml konische Röhrchen mit dem entsprechenden Gewebe Namen, und legen Sie ein Fläschchen mit 1000 ul der Enzymlösung auf Eis. </li><li> Aus der Petrischale mit 1x PBS-Lösung gefüllt ist, übertragen zwei Stücke (100 bis 150 mg) der Uterus, decidual oder Plazentageweben an eine markierte 2 ml konischen Röhrchen. </li><li> Fügen Sie 500 ul kalten Enzymlösung in jedes 2 ml konischen Röhrchen. </li><li> Mit feinen sterilen Schere, beginnen, um das Gewebe in der enzymatischen Lösung eingetaucht distanzieren, bis es fein zerkleinert wird. Mit der Zeit wird die Suspension ein milchiges Aussehen zu entwickeln. Dieser Schritt sollte mehr als 2 min nicht übersteigt, um Über Manipulation der Probe zu verhindern. </li><li> Sobald das Gewebe wurde gespalten, fügen Sie eine zusätzliche 500 ul kalten enzymatische Lösung für das 2 ml konischen Röhrchen. </li><li> Legen Sie die 2 ml konischen Röhrchen auf Eis. </li><li> Die Schritte 2.2 bis 2.6 wobei jede einzelne Gewebe bis alle Gewebe verarbeitet worden sind. </li><li> Übertragen Sie alle 2 ml konische Röhrchen mit homogenisierten Gewebe (zerkleinerte Gewebe + Enzymlösung) Proben aus dem Eis in einem Brutschrank bei 37 ° C und führen Sie eine sanfte orbitalen Schütteln (80 rpm). Inkubieren für 30 bis 35 min. Sicherzustellen, dass die Temperatur des Inkubators vor Beginn der Inkubationszeit wird stabilisiert. </li><li> Nach der Inkubation, entfernen Sie die 2 ml konische Röhrchen mit dissoziierten Gewebe aus dem Inkubator und legen Sie sie auf Eis, um eine weitere Verdauung zu verhindern. </li><li> Beschriften Sie sterile 50 ml konische Röhrchen nach Gewebetyp. Entfernen Sie den Deckel und ersetzen Sie sie mit einer sterilen Zellsieb (100 &amp; mgr; m Porengröße). </li><li> Gießen Sie die dissoziierten Gewebe aus den 2 ml konische Röhrchen durch die Zelle Sieb mit ~ 20 ml 1x PBS-Lösung. Die Gewebefragmente werden in der Zelle Sieb verbleiben und die Zellsuspension wird durch sie hindurch. </li><li> Waschen Sie die dibestimungsbahnhof Gewebe im Zellsieb 2-3 Mal mit 20 ml 1x PBS-Lösung unter Verwendung einer Übertragungspipette. </li><li> Spülen Sie die leeren 2 ml konische Röhrchen mit 1x PBS-Lösung (1 ml) und den Inhalt durch die Zellsiebe. </li><li> Entfernen Sie die Zelle Siebe aus den 50 ml konische Röhrchen, und ersetzen Sie die Abdeckungen. Zentrifugieren der Röhrchen bei 1.250 × g für 10 min bei 4 ºC. </li><li> Vorsichtig den Überstand aspirieren, ohne das Zellpellet zu stören. Das Zellpellet enthält die isolierten Leukozyten und Stromazellen. </li><li> Resuspendieren das Zellpellet in 1 ml RPMI-Kulturmedium ohne fötales Rinderserum (FBS). Vorsichtig mischen. Verwenden Sie keine Wirbel. </li><li> Fügen Sie 500 ul ordentlich FBS auf eine 5 ml Polystyrol-Kunststoffrohr und langsam überlagern die Zellsuspension. </li><li> Zentrifuge für 10 min bei 1.100 × g ohne Bremse bei RT pelletiert lebensfähigen Zellen während Zelltrümmer im PBS / FBS-Schnittstelle erhalten bleiben. </li><li> Den Überstand aspirieren, ohne den Zellpellet. Die cell Pellet enthält meist lebensfähigen Zellen. </li><li> Optional: Um die mononuklearen Zellen zu konzentrieren, mit einem 20% igem gesättigtem Polysaccharidlösung, wie unten beschrieben. <ol><li> Zellpellet in 1000 ul RPMI Kulturmedium ohne FBS. </li><li> 1 ml 20% gesättigte Polysaccharidlösung in ein 5 ml Polystyrolkunststoffrohr und langsam lagern die Zellsuspension auf die Oberseite dieser Lösung, entsprechend den Anweisungen des Herstellers. Während Schichtung der Probe sollte das Mischen der 20% gesättigten Polysaccharidlösung mit der Zellsuspension. </li><li> Zentrifuge mit einem Ausschwingrotor bei 500 xg für 30 min bei RT ohne Bremse. Es ist sehr wichtig, schalten Sie die Bremse, um zu vermeiden, indem die Zellen und verlieren den Gradienten. Mononuklearen Zellen werden in der Grenzfläche zwischen dem 20% gesättigte Polysaccharidlösung und 1x PBS-Lösung ermittelt werden. </li><li> Absaugen und den Überstand verwerfen. Das Zellpellet enthält meist mononuklearen Zellen. Neinte: Um die Lebensfähigkeit Färbung und intrazelluläre Färbung durchzuführen, siehe Schritt 3. Um Immunphänotypisierung durchführen, finden Sie in Schritt 4. Um die Lebensfähigkeit Färbung und nur extrazelluläre Färbung durchzuführen, siehe Schritt 5. Um eine Zellkultur von isolierten Leukozyten durchführen, siehe Schritt 6. So führen magnetische Zellsortierung, siehe Schritt 7. </li></ol></li></ol> 3. Viability Staining für Fixable Cells <ol><li> Zellpellet in 1100 ul 1x PBS-Lösung. Vorsichtig mischen unter Verwendung einer Mikropipette. </li><li> Dann 100 ul der Zellsuspension in ein 5 ml Polystyrolkunststoffrohr. Fügen Sie 400 ul 1x PBS-Lösung in die 5 ml Polystyrolröhrchen. Dieses Rohr wird eine Steuerung zur Gewebeautofluoreszenz. Lagerung bei 4 ° C bis 3,5 Schritt. </li><li> Übertragen Sie die restlichen 1.000 &amp; mgr; l der Zellsuspension auf eine neue 5 ml Polystyrol-Kunststoffrohr. 1 ul der Lebensfähigkeit Farbstoff und schonend homogenisieren. Inkubation 30 min im Dunkeln bei 4 ° C. </li><li> Nach der Inkubation hinzufügen 1000 &amp; #181; l 1x PBS-Lösung. Vorsichtig mischen von Hand. </li><li> Zentrifuge jeweils 5 ml Polystyrolkunststoffrohre (Schritte 3.2 und 3.3) bei 1250 × g für 10 min bei 4 ºC. Absaugen und den Überstand verwerfen. Hinweis: Das Zellpellet (Schritt 3.3), wird in Schritt 4 Das Zellpellet (Schritt 3.2) wird als eine Kontrolle für die Gewebeautofluoreszenz zu dienen. </li></ol> 4. Immunphänotypisierung <ol><li> Zellpellet in 50 ul Anti-Maus-CD16 / CD32 (verdünnt 1: 100 in FACS-Puffer [0,1% BSA, 0,05% Natriumazid, 1x PBS-Lösung, pH 7,4]). Mischen Sie die Zellsuspension vorsichtig. Verwenden Sie nicht den Wirbel. </li><li> Inkubieren der Zellsuspension in 5 ml Polystyrolröhrchen in der Dunkelheit bei 4 ° C für 10 min. </li><li> Nach der Inkubation werden 50 ul jeder Anti-Leukozyten monoklonalen Antikörper reagieren mit extrazellulären Zelloberflächenmarker oder Isotyp-Kontroll-Antikörper (Antikörperverdünnungen müssen validiert werden). Zum Beispiel, um Leukozyten-Subpopulationen zu analysieren, verwenden Sie Anti-moverwenden Antikörper, die mit den folgenden Leukozyten Zelloberflächenmarker: CD45, Ly6G, F4 / 80, CD11c, CD49b, B220, CD3, CD4 und CD8 (Tabelle 1). </li><li> Sobald Antikörper gegen extrazelluläre Marker auf die 5 ml Polystyrol-Kunststoffröhrchen hinzugefügt, vorsichtig mischen. Inkubieren in der Dunkelheit für 30 min bei 4 ° C. </li><li> Während dieser Inkubation vorbereiten und pre-warm die Fixierung Pufferlösung (mit entionisiertem Wasser verdünnt, 1: 5) auf 37 ° C, falls erforderlich. Halten Sie den Puffer bei 37 ºC in der Finsternis, bis ihre Verwendung notwendig ist. </li><li> Nach 30 min Inkubation, fügen 500 ul FACS Puffer in der 5 ml Polystyrol-Kunststoffrohr und vorsichtig mischen. Dieser Schritt ist notwendig, um die Zellen zu waschen und zu entfernen überschüssiges ungebundenes Antikörper. </li><li> Zentrifugieren Sie die Probe bei 1250 × g bei 4 ° C für 10 min. Absaugen und den Überstand verwerfen. Hinweis: Wenn die intrazelluläre Färbung nicht erforderlich ist, siehe Schritt 5. Wenn die intrazelluläre Färbung erforderlich ist, führen Permeabilisierung und Intrazelldere Färbung hier, und dann mit der Fixierung (Schritt 4.8) fortfahren. </li><li> Fügen Sie 500 ul der vorgewärmten Fixierung Pufferlösung zu dem Zellpellet und Inkubation im Dunkeln für 10 min bei 37 ºC. </li><li> Dispense 500 ul FACS-Puffer in die 5 ml Polystyrol-Kunststoffrohr. Vorsichtig mischen. </li><li> Zentrifugieren Sie die Probe bei 1250 × g bei 4 ° C für 10 min. Absaugen und den Überstand verwerfen. </li><li> Gib 500 &amp; mgr; l FACS-Puffer zu jeder Probe. Diese Proben können nun mittels Durchflusszytometrie analysiert werden. Erwerben Sie die Proben sofort für beste Ergebnisse. </li></ol> 5. Viability Staining für Nicht behebbarer Cells <ol><li> Nach dem extrazellulären Immunphänotypisierung, Zellpellet in 500 ul FACS Puffer. </li><li> 1 &amp; mgr; l 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochlorid (DAPI, 200 ug / ml) kurz vor dem Erwerb der Probe. </li><li> Visualisieren Sie die Proben in 1 - 2 min nach DAPI mit einem Durchflusszytometer. </li></ol><ol><li> Bereiten Sie eine Workstation unter einem sterilen Abzug. Pre-warm das RPMI-Kulturmedium auf 37 ° C mit einem Wasserbad. </li><li> Zellpellet in 1000 &amp; mgr; l FACS-Puffer für die Zellzählung. </li><li> Zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen unter Verwendung eines automatischen Zellzähler oder Hämozytometer und 0,4% Trypanblau-Lösung, nach den Anweisungen des Herstellers. Notieren Sie die Gesamtlebendzellzahl. </li><li> Zentrifugation der Zellen bei 1250 × g bei 4 ° C für 10 min, um die FACS-Puffer zu entfernen. </li><li> Zellpellet in 500 ul vorgewärmtem RPMI Kulturmedium durch vorsichtiges Pipettieren 2 bis 3 Mal. </li><li> Platte die gewünschte Anzahl von Zellen in einer sterilen 24-Well-Platte und bei 37 ° C. Die Inkubationszeit wird von der Fragestellung bestimmt werden. </li></ol> 7. Magnetische Zellsortierung <ol><li> Richten Sie eine saubere Arbeitsstation mit den folgenden Stoffen: MS-Säulen, Magnet Zellseparator, 15ml konische Röhrchen 30 um Vortrennung Filtern und einem mehrgerüstigen. </li><li> Zellpellet in 500 &amp; mgr; l MACS-Puffer (0,5% BSA, 2 mM EDTA, 1 × PBS-Lösung, pH 7,2). </li><li> Unter Verwendung eines automatischen Zellzähler oder Hämozytometer und 0,4% Trypanblau-Lösung, zu zählen und notieren Sie die Gesamtlebendzellzahl. </li><li> Zentrifugieren der Zellen bei 1.250 × g bei 4 ° C für 10 min. Absaugen und den Überstand verwerfen. Fügen Sie eine weitere 500 ul MACS-Puffer. </li><li> Fortfahren, die magnetische Trennung folgenden Empfehlungen des Herstellers durchzuführen. </li><li> Bestimmen Sie die Reinheit mittels Durchflusszytometrie oder Mikroskopie. </li></ol>

Die Autoren offenbaren keine Interessenkonflikte.

Die einheitliche Datenerhebung, die die Fülle und phänotypischen Eigenschaften der infiltrierenden Leukozyten an der Mutter und Fötus-Schnittstelle zeichnet ist wesentlich für das Verständnis der Pathogenese von Schwangerschaftskomplikationen. Verschiedene Techniken wurden beschrieben, dass die Isolierung der infiltrierenden Leukozyten aus den Mäusegeweben am mütterlich-fötalen Grenzfläche während der gesamten Schwangerschaft 31,38,39,43-46 erleichtern. Aber jede Technik unterschiedlich ist, verwend...

Immuntoleranz bei Schwangerschaft ist eine Periode, in Scheidungs ​​Veränderungen im Immunsystem der Mutter erfolgen. Diese Änderungen ermöglichen die Mutter auf den Fötus, eine semi-allogenen Transplantats 1 zu tolerieren. Der Fötus drückt väterlichen Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) -Antigene 2 und fötalen Zellen im mütterlichen Kreislauf 3 gefunden worden ist; jedoch ist der Fötus nicht abgelehnt 4,5. Dieses Rätsel ist nicht vollständig geklärt. Die jüngste Hypothese besagt, dass Mutter und Fötus Toleranz während des Koitus erstellt und Befruchtung und 6,7 gehalten, um eine volle Laufzeit der Schwangerschaft 8-10 erhalten. Eine Aufschlüsselung dieser Mutter und Fötus Toleranz wird in der frühen und späten Stadien der Schwangerschaft 10-16 als einen Mechanismus der Krankheit. Mutter und Fötus Toleranz beinhaltet die Mitwirkung der verschiedenen Leukozyten-Subpopulationen, einschließlich T-Zellen (regulatorische T-Zellen, Th1-Zellen, Th2-Zellen, und Th17-Zellen), macrophages, Neutrophilen, Mastzellen, NK-Zellen, NKT-Zellen, dendritische Zellen und B-Zellen, die Änderung in der Dichte und Lokalisierung während der Schwangerschaft 15,17-19. Der anatomischen Stelle, wo das Immunsystem der Mutter mit den fetalen Antigene 20,21 interagiert - Mutter und Fötus Toleranz wird am Mutter und Fötus-Schnittstelle 20 angereichert. Die Mutter und Fötus-Schnittstelle wird während des Plazenta erstellt, wenn die fetalen extravillösen Trophoblastenzellen dringen in die Uterusschleimhaut 22-24. Auf der fetalen Seite dieser Schnittstelle, die Membranen den Fötus umgibt, schaffen eine spezialisierte Epitheloberfläche innerhalb der Plazenta und die Synzytiotrophoblasten Zellen steuern den Stoffaustausch durch ihre direkten Kontakt mit Blut der Mutter 22. Auf der mütterlichen Seite der Schnittstelle, rekrutiert die decidua einen heterogenen Pool von Leukozyten, die bei Mäusen verantwortlich für 30% bis 50% aller Deciduazellen. Zusätzlich zu ihrer Beteiligung an Maternal Immuntoleranz, diese Zellen sind wichtige Mitwirkende zu verschiedenen Prozessen während der Schwangerschaft, z. B. der Schutz der reproduktiven Fläche von Infektionen, Befruchtung, Embryoimplantation 7,25, dezidualen Angiogenese 26, vaskuläre Remodeling 24,27, Trophoblastinvasion 28, Plazenta Entwicklungs 24,25, und schließlich Arbeit und Lieferung 15,17. Daher ist die Untersuchung der Leukozyten in Mutter und Fötus Toleranz beteiligt wichtig, die Aufklärung der Pathogenese von Schwangerschaftskomplikationen. Während die Verwendung von Immunhistochemie und Immunfluoreszenz wurden Daten für die direkte Visualisierung und Lokalisierung von Gebärmutter-, decidual oder Plazenta Leukozyten 29,30 erzeugt, Durchflusszytometrie-Analyse wurde weiterhin offenbart spezifische Untergruppen von Leukozyten, die in jedem dieser Gewebe 31,32. Zusätzlich Durchflusszytometrie verwendet worden, um die Dichte und den Anteil von mater bestimmennal-fetalen Schnittstelle Leukozyten 33 und Expression von extrazellulären und intrazellulären Proteinen 8-10,34. Durchflusszytometrische Analyse von Leukozyten an der Mutter und Fötus-Schnittstelle benötigt eine Einzelzellsuspension. Um infiltrieren Leukozyten aus dem dezidualen, Gebärmutter und Plazenta-Gewebe zu isolieren, zwei Methoden der Gewebedissoziation verwendet: mechanische und enzymatische. Beide Verfahren ermöglichen die Trennung von infiltrierten Leukocyten aus der extrazellulären Matrix (ECM) dieser Gewebe. Enzymatische Gewebedissoziation überlegen ist mechanischen Gewebedissoziation, da es eine höhere Ausbeute an Leukozyten mit geringer Scherkraft-verbundenen Schäden 35. Folglich mechanische Gewebedissoziation erfordert die Bündelung Gewebe 36, das die Variabilität und Heterogenität der Proben erhöhen kann. Dennoch können mechanische Dissoziation der Wahl sein, wenn das Antigen von Interesse kann durch enzymatische Spaltung oder geändert werden, wenn die Funktionalität der Zelles von Interesse bewahrt werden müssen (z. B. Cytotoxizität von NK-Zellen) 35. Die Verwendung von Proteolyse mit spezifischen Enzymen, die ECM abbauen beseitigt die mechanische Dissoziation beobachtet geringe Ausbeuten. Mehrere Studien haben die Verwendung von Trypsin 32, Collagenase 37, DNase 31, Dispase 38 und kommerzielle Cocktails verschiedener Enzyme 32,39 gemeldet. Jedoch muß die Art und Konzentration der verschiedenen Enzyme und die Dauer der Verdauung genau definiert und um zur Aufrechterhaltung der Integrität der Zelloberfläche antigene Epitope zur Immunphänotypisierung erforderlich sicherzustellen, validiert werden. Die verschiedenen Oberflächenstrukturen sind unterschiedlich anfällig für Zerstörung durch verschiedene Enzyme, mit einigen Enzymen, wie Trypsin, wobei berüchtigt Strippen von vielen monoklonalen Antikörpern erkannt Leukozyten Oberflächenepitope. Hierin eingeführt ist ein Verfahren unter Verwendung eines proteolytic und kollagenolytische Enzymcocktail, genannt Accutase. Diese enzymatische Lösung ist sanft genug, während immer noch effizienter in distanziert Mausgeweben an der Mutter und Fötus-Schnittstelle und erfordert nicht die Zugabe von anderen distanziert Reagenzien oder Serum, die Dissoziation Reaktion zu beenden. Darüber hinaus ist es gebrauchsfertig geliefert zu bedienen und, obwohl die Zeit der Dissoziation Annahmen validiert werden soll, ist robuster als die oben erwähnten Enzyme, 40,41. Die Verwendung einer Kombination beider Arten von Gewebe-Disaggregation verbessert die Qualität und die Menge der Zellen erhalten wird; Daher haben mehrere Studien die kombinierte Verwendung von mechanischen und enzymatischen Spaltung mit befriedigenden Ergebnissen 31,32,37 implementiert. Das hier beschriebene Protokoll wurde eingerichtet und in unserem Labor validiert; Es verwendet eine Kombination eines leichten mechanischen Dissoziation gefolgt von einem robusten enzymatische Zerlegung. Dieses Protokoll ermöglicht die Isolierung und die weitere Untersuchung vondie Infiltration von Leukozyten in Mausgeweben an der Mutter und Fötus-Schnittstelle (Uterus, Dezidua und Plazenta). Das folgende Protokoll unterhält auch die Integrität der Zelloberflächenmarker und Ausbeuten genügend lebensfähige Zellen für nachfolgende Anwendungen wie durch durchflusszytometrische Analyse demonstriert. Schließlich dieses Protokoll erhält die Konsistenz der Zellpräparation für die Analyse und den Vergleich von verschiedenen Mausgeweben zu komponieren die Mutter und Fötus-Schnittstelle.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Magentic Cell Separation&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>MS Columns</td><td>Militenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Cell Separator</td><td>Militenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>30 &amp;mu;m pre-separation filters</td><td>Militenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Multistand</td><td>Militenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>15 ml conical tubes</td><td>Thermo Fisher</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>MACS Buffer</td><td>Militenyi Biotec</td><td>Laboratory preparation</td><td>(0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1x PBS, pH 7.2)</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Accutase enzymatic solution</td><td>Life Technologies</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD16/CD32</td><td>BD Biosciences</td><td>533142</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse extracellular antibodies</td><td>BD Bioscences/eBiosciences</td><td></td><td>&lt;strong&gt;Table 1&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Fisher</td><td>S227-500</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD viability dye</td><td>Life Technologies</td><td>L23105</td><td></td></tr><tr><td>Fixation buffer solution</td><td>BD Biosciences</td><td>558049</td><td></td></tr><tr><td>FACS Buffer</td><td>BD Biosciences</td><td>Laboratory preparation</td><td>0.1% BSA, 0.05% sodium azide, 1x PBS, pH 7.4</td></tr><tr><td>Trypan blue solution 0.4%</td><td>BIO-RAD</td><td>145-0013</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Additional Instruments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Incubator with shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td>MaxQ 4450</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>BD LSRFortessa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>Legend LXTR</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum system</td><td></td><td></td><td>laboratory constructed</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>Incubator 3307</td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Precision</td><td>51221035</td><td></td></tr><tr><td>Cell counter</td><td>BIO-RAD</td><td>TC20 Automated Cell Counter</td><td></td></tr><tr><td>Optical and fluorescence microscopes</td><td>Zeiss and Olympus</td><td>Zeiss LSM780 and Olympus CKX41</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface

Immuntoleranz bei Schwangerschaft erfordert, dass das Immunsystem der Mutter erfährt Scheidungsänderungen, um zu akzeptieren und zu pflegen sich entwickelnden Fötus. Diese Toleranz wird während des Koitus eingeleitet, während der Befruchtung und Implantation gegründet und während der Schwangerschaft beibehalten wird. Aktive zellulären und molekularen Mediatoren von Mutter und Fötus Toleranz werden an der Stelle des Kontaktes zwischen fetalen und mütterlichen Gewebe, wie die Mutter und Fötus-Schnittstelle, die die Plazenta und die Gebärmutter und dezidualen Gewebe enthält bekannt bereichert. Diese Schnittstelle wird von Stromazellen und infiltrieren Leukozyten besteht, und deren Fülle und phänotypischen Eigenschaften im Laufe der Schwangerschaft zu ändern. Infiltrieren Leukozyten an der Mutter und Fötus-Schnittstelle umfassen Neutrophile, Makrophagen, dendritische Zellen, Mastzellen, T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen und NKT-Zellen, die zusammen das lokale Mikroumgebung, die Schwangerschaft aufrecht zu erstellen. Ein Ungleichgewicht zwischen diesen Zellen oder jede inappropriate Veränderung ihrer Phänotypen wird als ein Mechanismus der Erkrankung in der Schwangerschaft. Daher ist die Untersuchung der Leukozyten, die die Mutter und Fötus Schnittstelle infiltrieren wesentlich, um die Immunmechanismen, die schwangerschaftsbedingten Komplikationen aufzuklären. Hierin ist ein Protokoll, das eine Kombination von leichter mechanischer Dissoziation gefolgt von einem robusten enzymatische Zerlegung mit einem proteolytischen und kollagenolytischen Enzymcocktail, um die Infiltration von Leukozyten aus den Mäusegeweben an der mütterlich-fötalen Grenzfläche zu isolieren, verwendet. Dieses Protokoll ermöglicht die Isolierung der hohen Zahl von lebensfähigen Leukozyten (&gt; 70%) mit einer ausreichend konservierten antigenen und funktionellen Eigenschaften. Isolierten Leukozyten können dann durch verschiedene Techniken, einschließlich Immunphänotypisierung Zellsortierung, Imaging, Immunoblotting-mRNA-Expression, Zellkultur und in vitro funktionelle Assays wie gemischte Leukozytenreaktionen, Proliferation oder Zytotoxizität Assays analysiert werden.

Die Präparation von Maus-Geweben von der mütterlich-fötalen Grenzfläche ist in Abbildung 1 gezeigt ist; Dieses Verfahren umfasst das Öffnen der Bauchhöhle (1A, B), Gebärmutterhörner (1C), die die Implantationsstellen (1D) und die Sammlung der Uterusgeweben (1E), Plazenta (1F) und Dezidua-Gewebe (1G) bei 16,5 dpc. 2 zeigt die Morphologie von isolierten Makrophagen (F4 / 80 +) aus...

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Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

Isolierung von Leukozyten aus dem Mausgeweben an der Maternal-Fetal-Schnittstelle

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Serie: Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine encephalomyelitis virus (TMEV) via a rapid intracranial injection technique and how to purify a leukocyte-enriched population of infiltrating cells from whole brain. Briefly, mice are anesthetized with isoflurane in a closed chamber and are free-hand injected with a Hamilton syringe into the frontal cortex. Mice are then killed at various times after infection by isoflurane overdose and whole brains are extracted and homogenized in RPMI with a Tenbroeck tissue grinder. Brain homogenates are centrifuged through a continuous 30% Percoll gradient to remove the myelin and other cell debris. The cell suspension is then strained at 40 &mu;m, washed and centrifuged on a discontinuous Ficoll-Paque Plus gradient to select and purify the leukocytes. The leukocytes are then washed and resuspended in appropriate buffers for immunophenotyping by flow cytometry. Flow cytometry reveals a population of innate immune cells at the early stages of infection in C57BL/6 mice. At 24 hours post infection, multiple subsets of immune cells are present in the BILs, with an enriched population of Gr1+, CD11b+ and F4/80+cells. Therefore, this method is useful in characterizing the immune response to acute infection in the brain.

A rapid method to obtain infiltrating leukocytes from the murine brain is described. This method utilizes a continuous Percoll gradient and discontinuous Ficoll gradient to select and purify the leukocyte-enriched layer. Isolated leukocytes may then be characterized by flow cytometric measurements.

Isolierung von Brain-infiltrierenden Leukozyten

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, and is necessary for the emergence of definitive HSPC from the murine extra embryonic yolk sac, placenta, umbilical vessels, and the embryonic aorta-gonad-mesonephros (AGM) region. The transient nature and small size of this cell population renders its reproducible isolation for careful quantification and experimental applications technically difficult. We have established a fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based protocol for simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC during their peak generation times in the yolk sac and AGM. We demonstrate methods for dissection of yolk sac and AGM tissues from mouse embryos, and we present optimized tissue digestion and antibody conjugation conditions for maximal cell survival prior to identification and retrieval via FACS. Representative FACS analysis plots are shown that identify the hemogenic endothelial cell and HSPC phenotypes, and describe a methylcellulose-based assay for evaluating their blood forming potential on a clonal level.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) derive from specialized (hemogenic) endothelial cells during development, yet little is known about the process by which some endothelial cells specify to become blood forming. We demonstrate a flow-cytometry based method allowing simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC from murine embryonic tissues.

Isolierung von murinen embryonalen Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Entwicklungsbiologie

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and bacteria 1. Mucosae are also inductive sites in the host to generate immunity against pathogens, such as the Peyers patches in the intestinal tract and the nasal-associated lymphoreticular tissue in the respiratory tract. This unique feature brings mucosal immunity as a crucial player of the host defense system. Many studies have been focused on gastrointestinal and respiratory mucosal sites. However, there has been little investigation of reproductive mucosal sites. The genital tract mucosa is the primary infection site for sexually transmitted diseases (STD), including bacterial and viral infections. STDs are one of the most critical health challenges facing the world today. Centers for Disease Control and Prevention estimates that there are 19 million new infectious every year in the United States. STDs cost the U.S. health care system $17 billion every year 2, and cost individuals even more in immediate and life-long health consequences. In order to confront this challenge, a greater understanding of reproductive mucosal immunity is needed and isolating lymphocytes is an essential component of these studies. Here, we present a method to reproducibly isolate lymphocytes from murine female genital tracts for immunological studies that can be modified for adaption to other species. The method described below is based on one mouse.&#x2003;

An efficient way to isolate lymphocytes from mouse genital tract is described. This method takes advantage of enzyme digestion and Percoll gradient separation to allow efficient isolation. This technique is also adaptable to for use in other species

Isolierung von Lymphozyten aus Maus Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua parietalis). This interface is the anatomical site of contact between maternal and fetal tissues; therefore, it is an immunological site of action during pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface play a central role in implantation, pregnancy maintenance, and timing of delivery. Therefore, phenotypic and functional characterizations of these leukocytes will provide insight into the mechanisms that lead to&#160;pregnancy disorders. Several protocols have been described in order to isolate infiltrating leukocytes from the decidua basalis and decidua parietalis; however, the lack of consistency in the reagents, enzymes, and times of incubation makes it difficult to compare these results. Described herein is&#160;a novel approach that combines the use of gentle mechanical and enzymatic dissociation techniques to preserve the viability and integrity of extracellular and intracellular markers in leukocytes isolated from the human tissues at the maternal-fetal interface. Aside from immunophenotyping, cell culture, and cell sorting, the future applications of this protocol are numerous and varied. Following this protocol, the isolated leukocytes can be used to determine DNA methylation, expression of target genes, in vitro leukocyte functionality (i.e., phagocytosis, cytotoxicity, T-cell proliferation, and plasticity, etc.), and the production of reactive oxygen species at the maternal-fetal interface. Additionally, using the described protocol, this laboratory has been able to describe new and rare leukocytes at the maternal-fetal interface.

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

Isolation von Leukozyten aus dem menschlichen Mutter und Fötus-Schnittstelle

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

Isolation der infiltrierenden Leukozyten aus Mäusehaut unter Verwendung enzymatischer Digest und Gradiententrennung

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

Isolieren von Lymphozyten aus der Maus kleinen intestinalen Immunsystems

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized stromal cells and immune cells, are responsible for the secretion of hormonal and inflammatory factors which are critical for successful blastocyst implantation, placental development and play a role in the initiation of labor at term and preterm. Many pregnancy complications can arise from perturbations of a fine balance of different cell populations comprising decidua. Alterations in the proportion of specific decidual cell types may disrupt these crucial processes and increase the risk of developing serious complications of pregnancy, such as embryo implantation failure, intrauterine growth restriction, preeclampsia and preterm labor. The protocol outlined here demonstrates a cost and time effective method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae. By combining enzymatic digestion and gentle mechanical disruption of the decidual tissue, a high yield of decidual cells was obtained with virtually no chorion contamination. Importantly, isolated decidual cells were characterized (stromal cells (55-60%), leukocytes (35%), epithelial (1%) or trophoblast (0.01%) cells) and maintained high viability (80%) which was confirmed by multicolor imaging flow cytometry assay. This protocol is specific to the decidua parietalis and can be adapted to first and second trimester placentae. Once isolated, decidual cells can be used for a multitude of experimental applications aiming to understand the role of different decidual cell sub-populations in pregnancy complications.

This protocol demonstrates a method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae which can be used for a variety of applications (i.e. immunocytochemistry, flow cytometry, etc.) aiming to study the role of different cell populations in pregnancy complications.

Isolation von primären menschlichen Deziduale Zellen aus der fetalen Membranen der Begriff Plazentas

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...

Medizin

Isolation of Uterine Innate Lymphoid Cells for Analysis by Flow Cytometry

Described here is a simple method to isolate and phenotype mouse group 1 uterine innate lymphoid cells (g1 uILCs) from individual pregnant uterus by flow cytometry. The protocol describes how to set up time mating to obtain multiple synchronous dams, the mechanical and enzymatic digestion of the pregnant uterus, the staining of single-cell suspensions, and a FACS strategy to phenotype and discriminate g1 uILCs. Although this method inevitably loses the spatial information of cellular distribution within the tissue, the protocol has been successfully applied to determine uILC heterogeneity, their response to maternal and foetal factors affecting pregnancy, their gene expression profile, and their functions.

This is a method to isolate uterine lymphoid cells from both pregnant and non-pregnant mice. This method can be used for multiple downstream applications such as FACS phenotyping, cell sorting, functional assays, RNA-seq, and proteomics. The protocol here demonstrates how to phenotype group 1 uterine innate lymphoid cells by flow cytometry.

Isolierung von angeborenen lymphatischen Zellen der Gebärmutter zur Analyse mittels Durchflusszytometrie

Described here is a simple method to isolate and phenotype mouse group 1 uterine innate lymphoid cells (g1 uILCs) from individual pregnant uterus by flow ...

<meta charset="utf8"></head><body>Isolierung von Immun- und Nicht-Immunzellen aus der Lunge von Mäusen für die Durchflusszytometrie

Isolation of Live Myeloid and Epithelial Cell Populations from the Mouse Lung

The lung is continuously exposed to pathogens and other noxious environmental stimuli, rendering it vulnerable to damage, dysfunction, and the development of disease. Studies utilizing mouse models of respiratory infection, allergy, fibrosis, and cancer have been critical to reveal mechanisms of disease progression and identify therapeutic targets. However, most studies focused on the mouse lung prioritize the isolation of either immune cells or epithelial cells, rather than both populations concurrently. Here, we describe a method for preparing a comprehensive single-cell suspension of both immune and non-immune populations suitable for flow cytometry and fluorescence-activated cell sorting. These populations include epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, and a variety of myeloid cell subsets. This protocol entails bronchoalveolar lavage and subsequent inflation of the lungs with dispase. Lungs are then digested in a liberase mixture. This method of processing liberates a variety of diverse cell types and results in a single-cell suspension that does not require manual dissociation against a filter, promoting cell survival and yielding high numbers of live cells for downstream analyses. In this protocol, we also define gating schemes for epithelial and myeloid cell subsets in both na&#239;ve and influenza-infected lungs. Simultaneous isolation of live immune and non-immune cells is key for interrogating intercellular crosstalk and gaining a deeper understanding of lung biology in health and disease.

<meta charset="utf8"></head><body>Isolierung von lebenden myeloischen und epithelialen Zellpopulationen aus der Lunge der Maus

This protocol details the isolation of live immune and non-immune populations from the mouse lung at a steady state and following influenza infection. It also provides gating strategies for identifying epithelial and myeloid cell subsets.

Isolierung von lebenden myeloischen und epithelialen Zellpopulationen aus der Lunge der Maus

The lung is continuously exposed to pathogens and other noxious environmental stimuli, rendering it vulnerable to damage, dysfunction, and the development ...

Isolierung von Leukozyten aus dem Mausgeweben an der Maternal-Fetal-Schnittstelle

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Isolierung von Brain-infiltrierenden Leukozyten

Isolierung von murinen embryonalen Hemogenic Endothelial Cells

Isolierung von Lymphozyten aus Maus Genital Tract Mucosa

Isolation von Leukozyten aus dem menschlichen Mutter und Fötus-Schnittstelle

Isolation der infiltrierenden Leukozyten aus Mäusehaut unter Verwendung enzymatischer Digest und Gradiententrennung

Isolieren von Lymphozyten aus der Maus kleinen intestinalen Immunsystems

Isolation von primären menschlichen Deziduale Zellen aus der fetalen Membranen der Begriff Plazentas

Isolierung von angeborenen lymphatischen Zellen der Gebärmutter zur Analyse mittels Durchflusszytometrie

Isolierung von lebenden myeloischen und epithelialen Zellpopulationen aus der Lunge der Maus

Isolierung von lebenden myeloischen und epithelialen Zellpopulationen aus der Lunge der Maus