Diese Arbeit wurde vom NIH Zuschüsse EY019312 und EY021126 (VJK), EY002687 an die Augenklinik und Visual Sciences an der Washington University unterstützt und von der Forschung zur Verhütung Blindheit.

Alle Versuchsprotokolle wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren und wurden von der Institutional Animal Studies Committee an der Washington Universität zugelassen. 1. Einrichten der Perfusion und Probenständer <ol><li> Bereiten Lösung für Netzhautblutung frisch am Tag des Experiments. Verwenden Sie destilliertes und deionisiertes Wasser. Verwenden Sie eine der folgenden drei Lösungen. <ol><li> Bereiten bicarbonathaltige Ames-Lösung (1 l): 1 Flasche Ames &#39;Medien und 1,9 g NaHCO 3, </li><li> Vorbereitung Locke-Lösung (in mM): 112,5 NaCl, 3,6 KCl, 2,4 MgCl 2, 1,2 CaCl 2, 10,0 HEPES, 20,0 NaHCO 3, 3,0 Na-Succinat, 0,5 Na Glutamat, 0,02 EDTA und 10,0 Glucose, 0,1% MEM-Vitamine und Aminosäuren Säuren </li><li> Vorbereitung HEPES-gepufferter Ringer-Lösung (in mM): 133,3 NaCl, 3,3 KCl, 2,0 MgCl 2, 1,0 CaCl 2, 10,0 Glucose, 0,01 EDTA, 12,0 HEPES, pHeingestellt auf 7,5 ~ 5,8 ml 1 M NaOH, fügen 0,72 g / L Kulturmedium Leibovitz L-15. Verwenden Sie 20 bis 50 &amp; mgr; M DL-AP4 und 50 bis 100 &amp; mgr; M BaCl 2, um den Photorezeptor Antwort mit jeder Perfusion Medien zu isolieren. </li></ol></li><li> Vorbereitung Lösung für Elektroden 28 (in mM): 140,0 NaCl, 3,6 KCl, 2,4 MgCl 2, 1,2 CaCl 2, 3 HEPES, 0,01 EDTA und pH-Wert auf 7,4 bis 7,5 mit NaOH. Elektrodenlösung kann bei Raumtemperatur mehrere Monate gelagert werden. </li><li> Bereiten Sie und testen Sie den Probenhalter. <ol><li> Kleben Sie schwarz / grau Filterpapier auf der Oberseite der Kuppeln der untere Teil des Probenhalters (siehe Abbildung 1A). Verteilt zweikomponentigen 5 min Epoxidkleber vorsichtig um die Kanten der flachen Oberseiten der Dome. Wenn nötig, machen Sie es unter Dissektionsmikroskop. </li><li> Warten Sie, bis der Leim ist fast trocken (ca. 4 min) und drücken Sie die Filterpapier auf den Kuppeln unter Verwendung einer Flachs Artikel. Kleber Filterpapier mindestens einen Tag vor dem Experiment. DieFilterpapier kann mehrfach verwendet werden, sollten aber nach einem Monat der Aufnahmen ersetzt. Verwenden Sie 70% Ethanol zum Kuppeln sorgfältig von jedem Kleberrückstand reinigen vor der Installation der Ersatzpapier. </li><li> Füllen Sie die Elektrode Kanäle mit Elektrodenlösung versucht, alle Luftblasen zu vermeiden, und schrauben Pelletelektroden mit einem Gewindeadapter in die Elektrodenkanäle eingeschlossen (siehe 1A und B). Verbinden Sie die oberen und unteren Teile des Probenhalters mit vier Schrauben und füllen Sie die Perfusion Linien mit Elektrodenlösung. </li><li> Den Widerstand und die Spannung zwischen den Leitungen jedes Elektrodenpaar mit einem Multimeter (1B). Widerstand sollte unter 100 &amp; omega; k und die Spannung unter 10 mV, wenn die Kanäle sind blasenfrei und die Elektroden in einem guten Zustand sind sein. </li></ol></li><li> Gießen Sie 400-700 ml Perfusion Medien in der Glasflasche. Getrennte und weitere 300 ml in der Präparation der Netzhaut und s verwendet werdenriss es in einem Kühlschrank. Stellen Sie den Infusionsschlauch in den Wärmetauscher-Block und setzen Sie den vorgeheizten Block auf der Heizplatte (siehe Abbildung 1D). </li><li> Schließen Sie die Flasche mit einer Kappe, die hat Verbindungen zu 2 / O 2 Gas Co (wenn Ames &#39;oder Lockes verwendet wird) und für Infusionsschlauch (siehe Abbildung 1D). Heizen Sie die Flasche mit den Medien, um 37 o C und auf der Heizplatte oder auf der Oberseite des Lichtstimulationseinheit in einem Wasserbad auf 37 festgelegt - 39 o C 17. <ol><li> Prime die Perfusion Linien durch Perfusion mit Medium füllen sie das schwerkraftgetriebenen Strömung zu initiieren. <ol><li> Im LKC-System, stellen Sie die Flasche auf der Oberseite des Stimulators Einheit 17, um eine signifikante Gravitationsfluss, wird dann durch Durchflussregler, ohne durch die Senkung Ebene der Perfusionslösung in der Flasche während des Experiments beeinflusst angepasst werden. </li><li> In Ocuscience System, legen Sie die perfusion Flasche innerhalb des Faradayschen Käfigs, um das Rauschen zu minimieren und legen lange Perfusion Ausgangsleitungen von dem Probenhalter (siehe Schritt 2.8) und unterhalb des Niveaus des Probenhalters (und die Perfusion Flasche) zur Schwer Antrieb der Lösung zu erhöhen. Schirmen diese Ausgangsleitungen und die Abschirmung auf Masse des Verstärkers, um die Kopplung des elektromagnetischen Störungen auf das ERG-Signal zu vermeiden. </li></ol></li></ol></li><li> Stellen Sie die Durchblutung und zum 3 - 5 ml / min unter Verwendung von Durchflussreglern. Schließen Sie 5% CO 2/95% O 2 Gas aus einem Zylinder mit der richtigen Regler und stellen Sie die Durchflussrate zu stabilen Blasenbildung der Medien in der Flasche durch einen Luftstein zu gewährleisten. </li></ol> 2. Probenvorbereitung <ol><li> Montieren Sie sauber und scharf Dissektionsinstrumente einschließlich gerader Blattmikroschere, eine oder zwei 45 o Pinzette, Rasierklinge und ein rechteckiges Stück Filterpapier. </li><li> Pour etwa 200 ml kaltem Perfusion Lösung in eine große Petrischale, so dass der gesamte untere Teil des Probenhalters (einschließlich der Hauben) können in die Lösung eingetaucht werden. Dieser Schritt wird wichtig, wenn die Montage der Netzhaut auf den Kuppeln (siehe Schritt 2.6). Obwohl einige Lösungen wurden entwickelt, um mit Carbogen (5% CO 2/95% O 2) gesättigt werden, ist dies nicht wesentlich für die Zwecke Dissektion und war nicht in der hier beschriebenen Experimente durchgeführt. </li><li> Für ein typisches Experiment, halten Tiere in 12/12 Stunden hell / dunkel-Zyklus und dunkel passen sie für 6-12 Stunden vor den Aufnahmen. Euthanize das Tier durch CO 2 Inhalation durch Genickbruch folgte unter dim rotes Licht und alles tun, die folgenden Verfahren, in dim rot oder IR-Licht (Verwendung zB Rotfilter vor dem Mikroskoplichtquelle). <ol><li> Ziehen Sie die Augen, die von mit einer Pinzette und setzen Sie sie in den Medien. Platzieren Sie ein Auge in einer Zeit auf einem kleinen Stück Papier (zB einige regelmäßige Filterpapier) und machen soleuchtet etwa auf dem Niveau der Ora serrata, während das Auge mit einer Pinzette (dies ist außerhalb der Lösung hier getan) hält. </li></ol></li><li> Schneiden Sie entlang der Ora serrata (oder näher am Äquator des Auges) mit Mikroschere und entfernen Sie die Hornhaut und die Linse. Setzen Sie die Augenmuschel in der kalten Medien im großen Petrischale und wiederholen Sie den Vorgang mit dem anderen Auge. </li><li> Schneiden Sie einen kleinen Schnitt von der Spitze der Augenmuschel zum Sehnerv hin, indem sie die Schere zwischen der Netzhaut und Lederhaut, um die Netzhaut so intakt wie möglich zu halten. Fassen Sie die Lederhaut von beiden Seiten des Einschnitts durch Verwendung von zwei Pinzetten und die Pinzette ziehen voneinander entfernt, um die Netzhaut zu lösen. <ol><li> Schneiden Sie den Sehnerv und versuchen, die Netzhaut mit einem Minimum an physischen Kontakt mit dem distalen Oberfläche zu isolieren. RPE wird meist automatisch lösen sich von der Netzhaut während der Präparation Prozess. Es ist wichtiger, um mechanische Störungen der Netzhaut, als die Vorform zu vermeidendissection schnell, in der Regel die Netzhaut kann mindestens 30 min in der Lösung inkubiert werden, ohne signifikante Auswirkungen auf die Antworteigenschaften. </li></ol></li><li> Montieren Sie die Netzhaut auf die Kuppeln des Probenhalters (Abbildung 1c). Tauchen Sie den unteren Teil des Probenhalters in der Petrischale mit den Netzhäute präpariert. Gleiten die Retina, Photorezeptorseite (die konvexe Oberfläche des isolierten Netzhaut) nach oben, oberhalb der Kuppel und heben Sie den Probenhalter, so dass der Netzhaut legt auf dem Filterpapier. Wiederholen Sie den Vorgang für die anderen Netzhaut. </li><li> Trocknen Sie die Halteplatte vorsichtig, um elektrische Übersprechen zwischen der Netzhaut sowie Rausch- und Signal Rangieren zu verhindern. Probenhalter ist mit O-Ringen um den unteren Teil Kuppeln verschüttet wird zwischen der unteren und oberen Teile des Halters zu verhindern als auch die elektrische Isolierung der Photorezeptor und die Ganglienzellseiten der einzelnen Netzhaut zu helfen. Befestigen Sie den oberen Teil der Halterung mit den vier Schrauben (siehe Abbildung 1B) und füllen Sie die Perfusion Kanäle mit Perfusionslösung unter Verwendung einer Spritze und eine Nadel. </li><li> Übertragen der Probenhalter neben dem Wärmetauscherblock und Verbinden der Eingangs- und Ausgangs Perfusionsleitungen zur Probenhalterung (Figur 1D). Die Elektroden an der ERG-Verstärker (oberen Elektroden zu verbinden, um den Boden / Minus-Pin in den Verstärker) und befestigen Sie den Stimulator / Steuereinheit auf dem Probenhalter, indem Sie einen Adapter oder schieben Sie das Heizkissen in den Stimulatoreinheit je nachdem, welche in vivo ERG System verwendet wird. </li></ol> 3. Recordings <ol><li> Konfigurieren Sie die Verstärker und Reiz von Einstellungen mithilfe von Software der in vivo-System. Stellen Sie den Akquisitionsfrequenz auf einen Wert zwischen 1 und 10 kHz und eine Tiefpaßfilterung bis 300 Hz. Verwenden Sie keine Hochpassfilterung. Verwenden Sie 60 Hz (oder 50 Hz in Europa) Notch-Filter, falls erforderlich. </li><li> Nehmen Sie Grundlinie ohne Lichtstimulation und Witzh dim Stimulation (z. B. grünes Licht von -35 dB oder 0,3 mCd sm -2), die für eine gute elektrische Verbindung zwischen den Elektroden und der Netzhaut Probe zu testen. Warten Sie 10 bis 20 Minuten vor dem Beginn der Datenerfassung, so dass Netzhauttemperatur und Funktion zu erreichen einen stabilen Zustand. <ol><li> Wählen Reizparameter nach einem bestimmten Experiment und starten Sie die Datenerfassung. ZB verwenden grünes Licht von -40 bis 0 dB oder 0,1 bis zu 1.000 mCd sm -2 für eine scotopic Reaktion Familie. Verwenden Sie etwa 2 bis 3 log-Einheiten heller Blitze in photopischen Aufzeichnungen, wo Stangen müssen von Hintergrundlicht unterdrückt werden (3-30 Cdm -2) oder eine Sonde Flash (etwa 1,3 Cd sm -2 = 1 dB, siehe Abbildung 3). </li><li> Beachten Sie jedoch, dass die exakte Lichtintensitätswerte könnten etwas abhängig von Ihrem System-Kalibrierung und experimentellen Bedingungen sein. Als Faustregel gilt, Stufenstärken aufgeschlüsselt nach 5-10-fache im Vergleich zu in vivo </em&gt; Aufnahmen bei der Verwendung von grünem Licht 17. Eine schwarze Abdeckung mit Öffnungen oberhalb der Netzhaut (im Gewerbeadaptersystem im Lieferumfang enthalten) kann verwendet werden, um die Lichtstreuung in den Probenhalter zu reduzieren und eine homogene und gleich Stimulation beider Netzhäute von der Ganzfeld Sphäre der kommerziellen in vivo Systeme werden. HINWEIS: Bei sich von dunkeladaptierten Retina, die Intensitäten der Testwallungen bei einem typischen Experiment Bleich nur ein vernachlässigbarer Anteil des Pigments verwendet wird, so dass das Fehlen von RPE getriebenen Regeneration kein Thema ist. Darüber hinaus hat es sich bereits gezeigt, dass Konus Pigment Regeneration noch Platz in der isolierten Netzhaut über den Müller Zelle visuellen Zyklus 20 zu nehmen. </li></ol></li><li> Wie Versuche dauern typischerweise 30 min bis zu mehreren Stunden, überwacht die Basisliniendrift, Geräuschpegel und Reaktionsstabilität während des Versuchs als Änderungen könnten diese technischen Probleme anzugeben. HINWEIS: Erhöhter Schall oder Abnahmed Antwortamplituden kann darauf hindeuten, Luftblasen in den Perfusion oder Elektrodenkanäle, zu niedrige oder hohe Temperatur, Lösung Leck / Spill oder Verschiebung der Netzhaut. </li></ol> 4. Reinigung <ol><li> Nehmen Sie den Probenhalter aus den Perfusion Linien, öffnen Sie sie und spülen Sie die Netzhaut von dem Filterpapier. Entfernen Sie die Elektroden und spülen Sie sie mit destilliertem Wasser (nicht mit Ethanol). Reinigen Sie den Probenhalter (einschließlich der Perfusions-Kanäle) mit Ethanol und / oder destilliertes Wasser. Flush Infusionsschlauch vorsichtig mit&gt; 70% Ethanol. </li><li> Spülen Sie die Durchblutung Flasche mit destilliertem Wasser (keine Reinigungsmittel). Ethanol kann auch verwendet werden, um die Flasche zu reinigen. </li></ol>

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Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-driven+translocation+of+signaling+proteins+in+vertebrate+photoreceptors.">Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors.</a> Trends Cell Biol. 16, 560-568 (2006).</li><li>Schneeweis, D. M., Schnapf, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+photovoltage+of+macaque+cone+photoreceptors:+adaptation,+noise,+and+kinetics.">The photovoltage of macaque cone photoreceptors: adaptation, noise, and kinetics.</a> J. Neurosci. 19, 1203-1216 (1999).</li><li>Heikkinen, H., Vinberg, F., Nymark, S., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesopic+background+lights+enhance+dark-adapted+cone+ERG+flash+responses+in+the+intact+mouse+retina:+a+possible+role+for+gap+junctional+decoupling.">Mesopic background lights enhance dark-adapted cone ERG flash responses in the intact mouse retina: a possible role for gap junctional decoupling.</a> J. Neurophysiol. 105, 2309-2318 (2011).</li><li>Gouras, P., MacKay, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+in+amplitude+of+the+human+cone+electroretinogram+with+light+adaptation.">Growth in amplitude of the human cone electroretinogram with light adaptation.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30, 625-630 (1989).</li><li>Peachey, N. S., Goto, Y., al-Ubaidi, M. R., Naash, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+mouse+cone-mediated+electroretinogram+during+light+adaptation.">Properties of the mouse cone-mediated electroretinogram during light adaptation.</a> Neurosci. Lett. 162, 9-11 (1993).</li></ol>

Washington University in St. Louis hat einen Lizenzvertrag mit Xenotec, Inc. und können eine Lizenzgebühren aus dem Verkauf der ex vivo-Adapter zu erhalten.

<html> Wir zeigen hier die entscheidenden Schritte zur gleichzeitigen Gewinnung hochwertiger ex vivo ERG Aufnahmen aus zwei isolierten Maus Netzhaut durch die Verwendung in vivo ERG Systemkomponenten zusammen mit einem Ex-vivo-ERG-Adapter. In dieser Studie haben wir die beiden perfundiert Retinae von dem Tier mit der gleichen Lösung (entweder Ames, Locke oder Ringer), aber es ist auch möglich, jeden Netzhaut mit einer anderen Lösung, zB perfundieren, Drogentestzwecke. Die wichtigste...

Elektroretinogramm (ERG) ist eine gut etablierte Technik, die verwendet werden können, um die elektrische Aktivität der Netzhaut durch Licht ausgelöst aufzuzeichnen. Die ERG-Signal wird hauptsächlich durch Spannungsänderungen durch radiale Ströme verursacht (entlang der Achse der Photorezeptoren und bipolare Zellen) in der Widerstands Extrazellularraum der Retina fließenden Strom erzeugt wird. Das erste Signal ERG wurde 1865 von Holmgren von der Oberfläche eines Fischauge 1 aufgezeichnet. Einthoven und Jolly 1908 2 unterteilt den ERG Reaktion auf das Auftreten von Licht in drei verschiedenen Wellen, a- genannt, B- und C-Wellen, die jetzt bekannt sind, um im Wesentlichen die Aktivität von Photorezeptoren widerspiegeln, ON bipolaren Zellen und Pigmentepithel Zellen, die jeweils 3-8. ERG aus den Augen der narkotisierten Tieren oder Menschen (in vivo) mit Mikroelektroden aufgezeichnet werden, aus isolierten Augen Vorbereitung 9, in isolierten intakten Netzhaut (ex vivo) 3,10-15 oder über bestimmte Netzhautschichten (lokaleERG) 4,16. Von diesen ist die in vivo ERG derzeit die am häufigsten verwendete Methode, um die Funktion der Retina zu bewerten. Es ist eine nicht-invasive Technik, die für diagnostische Zwecke verwendet werden kann oder um das Fortschreiten von Netzhauterkrankungen bei Tieren oder Patienten zu folgen. , In-vivo-ERG-Aufnahmen erzeugen jedoch eine komplizierte Signal mit mehreren überlappenden Komponenten, die oft von äußeren Augen physiologische Geräusche (zB Atmung und Herztätigkeit) kontaminiert. Lokale ERG kann verwendet werden, um das Signal über bestimmte Schichten der Netzhaut aufzuzeichnen, aber es ist die invasive und hat die niedrigste Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) im Vergleich zu den anderen ERG Aufzeichnungskonfigurationen. Lokale ERG ist auch technisch anspruchsvoll und erfordert teure Ausrüstung (zB Mikroskop und Mikromanipulatoren). Transretinal ERG von der intakten, isolierten Netzhaut (ex vivo ERG) bietet einen Kompromiss zwischen in vivo und lokale ERG Methoden, die stabil und high SNR Aufnahmen von intakter Netzhaut von Tieren oder Menschen 17. Vor kurzem wurde diese Methode erfolgreich eingesetzt, um Stäbchen und Zapfen Photorezeptorfunktion in Säugetieren, Primaten und menschliche Netzhaut 18-20 studieren. Darüber hinaus aufgrund der Abwesenheit von Pigment-Epithel in der ex vivo Retina, die positive C-Wellenkomponente des ERG-Signal entfernt wird und ein bekannter negativer langsamen PIII-Komponente ist in den ex vivo-Aufnahmen zeigte. Die langsame Komponente PIII wurde gezeigt, dass aus den von Müller Gliazellen in der Retina 21-23 stammen. Somit könnte ex vivo ERG Verfahren auch verwendet werden, um Müller-Zellen im intakten Netzhaut zu untersuchen. Mehrere Studien haben auch gezeigt, dass ex vivo ERG-Aufnahmen verwendet werden könnten, um die Konzentration von pharmakologischen Mitteln auf der Netzhaut 24 zu messen und testen Sie die Sicherheit und Wirksamkeit von Arzneimitteln 25-27 werden. Mehrere Handels in vivo-Systemen zur Verfügung stehen undin vielen Laboratorien, die nicht unbedingt über umfangreiche Elektrophysiologie Hintergrund verwendet. Im Gegensatz dazu wurden ex vivo-Geräte nicht bis vor kurzem 17 und als Folge nur wenige Labors werden derzeit nutzen diese leistungsfähige Technik zur Verfügung. Es wäre von Vorteil, um unser Wissen über Netzhaut Physiologie und Pathologie voranzubringen und neue Therapien für Krankheiten zu entwickeln blend ex vivo ERG-Aufnahmen zur Verfügung, um weitere Labors zu machen. Wir zeigen hier eine einfache und erschwingliche ex vivo ERG Vorrichtung 17 und zeigen, wie sie in Verbindung mit mehreren im Handel erhältlichen in vivo ERG-Systeme verwendet werden, um Stab- und Kegel-vermittelten Signal aufzuzeichnen (a- und b-Wellen) und die Funktion Müller-Zellen (langsam PIII) aus intakten Wildtyp-Maus Netzhaut.

<table><tbody><tr><td>&lt;i&gt;In vivo&lt;/i&gt; ERG system</td><td>OcuScience</td><td>HMsERG</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.ocuscience.us/id77.html&quot;&gt;www.ocuscience.us/id77.html&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>&lt;i&gt;In vivo&lt;/i&gt; ERG system</td><td>LKC Technologies</td><td>UTAS-E 3000</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html&quot;&gt;www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>&lt;i&gt;Ex vivo&lt;/i&gt; adapter</td><td>OcuScience</td><td>Ex VIVO ERG adapter</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.ocuscience.us/id107.html&quot;&gt;www.ocuscience.us/id107.html&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>North Central Instruments</td><td>Leica M80</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.ncimicro.com/store/ListProduct.asp?bSub=T&amp;amp;idCategory=27&quot;&gt;May use any brand&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>IR emitter</td><td>Opto Diode Corp.</td><td>OD-50L</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.optodiode.com/&quot;&gt;www.optodiode.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Prowler Night Vision Scopes</td><td>B.E. Meyers Electro Optics</td><td>D4300-I</td><td>Military grade product.</td></tr><tr><td>Red filter</td><td>Rosco Laboratories</td><td>Roscolux #27 Medium Red</td><td>May be used instead of IR system</td></tr><tr><td>Red head light</td><td>OcuScience</td><td>ERGX011</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.ocuscience.us/catalog/i29.html&quot;&gt;www.ocuscience.us/catalog/i29.html&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Microscissors</td><td>WPI, Inc.</td><td>500086</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.wpiinc.com/&quot;&gt;www.wpiinc.com/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Dumont tweezers #5</td><td>WPI, Inc.</td><td>14101</td><td></td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72000</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emsdiasum.com/&quot;&gt;www.emsdiasum.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Scale</td><td>Metler Toledo</td><td>AB54-S/FACT</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/&quot;&gt;May use any brand&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>pH meter and electrode</td><td>Beckman Coulter</td><td>pHI 350</td><td>May use any brand</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/&quot;&gt;May use any brand&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60129</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/&quot;&gt;May use any brand&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63020</td><td>1.0 M solution</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21114</td><td>1.0 M solution</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431788</td><td>May use any brand</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>May use any brand</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td>May use any brand</td></tr><tr><td>Ames medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1420</td><td>May use any brand</td></tr><tr><td>BaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0750</td><td>May use any brand</td></tr><tr><td>DL-AP4</td><td>Tocris Bioscience</td><td>101</td><td>May use any brand</td></tr><tr><td>Succinic acid disodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>224731</td><td>May use any brand</td></tr><tr><td>L-Glutamic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2834</td><td>May use any brand</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td>May use any brand</td></tr><tr><td>Leibovitz culture medium L-15</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4386</td><td>May use any brand</td></tr><tr><td>MEM vitamins</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6895</td><td></td></tr><tr><td>MEM amino acids</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5550</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Airgas</td><td>UN3156</td><td>5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr></tbody></table>

simultaneous ex vivo functional testing of two retinas by in vivo electroretinogram system

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Wir nahmen Flash Antworten von dunkeladaptierten Wildtyp (WT) C57BL / 6-Maus Netzhaut, indem Sie die oben beschriebenen und durch die Verwendung verschiedener Standard Perfusionslösungen (Abbildung 2) in Abbildung 1 veranschaulicht experimentelle Protokolle. Die Antwortwellenformen und Kinetik sowie Empfindlichkeit der Stäbchen-Photorezeptoren erschien ähnlich in Ames &#39;und Lockes Medien (2A und B). Auf der anderen Seite, unter HEPES gepufferte Ri...

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Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Gleichzeitig<em&gt; Ex vivo</em&gt; Funktionsprüfung von zwei Netzhäute von<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogramm-System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

9.1K Aufrufe.  Washington University in St. Louis. Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Serie: Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Multifocal Electroretinograms

A limitation of traditional full-field electroretinograms (ERG) for the diagnosis of retinopathy is lack of sensitivity. Generally, ERG results are normal unless more than approximately 20% of the retina is affected. In practical terms, a patient might be legally blind as a result of macular degeneration or other scotomas and still appear normal, according to traditional full field ERG. An important development in ERGs is the multifocal ERG (mfERG). Erich Sutter adapted the mathematical sequences called binary m-sequences enabling the isolation from a single electrical signal an electroretinogram representing less than each square millimeter of retina in response to a visual stimulus1.
Results that are generated by mfERG appear similar to those generated by flash ERG. In contrast to flash ERG, which best generates data appropriate for whole-eye disorders. The basic mfERG result is based on the calculated mathematical average of an approximation of the positive deflection component of traditional ERG response, known as the b-wave1. Multifocal ERG programs measure electrical activity from more than a hundred retinal areas per eye, in a few minutes. The enhanced spatial resolution enables scotomas and retinal dysfunction to be mapped and quantified.
In the protocol below, we describe the recording of mfERGs using a bipolar speculum contact lens.
Components of mfERG systems vary between manufacturers. For the presentation of visible stimulus, some suitable CRT monitors are available but most systems have adopted the use of flat-panel liquid crystal displays (LCD). The visual stimuli depicted here, were produced by a LCD microdisplay subtending 35 - 40 degrees horizontally and 30 - 35 degrees vertically of visual field, and calibrated to produce multifocal flash intensities of 2.7 cd s m-2. Amplification was 50K. Lower and upper bandpass limits were 10 and 300 Hz. The software packages used were VERIS versions 5 and 6.

The development of the multifocal electroretinogram (mfERG) is an important advance in the diagnosis and characterization of retinopathy. Multifocal electroretinograms are a mathematical average of an approximation of a b-wave. Software programs can derive ERGs from more than a hundred retinal areas in a few minutes per eye. Scotomas and retinal dysfunction can be mapped and quantified.

Multifocal Elektroretinogramme

A limitation of traditional full-field electroretinograms (ERG) for the diagnosis of retinopathy is lack of sensitivity.  Generally, ERG results are ...

Forschung

Medizin

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light whereas cones operate continuously under rapidly changing bright light conditions. Absorption of light by rod- and cone-specific visual pigments in the outer segments of photoreceptors triggers a phototransduction cascade that eventually leads to closure of cyclic nucleotide-gated channels on the plasma membrane and cell hyperpolarization. This light-induced change in membrane current and potential can be registered as a photoresponse, by either classical suction electrode recording technique1,2 or by transretinal electroretinogram recordings (ERG) from isolated retinas with pharmacologically blocked postsynaptic response components3-5. The latter method allows drug-accessible long-lasting recordings from mouse photoreceptors and is particularly useful for obtaining stable photoresponses from the scarce and fragile mouse cones. In the case of cones, such experiments can be performed both in dark-adapted conditions and following intense illumination that bleaches essentially all visual pigment, to monitor the process of cone photosensitivity recovery during dark adaptation6,7. In this video, we will show how to perform rod- and M/L-cone-driven transretinal recordings from dark-adapted mouse retina. Rod recordings will be carried out using retina of wild type (C57Bl/6) mice. For simplicity, cone recordings will be obtained from genetically modified rod transducin &alpha;-subunit knockout (T&alpha;-/-) mice which lack rod signaling8.

We describe a relatively simple method of transretinal electroretinogram (ERG) recordings for obtaining rod and cone photoresponses from intact mouse retina. This approach takes advantage of the block of synaptic transmission from photoreceptors to isolate their light responses and record them using field electrodes placed across the isolated flat-mounted retina.

Transretinal ERG Recordings aus Maus-Retina: Stäbchen und Zapfen Photomorphosen

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light ...

Neurowissenschaften

Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack conspicuous morphological features or show a low population density. This applies particularly to retinal amacrine cells, an exceptionally multiform class of interneurons that comprise roughly 30 subtypes in mammals1. Though being a crucial part of the visual processing by shaping the retinal output2, most of these subtypes have not been studied up to now in a functional context because encountering these cells with a recording electrode is a rare event.
Recently, a multitude of transgenic mouse lines is available that express fluorescent markers like green fluorescent protein (GFP) under the control of promoters for membrane receptors or enzymes that are specific to only a subset of neurons in a given tissue3,4. These pre-labeled cells are therefore accessible to directed microelectrode targeting under microscopic control, permitting the systematic study of their physiological properties in situ. However, excitation of fluorescent markers is accompanied by the risk of phototoxicity for the living tissue. In the retina, this approach is additionally hampered by the problem that excitation light causes appropriate stimulation of the photoreceptors, thus inflicting photopigment bleaching and transferring the retinal circuits into a light-adapted condition. These drawbacks are overcome by using infrared excitation delivered by a mode-locked laser in short pulses of the femtosecond range. Two-photon excitation provides energy sufficient for fluorophore excitation and at the same time restricts the excitation to a small tissue volume minimizing the hazards of photodamage5. Also, it leaves the retina responsive to visual stimuli since infrared light (&gt;850 nm) is only poorly absorbed by photopigments6.
In this article we demonstrate the use of a transgenic mouse retina to attain electrophysiological in situ recordings from GFP-expressing cells that are visually targeted by two-photon excitation. The retina is prepared and maintained in darkness and can be subjected to optical stimuli which are projected through the condenser of the microscope (Figure 1). Patch-clamp recording of light responses can be combined with dye filling to reveal the morphology and to check for gap junction-mediated dye coupling to neighboring cells, so that the target cell can by studied on different experimental levels.

This article depicts the recording of individual cells from fluorescently tagged neuronal populations in the intact mouse retina. By using two-photon infrared excitation transgenetically labeled cells were targeted for patch-clamp recording to study their light responses, receptive field properties, and morphology.

Elektrophysiologische Charakterisierung von GFP-exprimierenden Zellpopulationen in der intakte Retina

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack ...

Direct-Coupled Electroretinogram (DC-ERG) for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) is a specialized monolayer of cells strategically located between the retina and the choriocapillaris that maintain the overall health and structural integrity of the photoreceptors. The RPE is polarized, exhibiting apically and basally located receptors or channels, and performs vectoral transport of water, ions, metabolites, and secretes several cytokines.
In vivo noninvasive measurements of RPE function can be made using direct-coupled ERGs (DC-ERGs). The methodology behind the DC-ERG was pioneered by Marmorstein, Peachey, and colleagues using a custom-built stimulation recording system and later demonstrated using a commercially available system. The DC-ERG technique uses glass capillaries filled with Hank&#8217;s buffered salt solution (HBSS) to measure the slower electrical responses of the RPE elicited from light-evoked concentration changes in the subretinal space due to photoreceptor activity. The prolonged light stimulus and length of the DC-ERG recording make it vulnerable to drift and noise resulting in a low yield of useable recordings. Here, we present a fast, reliable method for improving the stability of the recordings while reducing noise by using vacuum pressure to reduce/eliminate bubbles that result from outgassing of the HBSS and electrode holder. Additionally, power line artifacts are attenuated using a voltage regulator/power conditioner. We include the necessary light stimulation protocols for a commercially available ERG system as well as scripts for analysis of the DC-ERG components: c-wave, fast oscillation, light peak, and off response. Due to the improved ease of recordings and rapid analysis workflow, this simplified protocol is particularly useful in measuring age-related changes in RPE function, disease progression, and in the assessment of pharmacological intervention.

Direct-Coupled Electroretinogram DC-ERG for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Here, we present a method for recording light-evoked electrical responses of the retinal pigment epithelium (RPE) in mice using a technique known as DC-ERGs first described by Marmorstein, Peachey, and colleagues in the early 2000s.

Direktgekoppeltes Elektroretinogramm (DC-ERG) zur Aufzeichnung der lichtbeschworenen elektrischen Reaktionen des retinalen Pigmentepithels der Maus

The retinal pigment epithelium (RPE) is a specialized monolayer of cells strategically located between the retina and the choriocapillaris that maintain ...

Chemie

Using the Electroretinogram to Assess Function in the Rodent Retina and the Protective Effects of Remote Limb Ischemic Preconditioning

The ERG is the sum of all retinal activity. The ERG is usually recorded from the cornea, which acts as an antenna that collects and sums signals from the retina. The ERG is a sensitive measure of changes in retinal function that are pan-retinal, but is less effective for detecting damage confined to a small area of retina. In the present work we describe how to record the &#8216;flash&#8217; ERG, which is the potential generated when the retina is exposed to a brief light flash. We describe methods of anaesthesia, mydriasis and corneal management during recording; how to keep the retina dark adapted; electrode materials and placement; the range and calibration of stimulus energy; recording parameters and the extraction of data. We also describe a method of inducing ischemia in one limb, and how to use the ERG to assess the effects of this remote-from-the-retina ischemia on retinal function after light damage. A two-flash protocol is described which allows isolation of the cone-driven component of the dark-adapted ERG, and thereby the separation of the rod and cone components. Because it can be recorded with techniques that are minimally invasive, the ERG has been widely used in studies of the physiology, pharmacology and toxicology of the retina. We describe one example of this usefulness, in which the ERG is used to assess the function of the light-damaged retina, with and without a neuroprotective intervention; preconditioning by remote ischemia.

The electroretinogram (ERG) is an electrical potential generated by the retina in response to light. This paper describes how to use the ERG to assess retinal function, in dark-adapted rats, and how it can be can be used to assess a neuroprotective intervention, in the present case remote ischemic preconditioning.

Verwenden der Funktion zur Elektroretinogramm im Nager Retina und die schützende Wirkung des Fern Limb ischämischen Präkonditionierung bewerten

The ERG is the sum of all retinal activity. The ERG is usually recorded from the cornea, which acts as an antenna that collects and sums signals from the ...

Simultaneous Recording of Electroretinography and Visual Evoked Potentials in Anesthetized Rats

The electroretinogram (ERG) and visual evoked potential (VEP) are commonly used to assess the integrity of the visual pathway. The ERG measures the electrical responses of the retina to light stimulation, while the VEP measures the corresponding functional integrity of the visual pathways from the retina to the primary visual cortex following the same light event. The ERG waveform can be broken down into components that reflect responses from different retinal neuronal and glial cell classes. The early components of the VEP waveform represent the integrity of the optic nerve and higher cortical centers. These recordings can be conducted in isolation or together, depending on the application. The methodology described in this paper allows simultaneous assessment of retinal and cortical visual evoked electrophysiology from both eyes and both hemispheres. This is a useful way to more comprehensively assess retinal function and the upstream effects that changes in retinal function can have on visual evoked cortical function.

This protocol describes simultaneous measurement of electroretinogram and visual evoked potentials in anesthetized rats.

Gleichzeitige Aufnahme von Elektroretinographie und visuell evozierten Potentialen in narkotisierten Ratten

The electroretinogram (ERG) and visual evoked potential (VEP) are commonly used to assess the integrity of the visual pathway. The ERG measures the ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

Transpupille Zwei-Photonen-In-vivo-Bildgebung der Netzhaut der Maus

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

Optimizing the Setup and Conditions for Ex Vivo Electroretinogram to Study Retina Function in Small and Large Eyes

Measurements of retinal neuronal light responses are critical to investigating the physiology of the healthy retina, determining pathological changes in retinal diseases, and testing therapeutic interventions. The ex vivo electroretinogram (ERG) allows the quantification of contributions from individual cell types in the isolated retina by addition of specific pharmacological agents and evaluation of tissue-intrinsic changes independently of systemic influences. Retinal light responses can be measured using a specialized ex vivo ERG specimen holder and recording setup, modified from existing patch clamp or microelectrode array equipment. Particularly, the study of ON-bipolar cells, but also of photoreceptors, has been hampered by the slow but progressive decline of light responses in the ex vivo ERG over time. Increased perfusion speed and adjustment of the perfusate temperature improve ex vivo retinal function and maximize response amplitude and stability. The ex vivo ERG uniquely allows the study of individual retinal neuronal cell types. In addition, improvements to maximize response amplitudes and stability allow the investigation of light responses in retina samples from large animals, as well as human donor eyes, making the ex vivo ERG a valuable addition to the repertoire of techniques used to investigate retinal function.

Optimizing the Setup and Conditions for Ex Vivo Electroretinogram to Study Retina Function in Small and Large Eyes

Modification of existing multielectrode array or patch clamp equipment makes the ex vivo electroretinogram more widely accessible. Improved methods to record and maintain ex vivo light responses facilitate the study of photoreceptor and ON-bipolar cell function in the healthy retina, animal models of eye diseases, and human donor retinas.

Optimierung des Aufbaus und der Bedingungen für das Ex-vivo-Elektroretinogramm zur Untersuchung der Netzhautfunktion bei kleinen und großen Augen

Measurements of retinal neuronal light responses are critical to investigating the physiology of the healthy retina, determining pathological changes in ...

Retinal Explant of the Adult Mouse Retina as an Ex Vivo Model for Studying Retinal Neurovascular Diseases

One of the challenges in retina research is studying the cross-talk between different retinal cells such as retinal neurons, glial cells, and vascular cells. Isolating, culturing, and sustaining retinal neurons in vitro have technical and biological limitations. Culturing retinal explants may overcome these limitations and offer a unique ex vivo model to study the cross-talk between various retinal cells with well-controlled biochemical parameters and independent of the vascular system. Moreover, retinal explants are an effective screening tool for studying novel pharmacological interventions in various retinal vascular and neurodegenerative diseases such as diabetic retinopathy. Here, we describe a detailed protocol for retinal explants' isolation and culture for an extended period. The manuscript also presents some of the technical problems during this procedure that may affect the desired outcomes and reproducibility of the retinal explant culture. The immunostaining of the retinal vessels, glial cells, and neurons demonstrated intact retinal capillaries and neuroglial cells after 2 weeks from the beginning of the retinal explant culture. This establishes retinal explants as a reliable tool for studying changes in the retinal vasculature and neuroglial cells under conditions that mimic retinal diseases such as diabetic retinopathy.

Retinal Explant of the Adult Mouse Retina as an Ex Vivo Model for Studying Retinal Neurovascular Diseases

This protocol presents and describes steps for the isolation, dissection, culturing, and staining of retinal explants obtained from an adult mouse. This method is beneficial as an ex vivo model for studying different retinal neurovascular diseases such as diabetic retinopathy.

Netzhautexplantat der adulten Mausnetzhaut als Ex-vivo-Modell zur Untersuchung neurovaskulärer Netzhauterkrankungen

One of the challenges in retina research is studying the cross-talk between different retinal cells such as retinal neurons, glial cells, and vascular ...

Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

<a href='https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/61970/transpupillary-two-photon-in-vivo-imaging-of-the-mouse-retina'>Source: Wang, Z., et al.&#160;Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina. J. Vis. Exp.&#160;(2021).</a>This video demonstrates a technique for in vivo retinal imaging using two-photon microscopy. Anesthetized mice are prepared for imaging by securing their heads, Applying eye lubricant, and placing a coverslip over the eye. Retinal ganglion cells (RGCs) expressing fluorescent proteins are first visualized using epifluorescence for alignment. Finally, two-photon imaging is employed, allowing for high-resolution visualization of RGCs.

Source: Wang, Z., et al.&#160;Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina. J. Vis. Exp.&#160;(2021).This video demonstrates a technique ...

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