Name: applying stereotactic injection technique to study genetic effects on animal behaviors
Uploaded: 2015-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
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This work is supported in part by American Heart Association Scientist Development Grant and NARSAD Young Investigator Award to Yingwei Mao.

HINWEIS: Alle Protokolle mit Tieren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Tierpflege der Pennsylvania State University folgte, IACUC # 44057 1. Lentivirus Produktion HINWEIS: Der Tag vor der Transfektion sollten LentiX-293-Zellen bei 80% Konfluenz sein. <ol><li> Spülen Zellen mit DMEM kurz vor der Transfektion und Inkubation in 10 ml DMEM / 10% FBS mit Penicillin (100 IU / ml) und Streptomycin (100 ug / ml) für 5 min bei RT. </li><li> Verdünnte DNA und Polyethylenimin (PEI) (1 mg / ml) im Verhältnis 1: 3 (1 ug DNA: 3 ul PEI) in 1 ml DMEM und Vortex für 1 min. Das Volumen der DNA gegeben ist abhängig von der Konzentration der DNA. Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 min. <ol><li> Beispielsweise verwenden 20 ug Plasmid-DNA, bestehend aus 10 ug Vektorplasmid wurden 5 ug Plasmid psPax2 14, 5 ug des vesikulären Stomatitis-Virus (VSV) mit 60 ul von PEI pro Schale. </li></ol></li><li&gt; Mischen Sie die DNA und PEI-Lösung erneut durch Vortexen für 1 min. Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 min. </li><li> 1 / 10tel Volumen von Gesamtkulturmedium DMEM (dh 1 ml für 10 ml Kulturmedium in einem 100-mm-Schale). 1 ml der DNA-PEI-Mischung tropfenweise in die Schale und schwenken die Schale herum, bis zu dem Kulturmedium ist allgemein mit der DNA gemischt. </li><li> Inkubation für 6 Stunden bei Raumtemperatur und Entfernen des Überstandes. 5 ml Kulturmedium. </li><li> 48 h nach der Transfektion zu sammeln Virusüberstand und Schleudern bei 627 xg für 5 Minuten bei 4 ° C in einem 50 ml-Röhrchen. Filter 30 ml Virusüberstand durch ein 0,45 um-Spritzenfilter in ein Ultrazentrifugenröhrchen. </li><li> In sterilem Wasser, um die Rohre auszugleichen, und decken Rohre mit kleinen Stück Parafilm. Spin-Röhrchen bei 11.249 × g für 120 min bei 4 ° C. Entfernen Flüssigkeit unter Verwendung einer Vakuumspitze. </li><li> Füge 100 &amp; mgr; l kaltem PBS Rohres. Schwenken Sie die Röhrchen bei 4 ° CO / N. </li><li> Um erneut zu suspendieren, das Virus, Pipetten ter PBS hinzugefügt in Schritt 1.8 über die Pellet 10-mal, darauf achten, daß das Pellet mit der Spitze berühren. Das Pellet wird nicht erneut suspendiert werden, bis diese abgeschlossen ist. </li><li> Aliquot des Virus bei 10-20 &amp; mgr; l pro Röhrchen, flash-freeze in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C. </li></ol> 2. stereotaktische Injektion 2.1) Herstellung des Instruments <ol><li> Platzieren Sie eine Schere, blunt-end Pinzette, ein Nadelhalter, Skalpell, Wattestäbchen und ein Tuch in einer versiegelten Packung mit einem Sterilisationsindikator, und Autoklaven vor der Operation. Darüber hinaus erhalten 10% Povidon-Iod, 70% Ethylalkohol, resorbierbares Nahtmaterial, ein Heizkissen, künstliche Tränen, eine Glasperlen Sterilisator, bohren, ein Bohrer, 2 Einwegspritzen, Injektionsspritze, Elektrorasierer, analgetische (Ketoprofen), Narkose (avertin), Handschuhe und eine stereotaktische Vorrichtung mit der Einspritzpumpe. </li><li> Machen 1,25% Avertin Lösung frisch an diesem Tag, Filter in eine sterile Haube unter Verwendung eines 0,2 &amp;# 181; m sterile Spritzenfilter, und in einen sterilen Serumampulle. Mischungs 2,5 g 2,2,2-Tribromethyl Alkohols in 5 ml tert-Amylalkohol, dann lösen sich in 200 ml Wasser. Halten Sie den pH-Wert unter 5. 15 </li></ol> 2.2) Herstellung der Maus <ol><li> Verwalten avertin bezogen auf das Gewicht der Maus (375 mg / kg). 15 Spritzen Sie die Maus mit dem avertin über eine intraperitoneale (IP) Injektion, und legen Sie dann zurück in seinen Käfig, bis sie vollständig betäubt. </li><li> Geben Sie ein Analgetikum über IP-Injektion (ketaprofen, 5 mg / kg) und Platz künstliche Tränen in den Augen der Maus, um ein Austrocknen zu verhindern. </li><li> Stellen Sie sicher, dass die Maus ist komplett eingeschlafen durch Kneifen ihren Fuß. Wenn die Maus reagiert auf den Fuß Prise, dann geben Sie mehr Anästhetikum (in Dosen von 50 &amp; mgr; l). Rasieren Sie den Kopf der Maus mit einem elektrischen Rasierer. Rasieren Sie die Gegend auf (typischerweise von nur hinter den Ohren, an die Spitze der Schnauze) betrieben werden, und die Umgebung. </li><li> Platzieren Sie die Maus into stereotaktischen Apparat. Verriegeln Sie die Vorderzähne auf der vorderen Klammer, und senken Sie die Klemme und ziehen Sie sie so, dass der Kiefer ist völlig sicher. </li><li> Setzen Sie die Ohr Bars in den Gehörgang, den Kopf voll zu stabilisieren. Achten Sie darauf, die Ohr Bars in zu weit Einsatz, der das Innenohr beschädigen könnten. Sobald Sie fertig sind, sollte der Körper der Maus in der Lage, ohne Unterbrechung der Position der Kopf leicht bewegt werden können. </li><li> Legen Sie ein Heizkissen unter der Maus, um die Körpertemperatur der Maus die während des gesamten Verfahrens zu regeln. </li><li> Reinigen Sie den OP-Bereich gründlich. Mit einem Wattestäbchen, reiben 10% Povidon-Jod in einer Kreisbewegung, ausgehend von der Mitte der Operationsstelle und nach außen bewegt. Dann, mit einem Wattestäbchen zu 70% Ethylalkohol auf der Operationsstelle in der gleichen Weise zu reiben. Wiederholen Sie zweimal. </li></ol> 2.3) den ersten Schnitt <ol><li> Sobald die Maus vorbereitet, öffnen Sie die sterile Ausrüstung Tasche. Wechseln Sie die Handschuhe vor Touching der Instrumente. Nehmen Sie die sterile Tuch und legen Sie die Instrumente auf dem Tuch. Wenn jedes Instrument ein un-sterile Oberfläche berührt, verwenden Sie die Glasperle-Sterilisator für 15 Sekunden, um sie zu sterilisieren. </li><li> Nehmen Sie das Skalpell in der dominanten Hand und blunt-end Pinzette in der nicht-dominanten Hand. Verwenden Sie die stumpfen Enden Pinzette vorsichtig Griff der Haut der Maus, und einen Einschnitt mit dem Skalpell. Beginnen Sie den Schnitt etwa 1,5 cm oberhalb der Ohren (in Richtung der Nase) und erstrecken sich auf etwa 0,5 cm unterhalb der Ohren. Verlängern Sie den Schnitt vertikal in der Mitte des Kopfes der Maus zu Bregma freizulegen (Abbildung 1). </li><li> Sobald bregma visualisiert, nehmen Sie eine sterile Wattestäbchen vorsichtig den Blut, die die Oberfläche des Schädels. Verwenden Sie zwei Baumwoll-Tipps, um die Haut in Richtung der Seite des Kopfes zu drücken. </li></ol> 2.4) Geräte-Setup <ol><li> Nach jeder Blut wird von der Oberfläche des Schädels entfernt und Bregma ist deutlich sichtbar, bereiten Sie die Spritze (contration von 10 8 TU / ml, das Volumen von 1 &amp; mgr; l). Im Abzug, füllen Sie die Spritze mit dem Virus injiziert werden. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen sind im Inneren. Legen Sie die Spritze in der stereotaktischen Apparat, um sicherzustellen, dass sie vollständig gesichert ist. </li><li> Langsam senken Sie die Spritze, bis er direkt über der Oberfläche des Schädels, so dass die Spitze der sterilen Spritzennadel an der Kreuzung von Bregma und der interauralen Linie gesetzt. Stellen Sie diesen Punkt als Null ist, und bestimmen, Koordinaten von diesem Punkt. </li><li> In Abhängigkeit von der Hirngebiet, variieren die stereotaktischen Koordinaten. Bestimmen Sie diese Koordinaten durch die Verwendung eines Hirnatlas 4. Sobald die Koordinaten festgelegt sind, bewegen Sie die Nadel der Spritze, um diese Koordinaten entsprechen. Ziel Gyrus dentatus unter Verwendung der Koordinaten: M / L = +/- 1 mm, A / P = -1,82 mm. Senken Sie die Nadel nach rechts über den Schädel zu visualisieren, wo das Loch muss gebohrt werden. </li><li> Heben Sie die Spritze leicht, nehmen Sie den Bohrer und setzen Sie den Bohrer bit direkt über dem Ziel Bohrstelle bei etwa 45 ° Winkel auf den Schädel. Beginnen Bohren, Bohren und halten, bis der Schädel weicht. Wenn der Schädel nachgibt, kann ein Abfall des Widerstands erfasst werden. Achten Sie darauf, in das Gehirn zu bohren, um Rindenschäden vorzubeugen. </li><li> Nehmen Sie eine sterile Wattestäbchen und wischen Sie das Blut aus dem Loch. </li><li> Senken die Spritze, so daß sich die Spitze befindet sich direkt auf der Oberfläche des Gehirns (nicht den Schädel). Gesetzt den D / V-Koordinate (Tiefe) auf 0. Nieder die Spritze in der gewünschten Tiefe auf der Grundlage der Gehirnatlas Koordinaten. Um den Gyrus dentatus, stellen D / V bis -1,79 mm zu erreichen. </li><li> Startet die Injektion mit einer Geschwindigkeit von 0,2 ul / min. Zu beobachten, um sicherzustellen, dass die Spritze nicht niedriger als rutschen die gewünschte Tiefe. Wenn dies geschieht, hebe die Spritze in der gewünschten Tiefe wieder. </li><li> Nach der Injektion abgeschlossen ist, warten Sie etwa 2 Minuten, um sicherzustellen, dass jede Restvirus absorbiert wurde. Langsam heben Sie die Spritze und verwenden Sie ein Wattestäbchen, um jede li entfernenquid von der Injektionsstelle. </li><li> Wiederholen Sie für die andere Hemisphäre. </li></ol> 2.5) Naht <ol><li> Entfernen Sie die steriles Naht und Nadel aus ihrer Verpackung und Griff die Nadel mit Hilfe der Nadelhalter. Stellen Sie sich der spitze Kante der Nadel weg von dem Nadelhalter. Halten Sie die stumpfen Enden Pinzette in der nicht-dominanten Hand, und verwenden Sie es zu greifen die Haut an der Maus. Beginnen Sie mit der dominanten Hand. </li><li> Schieben Sie den Faden durch die Haut und mit den glatten Enden Pinzette, um die Haut auf der anderen Seite des Einschnitts zu greifen. Ziehen Sie das Nahtmaterial durch, bis etwa 0,75 Zoll bleibt. </li><li> Lassen Sie die Nadel, und verwenden Sie die stumpfen Enden Zangen, um den Faden um den Nadelhalter einmal wickeln, dann greifen die restlichen 0,75 Zoll Naht mit dem Nadelhalter, und ziehen Sie den Faden durch, so dass die Nadel und Nadelhalter am Ende auf der Seite des Kopfes entgegengesetzt zu jener, die sie ursprünglich auf. Dies sollte einen Knoten zu bilden. </li><li> Wiederholen Sie diesen Schrittdrei weitere Male abwechselnd die Kopfseite der Nadelhalter endet auf jeder Zeit. </li><li> Schneiden Sie den Faden und wiederholen Sie die Schritte 2.5.1-2.5.3 bis der Schnitt geschlossen. </li></ol> 2.6) postoperative Pflege <ol><li> Entfernen Sie vorsichtig die Ohr Bars von der Maus, und entfernen Sie die Kiefer von der vorderen Klammer. </li><li> Halten Sie die Maus auf dem Heizkissen, bis er wacht auf und bewegt sich auf seine eigenen. Überwachen Sie die Maus täglich, und zu halten und Ausschau nach Anzeichen von Schmerzen, wie zum Beispiel nicht Putzen, Essen oder Trinken. Geben Sie zusätzliche analgetische als notwendig erachtet wird. </li></ol> 3. Öffnen Sie Field Test 3.1) einrichten <ol><li> Erhalten Sie leeren Platz, Kunststoff-Arena mit den Abmessungen 50 cm x 50 cm, mit 50 cm hohen Wänden (kann aber etwas größer sein). Reinigen der Arena mit 70% igem Ethylalkohol vor dem Beginn des Experiments. Stellen Sie sicher, der Ethylalkohol vollständig, bevor Sie eine Maus in die Arena getrocknet. </li><li> Legen Sie die Arena auf demBoden und versuchen sicherzustellen, wird die Beleuchtung eingestellt, um Schatten und Blendung zu minimieren. </li><li> Bei Verwendung von Tracking-Software, positionieren Sie die Kamera direkt über dem offenen Feld, etwa 1,5 Meter über dem offenen Feld (weit genug weg, um es im voller umfassen den gesamten Arena, aber nahe genug, um einen klaren Blick auf die Maus haben). </li><li> Richten Sie eine Zone in der Mitte der Box (etwa einer Fläche von 30 cm x 30 cm). 16. Um eine Zone festzulegen, klicken Sie auf der Registerkarte Zone 1 in der Seitenwand. <ol><li> Wählen Sie eine Form Umriss in der oberen Platte, und stellen den Umfang der Mittelzone. Wählen Sie hinzufügen Zone, und klicken Sie auf der Innenseite der Mittelzone. Mit den Programmeingabeaufforderungen, Name der Zone (dies wird als &quot;Zentrum&quot; für dieses Verfahren bezeichnet). Wenn die Verhaltenstest wird mit der Hand erzielt werden, stellen Sie sicher, dass der Boden des Feldes wird in 10 cm x 10 cm große Quadrate aufgeteilt, mit Klebeband markiert. </li></ol></li><li> Einrichten der Software, so dass die Einstellungen korrekt sind, und sich die Maus leicht visiBLE auf dem Bildschirm. Erreichen dies durch Einstellen der Erkennungseinstellungen auf der Maschine mit dem Testfeld (Beleuchtung) und Maus Farbe kompatibel zu sein. Hinweis: Wenn die Einstellungen korrekt sind, sollte das System nur die Maus keine Schatten oder Urin / Fäkalien zu verfolgen, und nicht. Die spezifischen Software-Einstellungen sind abhängig von der Beleuchtung der Arena, und die Farbe der Maus. </li></ol> 3.2) Akklimatisierung und Test <ol><li> Bewegen Versuchsmäusen in die Verhaltensraum 1 h vor dem Test, um sie an ihre Umgebung akklimatisieren. Lassen Sie die Mäuse in ihrem Käfig für die Akklimatisierung. </li><li> Schalten Sie die Kamera auf Band die Verhaltensaufgabe und setzen Sie die Maus auf die Mitte vor der Arena, so dass die Maus vor der Wand. </li><li> Stellen Sie den Timer für 5 Minuten, und Schritt weg von der Arena. Wenn möglich, den Raum verlassen, um die Maus nicht versehentlich zu beeinflussen. </li><li> Nach 5 Minuten um sind, entfernen Sie die Maus und legen Sie sie in ihrem Käfig. </li><li> Verwenden Sie 70% Ethylalkohol, gründlich reinigen, die Feld, bevor Sie zum nächsten Maus. Stellen Sie sicher, der Ethylalkohol vollständig getrocknet ist. </li></ol> 3.3) Scoring <ol><li> Betrachten Sie die Maus als in der Mitte des Feldes, wenn alle vier Pfoten sind in der Mitte 30 cm x 30 cm. </li><li> Quantifizieren, wie viel Zeit die Maus in der Mitte verbringt. Alternativ bestimmen diesmal mit Tracking-Software (wie Noldus ethovison). <ol><li> Um dies zu tun, gehen Sie auf die Registerkarte Analyse, und klicken Sie auf &quot;Bewegung&quot; zu analysiereProfile. Löschen Sie die aktuell eingestellten Kategorien, und wählen Sie dann &quot;in der Zone&quot; auf der Registerkarte Standort. Wählen Sie die Mittelzone. Als nächstes wählen Sie &quot;Analyse-Ausgang&quot; (unter der Registerkarte Ergebnisse), um Ergebnisse anzuzeigen. Eine Tabelle mit den Zeitaufwand für immobile für jede Studie sollte angezeigt werden. </li></ol></li><li> Ansonsten punkten die OFT mit der Hand. Das offene Feld sollte 25 10 cm x 10 cm Quadrate auf dem Boden des ope umrissen habenn Feld (wie in Schritt 3.1.3 beschrieben). Quantifizierung der Menge an Zeit verbringt die Maus in der Mitte, die neben der Anzahl der Einträge in die Mitte der Bahn. 16 HINWEIS: Die Mitte 30 cm x 30 cm Gegend gilt als das Zentrum der offenen Feld. Eine Maus wird als bewohnen die Mittelregion, wenn alle vier Pfoten sind in der 30 x 30 cm-Bereich betrachtet. </li></ol> 4. Forced Swim-Test Hinweis: Lassen Sie mindestens fünf Tage zwischen Verhaltensaufgaben. 4.1) einrichten <ol><li> Besorgen Sie sich einen 2 L klare Eimer füllen und mit 22 ° C Wasser. Setzen Sie den Eimer auf einem Tisch, und versuchen Sie es, um sicherzustellen, wird die Beleuchtung eingestellt, um Schatten und Blendung zu minimieren. </li><li> Bei Verwendung von Tracking-Software, positionieren Sie die Kamera direkt über dem Eimer. </li><li> Up-Software so einstellen, dass die Maus leicht auf dem Bildschirm sichtbar. </li></ol> 4.2) Akklimatisierung und Test <ol><li> Bewegen Versuchsmäusen in den Verhaltens room 1 Stunde vor dem Test, um die Umgebung zu gewöhnen. Lassen Sie die Mäuse in ihrem Käfig für die Akklimatisierung. </li><li> Schalten Sie die Kamera auf Band die Verhaltens-Aufgabe. Sanft, platzieren Sie die Maus in der Mitte der Eimer Wasser. Achten Sie darauf, nicht auf die Maus in fallen zu lassen. Langsam senken Sie die Maus, so dass seine Vorderpfoten zuerst das Wasser berühren. Achten Sie darauf, den Kopf von Untertauchen zu verhindern. </li><li> Stellen Sie den Timer für 6 min, und Schritt weg von der Verhaltensbereich. </li><li> Nach 6 Minuten um sind, entfernen Sie die Maus aus dem Eimer, und wischen Sie überschüssiges Wasser ab, bevor Sie die Maus wieder in ihren Käfig. </li></ol> 4.3) Scoring <ol><li> Bei Verwendung von Tracking-Software, stellen Prozent Unbeweglichkeit bis 11%, wie durch Noldus empfohlen (dies sollte die Standardeinstellung), um Zeit zu quantifizieren schwimm vs. Schwimmen. </li><li> Zur Quantifizierung mit dem Tracking-System, öffnen Sie die Registerkarte Analyse, und klicken Sie auf Bewegung unter Analyseprofile. Löschen Sie die aktuell eingestellten Kategorien, und wählen Sie dann Mobilitätszustand aufder linken Seitenwand (unter individuellen Verhalten). Eingestellt Unbeweglichkeit bis 11%. </li><li> Wählen Sie Track-Visualisierung, unter der Registerkarte Ergebnisse. Wählen Sie Analyse-Ausgang (unter der Registerkarte Ergebnisse), um Ergebnisse anzuzeigen. Eine Tabelle mit den Zeitaufwand für immobile für jede Studie sollte angezeigt werden. </li><li> Wenn die Hand Scoring, messen die Zeit, die Maus verbringt Schwimmen oder Klettern und Höhe der Zeit die Maus immobile verbringt. Zusätzlich messen die Latenz bis zum ersten Mal unbeweglich. Siehe Abbildung 2 in Ergebnisse Section. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Erfolgreiche stereotaktische Injektionen verlassen sich auf drei Faktoren ab: Halten Sie die Maus lebendig, Einstellung der korrekten Nullpunkt für Koordinaten (Spitze der Nadel an der Kreuzung der Bregma und der interauralen Linie) und die Einstellung der richtigen Tiefe auf den Nullpunkt (Spitze der Nadel leicht berührt die Außenseite des Hirngewebe). Die Lebensfähigkeit der Mäuse ist wichtig. Chirurgie Überleben kann, indem sichergestellt wird, dass die Maus richtig betäubt und erhält eine angemessene analget...

Die Maus wurde vielfach in der Neurobiologie verwendet, weil es leicht ist, genetisch zu manipulieren. Gen-Knockout-Techniken können die Forscher untersuchen, wie die einzelnen genetischen Faktor formt Maus Verhaltensweisen. Darüber hinaus stellt die cre-loxP-System ein wertvolles Werkzeug für die Gewebe- und Zell arttypischer Gen-Knockout-Mäusen, die Forschern die Genfunktion in verschiedenen Geweben zu untersuchen. 1, in der Praxis sind jedoch Expressionsmuster von cre Promo schwer kontrollierbar und bisher viele etablierte cre Treiber nicht regionsspezifische Expression erreicht. 2,3 Alternativ ist die stereotaktische Injektion eine Methode, die spezifischen Regionen des Gehirns von erwachsenen Maus als Ziel hat. Durch Einspritzen von gentechnisch hergestellten Viren, die cDNA oder shRNA kann regionsspezifische Modulation der Genexpression erreicht werden. Obwohl das Gehirn Größe jeder Maus variiert, kann der Ort des spezifischen Hirnregionen mit stereo Koordi bestimmt werdennates gesetzt von Landmarken auf dem Schädel des Maushirn. Die am häufigsten verwendeten Landmarken Bregma, lambda und der interauralen Linie. Mit Hilfe von Koordinaten aus einer Hirnatlas erhalten können 4 die genaue Position jedes Hirnareal durch die von vorne nach hinten (A / P), medial-lateral (M / L) identifiziert werden kann, und dorsal-ventralen (D / V) Achsen aus bregma / interauralen Linie Kreuzung. Typischerweise Viren in die Gehirne von Mäusen injiziert werden, entweder rot oder grün fluoreszierendes Protein (RFP oder GFP) markiert, so dass Injektionen können durch Fluoreszenzmikroskopie bestätigt. Verhaltens Beurteilungen der Mäuse sind besonders für die Grundlagenforschung von psychiatrischen Störungen nötig. Symptome von psychiatrischen Störungen bei Patienten typischerweise abnorme Verhaltensweisen. Einige dieser Verhaltensweisen des Menschen, sind konserviert und kann direkt imitiert und in der Maus beobachtet werden. Beispielsweise kann Depressionen in der Maus durch Messen behavioral despair modelliert werden. Menschen mit Depressionen often das Gefühl, dass sie nichts tun überhaupt helfen, ein Symptom, das schließlich zum Selbstmord führen können. In Nagetiere, kann dies mit Hilfe der Zwangsschwimmtest (FST), die die Zeitdauer eine Maus schwimmen gegen schwebend in einem Pool von Wasser (als Aufgeben gesehen) misst modelliert werden. Dieses Paradigma wird durch die Rettung des Phänotyps mit Antidepressiva validiert. 7,8,9 Mäuse, die Antidepressiva erhalten haben erheblich weniger Zeit unbeweglich im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen zu verbringen. Eine andere Verhaltenstest, der Open Field Test (OFT) wurde entwickelt, um die Fortbewegung in den Mäusen zu bewerten, und zusätzlich kann der ängstliche Phänotyp in Mäusen zu analysieren. 5,6 Dieser Test beruht auf der Prämisse, dass Mäuse fühlen sich sicherer, wenn sie in der Nähe sind an der Wand in einer neuen offenen Feld. Wildtyp-Mäusen werden schließlich entdecken Sie die neue Umgebung, wie sie neugierige Tiere sind. Jedoch weniger Zeit in der Mitte des Feldes zeigt Angst in der Maus, die Maus nicht in der Lage, um die Initia überwindenl Angst auf eine neue Umgebung gebracht. Die Angst der Maus, wie durch die Menge an Zeit in der Mitte ein offenes Feld verbracht quantifizieren kann, um klinische Angst bei Menschen, die in vielen psychiatrischen Störungen vorhanden ist, verglichen werden. Die Kombination von stereo Injektionen Verhaltensparadigmen ist eine neuartige Weise, um die Expression eines bestimmten Gens gezielt Gehirnbereich zu ändern. Die Wirkung von modulierten Genexpression Auslösern kann dann bestimmt werden. Im Gegensatz zur Gesamthirn Knockout ist dieses Verfahren besonders nützlich, da sie Ziele nur bestimmte Hirnareale. Darüber hinaus werden der stereotaktischen Injektionen typischerweise im erwachsenen Wildtyp-Maus durchgeführt wird, also die endogene Genexpression gesamten Entwicklungsstufen beibehalten. Diese Methode wird die Wirkung verwechseln zu vermeiden, wenn das Gen für das Überleben während der embryonalen und postnatalen Entwicklungsphase erforderlich. Eine wichtige Einschränkung ist, dass die Versuchsmäuse gehen müssen through eine invasive Chirurgie, in der die Schädel von Mäusen geöffnet werden. Darüber hinaus wird der Grad der Genmodulation durch den Titer und die Effizienz des Virus bestimmt. Das Virus muss in die richtige Region mit stereotaktischen Koordinaten, die spezielle Instrumente erfordert injiziert werden. Überprüfung der korrekten Injektionsstelle kann nur post mortem durchgeführt werden. Dieses Verfahren wurde früher verwendet, um die Beteiligung eines spezifischen Gens in verschiedenen neurologischen Krankheiten zu prüfen. Zum Beispiel virale vermittelte gerichtete RNAi TH-Gen (die Dopamin synthetisieren können) in die Substantia nigra compacta eingespritzt wird, und den Bewegungsverhaltensanalyse wurde durchgeführt. 10 einer anderen Studie wurden stereotaktische Injektion eines Lentivirus silencing DISC1 Maus Verhalten in Bezug zu beurteilen um Schizophrenie. Knockdown von DISC1 führte zu einer erhöhten Fortbewegung in Reaktion auf die Neuheit (Parallelen positive Symptome der Schizophrenie) und größer Unbeweglichkeit in derFST. 11 In ähnlicher Weise eine weitere Studie ergab, dass 5-HT 1B Expression zu erhöhten Explorationsverhalten im OFT, konsistent mit einem Anti-Angst-Phänotyp mit dieser Methode. 12 Stereotaktische Injektionen können cre Virus zu liefern, um die Rekombination in cre-loxP-Mäusen zu induzieren . Diese Methode wurde verwendet, um die Y2-Rezeptor in die Amygdala und der Bettkern der Stria terminalis selektiv zu löschen. Auf Verhaltensanalyse wurden diese Mäuse mit einem anti-depressive Phänotyp, wenn das Gen in der zentralen Amygdala gelöscht gefunden, aber keine Phänotyp, wenn das Gen in die basolaterale Amygdala oder Bett Kern der Stria terminalis gelöscht. 13. Somit ist diese Technik bietet ein einzigartiges Werkzeug, um die genetischen Auswirkungen auf die Tierverhalten zu studieren.

<table><tbody><tr><td>Stereotactic Apparatus item 51725</td><td>Stoelting co.</td><td>51725</td><td></td></tr><tr><td>Quintessential stereotaxic pump&amp;nbsp;</td><td>Stoelting co.</td><td>53311</td><td></td></tr><tr><td>Injection Styringe, 65 RN</td><td>Hamilton</td><td>7633-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>PEI&amp;nbsp;</td><td>Polysciences Inc.</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Fine Surgical Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Blunt end forceps</td><td>Fine Surgical Tools</td><td>11002-12</td><td></td></tr><tr><td>Needle holder&amp;nbsp;</td><td>Fine Surgical Tools</td><td>12001-13</td><td></td></tr><tr><td>Drill</td><td>Ram Products Inc</td><td>Microtorque control box, Tech2000 handpiece</td><td>with pedal</td></tr><tr><td>Glass bead sterilizer</td><td>Inotech&amp;nbsp;</td><td>IS-400</td><td></td></tr><tr><td>Absorbable sutures&amp;nbsp;</td><td>Unify</td><td>M-K518r19</td><td>Absorbable, reverse cutting</td></tr><tr><td>Cotton swabs</td><td>VWR</td><td>89031-270</td><td></td></tr><tr><td>Heating pad</td><td>Gaymar</td><td>T-pump TP-500 PN11184-000</td><td></td></tr><tr><td>Artificial tears</td><td>Rugby</td><td>NDC 0536-6550-91</td><td></td></tr><tr><td>Disposable syringe</td><td>BD Syringe</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>Cloth</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gloves&amp;nbsp;</td><td>Ansell</td><td>Senseitouch #7823</td><td></td></tr><tr><td>Avertin or other anesthetic</td><td>see recipe citation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketoprofen or other analgesic</td><td>see veternarian&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tracking software</td><td>Noldus</td><td>Ethovision XT</td><td></td></tr><tr><td>Tracking Camera</td><td>Noldus</td><td>Media Recorder</td><td></td></tr></tbody></table>

applying stereotactic injection technique to study genetic effects on animal behaviors

Stereotaktische Injektion ist eine nützliche Technik, um hohe Titer Lentiviren gezielt Gehirnbereiche in Mäusen zu liefern. Lentiviren kann entweder überexprimiert oder Zuschlags Genexpression in einer relativ fokussierten Bereich ohne signifikante Schädigung des Gehirngewebes. Nach der Wiederherstellung kann der eingespritzte Maus auf verschiedene Verhaltens Aufgaben wie die Open Field Test (OFT) und Forced Swim Test (FST) getestet werden. OFT ist entworfen, um die Fortbewegung und die bestrebt Phänotyp bei Mäusen durch Messung der Menge an Zeit, die eine Maus in die Mitte einer neuen offenen Feld ausgibt beurteilen. Ein ängstlicher Maus wird deutlich weniger Zeit in der Mitte des Romans Feld im Vergleich zu Kontrollen zu verbringen. Die FST beurteilt die anti-depressive Phänotyp durch Quantifizieren der Menge an Zeit, die Mäuse verbringen unbeweglich, wenn sie in einen Eimer Wasser gegeben. Eine Maus mit einer antidepressiven Phänotyp signifikant weniger Zeit unbeweglich Vergleich zu Kontrolltieren zu verbringen. Ziel dieses Protokolls ist es, die ster verwendeneotactic Injektion eines Lentivirus in Verbindung mit Verhaltenstests zu beurteilen, wie genetische Faktoren modulieren tierischen Verhaltensweisen.

<html> Genaue stereotaktische Injektion stützt sich stark auf die Einstellung der richtigen Koordinaten. Die Spitze der Nadel verwendet, um das Virus zu injizieren sollte direkt an der Kreuzung der Bregma und der interauralen Linie (Abbildung 1) eingestellt werden. Es ist hilfreich, ein Stereomikroskop verwenden, um festzustellen, ob die Nadel richtig sitzt. Beim Blick durch das Mikroskop, sollte die Nadel positioniert werden, dass, wenn das Virus injiziert wurden, wäre es direkt an der Kreuzung der Br...

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Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors

Stereotaktische Injektion von Lentiviren ausdrücken cDNAs oder shRNAs die Genexpression in spezifischen Hirnarealen von Mäusen zu modulieren. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur stereotaktischen Injektionen mit Verhaltensaufgaben, wie der Open Field Test (OFT) und Forced Swim Test (FST) zu kombinieren.

Anwenden Stereotaktische Injektionstechnik zu genetischen Auswirkungen auf die Tier Behaviors Studie

Stereotactic injection is a useful technique to deliver high titer lentiviruses to targeted brain areas in mice. Lentiviruses can either overexpress or ...

applying-stereotactic-injection-technique-to-study-genetic-effects-on

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Behavior

14.1K Aufrufe.  The Pennsylvania State University.  Stereotaktische Injektion von Lentiviren ausdrücken cDNAs oder shRNAs die Genexpression in spezifischen Hirnarealen von Mäusen zu modulieren. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur stereotaktischen Injektionen mit Verhaltensaufgaben, wie der Open Field Test (OFT) und Forced Swim Test (FST) zu kombinieren. 

Serie: Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors

Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an entire gene expression pathway by inducing destruction and/or inhibiting translation of these targets. Several miRNAs play key roles in maintaining neuronal structure and function and in higher-level brain functions, and methods are sought for manipulating their levels for exploring these functions. Here, we present a direct in vivo method for examining the cognitive consequences of enforced miRNAs excess in mice by stereotactic injection of miRNA-encoding virus particles. Specifically, the current protocol involves injection into the hippocampal CA1 region, which contributes to mammalian memory consolidation, learning, and stress responses, and offers a convenient injection site. The coordinates are measured according to the mouse bregma and virus perfusion is digitally controlled and kept very slow. After injection, the surgery wound is sealed and the animals recover. Lentiviruses encoding silencers of the corresponding mRNA targets serve to implicate the specific miRNA/target interaction responsible for the observed effect, with na&iuml;ve mice, mice injected with saline and mice injected with "empty" lentivirus vectors as controls. One month post-injection, the animals are examined in the Morris Water Maze (MWM) for assessing their navigation learning and memory abilities. The MWM is a round tank filled with colored water with a small platform submerged 1 cm below the water surface. Steady visual cues around the tank allow for spatial navigation (sound and the earth's magnetic field may also assist the animals in navigating). Video camera monitoring enables measuring the route of swim and the time to find and amount the platform. The mouse is first taught that mounting the hidden platform offers an escape from the enforced swimming; it is then tested for using this escape and finally, the platform is removed and probe tests examine if the mouse remembers its previous location. Repeated tests over several consecutive days highlight improved performance of tested mice at shorter latencies to find and mount the platform, and as more direct routes to reach the platform or its location. Failure to show such improvement represents impaired learning and memory and/or anxiety, which may then be tested specifically (e.g. in the elevated plus maze). This approach enables validation of specific miRNAs and target transcripts in the studied cognitive and/or stress-related processes.

MicroRNAs have significant roles in brain structure and function. Here we describe a method to enforce hippocampal miRNA over-expression using stereotactic injection of an engineered miRNA-expressing lentivirus. This approach can serve as a relatively rapid way to assess the in vivo effects of over-expressed miRNAs in specific brain regions.

Stereotaktische Injektion von microRNA-exprimierenden Lentiviren der Maus Hippocampus CA1 Region und Beurteilung der Behavioral Outcome

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an ...

Forschung

Verhalten

Stereotaxic Microinjection of Viral Vectors Expressing Cre Recombinase to Study the Role of Target Genes in Cocaine Conditioned Place Preference

Microinjecting recombinant adenoassociated viral (rAAV) vectors expressing Cre recombinase into distinct mouse brain regions to selectively knockout genes of interest allows for enhanced temporally- and regionally-specific control of gene deletion, compared to existing methods. While conditional deletion can also be achieved by mating mice that express Cre recombinase under the control of specific gene promoters with mice carrying a floxed gene, stereotaxic microinjection allows for targeting of discrete brain areas at experimenter-determined time points of interest. In the context of cocaine conditioned place preference, and other cocaine behavioral paradigms such as self-administration or psychomotor sensitization that can involve withdrawal, extinction and/or reinstatement phases, this technique is particularly useful in exploring the unique contribution of target genes to these distinct phases of behavioral models of cocaine-induced plasticity. Specifically, this technique allows for selective ablation of target genes during discrete phases of a behavior to test their contribution to the behavior across time. Ultimately, this understanding allows for more targeted therapeutics that are best able to address the most potent risk factors that present themselves during each phase of addictive behavior.

This article describes how to microinject viral vectors into mouse brain and then test in a conditioned place preference paradigm that includes an acquisition, extinction and reinstatement phase.

Stereotaktische Mikroinjektion von viralen Vektoren ausdrücken Cre-Rekombinase, um die Rolle der Zielgene in Cocaine konditionierte Platzpräferenz Studieren

Microinjecting recombinant adenoassociated viral (rAAV) vectors expressing Cre recombinase into distinct mouse brain regions to selectively knockout genes ...

Rodent Brain Microinjection to Study Molecular Substrates of Motivated Behavior

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as appropriate models, partly because the response to behaviorally relevant stimuli and the circuitry parsing stimulus-action outcomes is astonishingly similar between humans and rodents. In studying molecular substrates of complex behaviors, the microinjection of reagents that modify, augment, or silence specific systems is an invaluable technique. However, it is crucial that the microinjection site is precisely targeted in order to aid interpretation of the results. We present a method for the manufacture of surgical implements and microinjection needles that enables accurate microinjection and unlimited customizability with minimal cost. Importantly, this technique can be successfully completed in awake rodents if conducted in conjunction with other JoVE articles that covered requisite surgical procedures. Additionally, there are many behavioral paradigms that are well suited for measuring motivation. The progressive ratio is a commonly used method that quantifies the efficacy of a reinforcer to maintain responding despite an (often exponentially) increasing work requirement. This assay is sensitive to reinforcer magnitude and pharmacological manipulations, which allows reinforcing efficacy and/ or motivation to be determined. We also present a straightforward approach to program operant software to accommodate a progressive ratio reinforcement schedule.

Rodents are an appropriate model to investigate the molecular substrates of behavior and complex psychiatric disorders. Brain microinjection in awake rodents can be used to elucidate disease substrates. An efficient and customizable brain microinjection method as well as the execution of an operant paradigm that quantifies motivation is presented.

Nagetier Gehirn-Mikroinjektion, um molekulare Substrate motiviertes Verhalten Studieren

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as ...

Modeling Brain Metastases Through Intracranial Injection and Magnetic Resonance Imaging

Metastatic spread of cancer is an unfortunate consequence of disease progression, aggressive cancer subtypes, and/or late diagnosis. Brain metastases are particularly devastating, difficult to treat, and confer a poor prognosis. While the precise incidence of brain metastases in the United States remains hard to estimate, it is likely to increase as extracranial therapies continue to become more efficacious in treating cancer. Thus, it is necessary to identify and develop novel therapeutic approaches to treat metastasis at this site. To this end, intracranial injection of cancer cells has become a well-established method in which to model brain metastasis. Previously, the inability to directly measure tumor growth has been a technical hindrance to this model; however, increasing availability and quality of small animal imaging modalities, such as magnetic resonance imaging (MRI), are vastly improving the ability to monitor tumor growth over time and infer changes within the brain during the experimental period. Herein, intracranial injection of murine mammary tumor cells into immunocompetent mice followed by MRI is demonstrated. The presented injection approach utilizes isoflurane anesthesia and a stereotactic setup with a digitally controlled, automated drill and needle injection to enhance precision, and reduce technical error. MRI is measured over time using a 9.4 Tesla instrument in The Ohio State University James Comprehensive Cancer Center Small Animal Imaging Shared Resource. Tumor volume measurements are demonstrated at each time point through use of ImageJ. Overall, this intracranial injection approach allows for precise injection, day-to-day monitoring, and accurate tumor volume measurements, which combined greatly enhance the utility of this model system to test novel hypotheses on the drivers of brain metastases.

Intracranial brain metastasis modeling is complicated by an inability to monitor tumor size and response to treatment with precise and timely methods. The presented methodology couples intracranial tumor injection with magnetic resonance imaging analysis, which when combined, cultivates precise and consistent injections, enhanced animal monitoring, and accurate tumor volume measurements.

Modellierung von Hirnmetastasen durch intrakranielle Injektion und Magnetresonanztomographie

Metastatic spread of cancer is an unfortunate consequence of disease progression, aggressive cancer subtypes, and/or late diagnosis. Brain metastases are ...

Krebsforschung

Establishment of Orthotopic Patient-derived Xenograft Models for Brain Tumors using a Stereotaxic Device

The development of clinically relevant and reliable models for central nervous system (CNS) tumors has been pivotal in advancing the field of neuro-oncology. One of the most widely used techniques is the orthotopic intracranial injection, a method that allows investigating of tumor growth, invasion, and dissemination within a controlled setting. This technique involves transplanting tumor cells from a specific patient region into the corresponding anatomical site in an animal. By doing so, these orthotopic brain tumor models offer a unique advantage, as they more accurately replicate cancer's biological behavior and its interactions with the brain environment seen in human patients. This makes them especially valuable for preclinical therapeutic testing, where a close resemblance to the clinical scenario is essential for evaluating potential treatments. This protocol shares experiences in developing patient-derived xenograft (PDX) models for pediatric brain tumors, including diffuse midline glioma (DMG), glioblastoma (GBM), medulloblastoma, and ependymoma. This method delineates the procedure for conducting intracranial stereotaxic injections in mice, ensuring the correct targeting of the injection site within the brain. Additionally, we describe the post-procedural monitoring system employed to detect signs of successful tumor engraftment. Following tumor injection, a rigorous monitoring system is implemented to observe the animals for any signs of neurological impairment, behavioral changes, and/or weight loss, which are common indicators of tumor progression. This system allows for timely intervention and provides critical data regarding the tumor's growth dynamics. By refining these models and protocols, we aim to enhance the reliability and translational potential of preclinical studies, contributing to the development of more effective treatments for pediatric CNS tumors.

The development of orthotopic pediatric brain tumor models requires meticulous precision, using a stereotaxic device to implant cancer cells precisely. The methodology presented here outlines the steps involved in preparing brain tumor cells, performing intracranial injections, and implementing a post-operative monitoring system to assess brain tumor engraftment.

The development of clinically relevant and reliable models for central nervous system (CNS) tumors has been pivotal in advancing the field of ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, they may function to regulate the developmental process and/or physiological function in neonatal brains. To investigate neurobiological functions of specific genes in the brain, it is essential to inactivate genes in the brain. Here, we describe a simple stereotaxic method to inactivate gene expression in the striatum of transgenic mice at neonatal time windows. AAV-eGFP-Cre viruses were microinjected into the striatum of Ai14 reporter gene mice at postnatal day (P) 2 by stereotaxic brain surgery. The tdTomato reporter gene expression was detected in P14 striatum, suggesting a successful Cre-loxP mediated DNA recombination in AAV-transduced striatal cells. We further validated this technique by microinjecting AAV-eGFP-Cre viruses into P2Foxp2fl/fl mice. Double labeling of GFP and Foxp2 showed that GFP-positive cells lacked Foxp2 immunoreactivity in P9 striatum, suggesting the loss of Foxp2 protein in AAV-eGFP-Cre transduced striatal cells. Taken together, these results demonstrate an effective genetic deletion by stereotaxically microinjected AAV-eGFP-Cre viruses in specific neuronal populations in the neonatal brains of floxed transgenic mice. In conclusion, our stereotaxic technique provides an easy and simple platform for genetic manipulation in neonatal mouse brains. The technique can not only be used to delete genes in specific regions of neonatal brains, but it also can be used to inject pharmacological drugs, neuronal tracers, genetically modified optogenetics and chemogenetics proteins, neuronal activity indicators and other reagents into the striatum of neonatal mouse brains.

We describe a protocol of stereotaxic surgery with a homemade head-fixed device for microinjecting reagents into the striatum of neonatal mouse brains. This technique allows genetic manipulation in neuronal cells of specific regions of neonatal mouse brains.

Stereotaktischen Chirurgie für Genmanipulation in Striatale Zellen des Neugeborenen Mäusegehirnen

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

Neurowissenschaften

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional investigation of long-range connections requires targeted recordings of single neurons combined with the specific stimulation of identified distant inputs. This is often difficult to achieve with conventional and electrical stimulation techniques, because axons from converging upstream brain areas may intermingle in the target region. The stereotaxic targeting of a specific brain region for virus-mediated expression of light-sensitive ion channels allows selective stimulation of axons originating from that region with light. Intracerebral stereotaxic injections can be used in well-delimited structures, such as the anterior thalamic nuclei, in addition to other subcortical or cortical areas throughout the brain.
Described here is a set of techniques for precise stereotaxic injection of viral vectors expressing channelrhodopsin in the mouse brain, followed by photostimulation of axon terminals in the brain slice preparation. These protocols are simple and widely applicable. In combination with whole-cell patch clamp recording from a postsynaptically connected neuron, photostimulation of axons allows the detection of functional synaptic connections, pharmacological characterization, and evaluation of their strength. In addition, biocytin filling of the recorded neuron can be used for post-hoc morphological identification of the postsynaptic neuron.

This protocol describes a set of methods to identify the cell-type specific functional connectivity of long-range inputs from distant brain regions using optogenetic stimulations in ex vivo brain slices.

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injektionen für optogenetische Stimulation von Long-Range-Eingängen in Maus Gehirn Scheiben

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

Adaptable Angled Stereotactic Approach for Versatile Neuroscience Techniques

Stereotactic surgery is an essential tool in the modern neuroscience lab. However, the ability to precisely and accurately target difficult-to-reach brain regions still presents a challenge, particularly when targeting brain structures along the midline. These challenges include avoiding of the superior sagittal sinus and third ventricle and the ability to consistently target selective and discrete brain nuclei. In addition, more advanced neuroscience techniques (e.g., optogenetics, fiber photometry, and two-photon imaging) rely on targeted implantation of significant hardware to the brain, and spatial limitations are a common hindrance. Presented here is a modifiable protocol for stereotactic targeting of rodent brain structures using an angled coronal approach. It can be adapted to 1) mouse or rat models, 2) various neuroscience techniques, and 3) multiple brain regions. As a representative example, it includes the calculation of stereotactic coordinates for targeting of the mouse hypothalamic ventromedial nucleus (VMN) for an optogenetic inhibition experiment. This procedure begins with the bilateral microinjection of an adeno-associated virus (AAV) encoding a light-sensitive chloride channel (SwiChR++) to a Cre-dependent mouse model, followed by the angled bilateral implantation of fiberoptic cannulae. Using this approach, findings show that activation of a subset of VMN neurons is required for intact glucose counterregulatory responses to insulin-induced hypoglycemia.

Described here is a stereotactic procedure that can target challenging and difficult-to-reach brain regions (due to spatial limitations) using an angled coronal approach. This protocol is adaptable to both mouse and rat models and can be applied to diverse neuroscientific applications, including cannula implantation and microinjections of viral constructs.

Anpassbarer winkelster stereotaktischer Ansatz für vielseitige neurowissenschaftliche Techniken

Stereotactic surgery is an essential tool in the modern neuroscience lab. However, the ability to precisely and accurately target difficult-to-reach brain ...

Stereotaxic Intracranial Delivery of Chemicals, Proteins or Viral Vectors to Study Parkinson's Disease

Parkinson's disease (PD) is a progressive disorder traditionally defined by resting tremor and akinesia, primarily due to loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra. Affected brain areas display intraneuronal fibrillar inclusions consisting mainly of alpha-synuclein (asyn) proteins. No animal model thus far has recapitulated all characteristics of this disease. Here, we describe the use of stereotaxic injection to deliver chemicals, proteins, or viral vectors intracranially in order to mimic various aspects of PD. These methods are well-established and widely used throughout the PD field. Stereotaxic injections are incredibly flexible; they can be adjusted in concentration, age of animal used for injection, brain area targeted and in animal species used. Combinations of substances allow for rapid variations to assess treatments or alter severity of the pathology or behavioral deficits. By injecting toxins into the brain, we can mimic inflammation and/or a severe loss of dopaminergic neurons resulting in substantial motor phenotypes. Viral vectors can be used to transduce cells to mimic genetic or mechanistic aspects. Preformed fibrillar asyn injections best recapitulate the progressive phenotype over an extended period of time. Once these methods are established, it can be economical to generate a new model compared to creating a new transgenic line. However, this method is labor intensive as it requires 30 minutes to four hours per animal depending on the model used. Each animal will have a slightly different targeting and therefore create a diverse cohort which on one hand can be challenging to interpret results from; on the other hand, help mimic a more realistic diversity found in patients. Mistargeted animals can be identified using behavioral or imaging readouts, or only after being sacrificed leading to smallercohort size after the study has already been concluded. Overall, this method is a rudimentary but effective way to assess a diverse set of PD aspects.

We describe how to successfully inject solutions into specific brain areas of rodents using a stereotaxic frame. This survival surgery is a well-established method used to mimic various aspects of Parkinson's disease.

Parkinson's disease (PD) is a progressive disorder traditionally defined by resting tremor and akinesia, primarily due to loss of dopaminergic neurons in ...

Optimierung der stereotaktischen Mikroinjektionsgenauigkeit bei Mäusen

Preliminary Validation of Stereotaxic Injection Coordinates via Cryosectioning

Stereotaxic injection of a specific brain region constitutes a fundamental experimental technique in basic neuroscience. Researchers commonly base their choice of stereotaxic injection parameters on mouse brain atlases or published materials that employed various populations/ages of mice and different stereotaxic equipment, necessitating further validation of the stereotaxic coordinate parameters. The efficacy of calcium imaging, chemogenetic, and optogenetic manipulations relies on the precise expression of reporter genes within the region of interest, often requiring several weeks of effort. Thus, it is a time-consuming task if the coordinates of the target brain region are not verified in advance. Using an appropriate dye instead of a virus and implementing cryosectioning, researchers can observe the injection site immediately following dye administration. This facilitates timely adjustments to coordinate parameters in cases where discrepancies exist between the actual injection site and the theoretical position. Such adjustments significantly enhance the accuracy of viral expression within the target region in subsequent experiments.

Autor im Rampenlicht: Beschleunigung der Forschung zu kognitiven Beeinträchtigungen bei Mäusen durch stereotaktische Injektion und kostengünstige Farbstoffe

The present protocol describes a practical strategy to expedite the verification step of stereotaxic injection coordinates before conducting viral tracing using dyes and frozen sections.

Vorläufige Validierung von stereotaktischen Injektionskoordinaten mittels Kryosektion

Stereotaxic injection of a specific brain region constitutes a fundamental experimental technique in basic neuroscience. Researchers commonly base their ...