We appreciate Dr. Jeong-Soo Lee for sharing the Tg(dbh:EGFP-MYCN) transgenic fish with us in our study. This work was supported by a grant 1K99CA178189-01 from the National Cancer Institute, a fellowship from the Pablove Foundation and the Friends for Life, and young investigator awards from the Alex's Lemonade Stand Foundation and the CureSearch for Children's Cancer Foundation.

HINWEIS: Alle Zebrafisch Studien und Pflege der Tiere wurden in Übereinstimmung mit der Mayo-Klinik Institut IACUC genehmigten Protokoll # A41213 getan. 1. DNA-Konstrukte für Transgenese <ol><li> Amplify ein 5,2-kb Dopamin beta-Hydroxylase (d &amp; bgr; h) Promotorbereich 8 mit dem CH211-270H11 BAC-Klon (von BACPAC Ressourcen-Center (BPRC)) als DNA-Template. Verwenden eines PCR-System geeignet für lange und genaue PCR-Amplifikation langer DNA-Matrizen und den folgenden Zyklus Programme für PCR: 94 ° C für 2 min, 10 Zyklen (94 ° C, 15 sec, 50 ° C, 30 sec, 68 &amp; deg; C, 8 min), gefolgt von 30 Zyklen (94 ° C, 15 sec, 53 ° C, 30 sec, 68 ° C, 8 min), 68 ° C, 4 min (Vorwärtsprimer 5&#39;-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGCGTACTCCCCCTTTTTAGG-3 &#39; und Rückwärtsprimer 5&#39;- GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTGTTGCTTTGTCGTCTTTTGA-3 &#39;). </li><li> Erstellen Sie die d &amp; bgr; h -pDONRP4-P1R Eintrag clone 8 mit kommerziellen rekombinanten Klonen System wie Multisite-Gateway. Mischen Sie 1 ul gereinigtes dβh PCR-Produkt (172 ng / ul), 1 ul (150 ng / ul) pDONRP4-P1R Donorvektor (zusammen mit anderen Gateway Vektoren sind großzügige Geschenke von Dr. Chi-Bin Chien, Univ. Of Utah) , 4 &amp; mgr; l TE-Puffer (pH 8,0) mit 2 ul BP Clonase Enzymmix, Inkubation 1 h bei 25 ° C und dann in One Shot TOP10 kompetente E. Transformation coli nach dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Generieren Sie die d &amp; bgr; h: EGFP-transgenen MYCN konstruieren 8 mit in Schritt 1.2 genannten rekombinanten Klonen System. Mischen Sie 1 ul jeder entry clone (150 ng / ul) mit einem 5,2-kb dβh Promotor (dβh -pDONR P4-P1R Konstrukt), EGFP fehlt ein Stop-Codon (PME-EGFP Konstrukt) und menschliche MYCN cDNA (ein großzügiges Geschenk von Dr. Hogarty an der Kinderklinik von Pennsylvania, MYCN-pDONRP2R-P3 Konstrukt), 1 ul (150 ng / ul) des modifizierten Zielvektor, der I-SceI-Erkennungsstellen (ein großzügiges Geschenk von Dr. C. Grabher, Karlsruher Institut für Technologie, Karlsruhe, Deutschland), 4 ul TE Puffer ( pH-Wert 8,0) mit 2 &amp; mgr; l LR Clonase Enzymmix, Inkubation 1 h bei 25 ° C und dann zu transformieren, um chemisch kompetente E. coli, wie One-Shot-Top-10 und folgen Sie dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Stellen mitf: mitf transgenen Konstrukt 8 durch Verdauen des PNP-mitf Vektor mit NotI und SalI Restriktionsenzyme für 2 h bei RT und durch Subklonieren des frei 2,65-kb (ein großzügiges Geschenk von Dr. D. Raible, Univ of Washington.) DNA-Fragment, das die MITF-Promotor und die kodierende Sequenz des Zebrafisch MITF Gen in die NotI und MluI-Stellen eines modifizierten pBluescript-Vektor, der flankierenden I-SceI-Erkennungsstellen enthält (ein großzügiges Geschenk von Dr. Hui Feng, Boston University), unter Verwendung von T4-DNA-Ligase gemß dem Protokoll des Herstellers. HINWEIS: Um die Effizienz der Erzeugung von stabilen MYCN exprimierenden Linien zu erhöhen, d &amp; bgr; h: EGFP-MYCN und mitf:. Mitf DNA-Konstrukte sind in einem Zellstadium Perlmutt Embryonen koinjiziert Perlmutt bezeichnet eine Art von mutierten Fische fehlt ein Neuralleiste stamm Melanophor während der Entwicklung 36. Somit kann die Erscheinung von Pigmentzellen in den injizierten Embryos schlägt die Integration MITF: MITF DNA-Konstrukte in das Genom. Es wurde gezeigt, dass zwei oder drei koinjiziert DNA-Konstrukte können in das Fischgenom 31 kointegriert werden. EGFP-MYCN Transgen und zur leichteren Identifizierung von MYCN stabile transgene Linie: So kann die Pigmentierung von mitf Ausdruck verursacht als Marker für die Integration der dβh dienen. </li><li> Mischen Sie die d &amp; bgr; h: EGFP-MYCN und mitf: mitf DNAKonstrukte in einem 3: 1-Verhältnis in einem Gesamtvolumen von 15 &amp; mgr; l Reaktion mit 1 &amp; mgr; l von I-SceI Enzym und 0,75 ul Puffer. Sicherzustellen, dass die Gesamtmenge an DNA in der Reaktion nicht 750 ng nicht überschreiten. </li><li> Führen Sie die I-SceI Verdauung bei RT für 4 h oder O / N. Am zweiten Tag wird die I-SceI- verdauten DNAs bereit sind für die Mikroinjektion oder bei -20 ° C für die Injektion in der Zukunft gespeichert werden. Bewahren Sie die I-SceI Enzym bei -80 ° C in kleinen Aliquots seiner Enzym zu gewährleiste. </li><li> Subklonieren die menschliche ALKF1174L und Wildtyp-ALK-Gen aus dem pcDNA3-Vektor (ein großzügiges Geschenk von Dr. George am Dana-Farber Cancer Institute) 7 in EcoRI- und NotI-Stellen eines pENTRY1A Vektor (ein großzügiges Geschenk von Dr. C. Grabher, Karlsruher Institut für Technologie, Karlsruhe, Deutschland) unter Verwendung von T4-DNA-Ligase gemß dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Generieren Sie die d &amp; bgr; h: ALKF1174L &lt;/ Em&gt; oder dβh: ALKWT transgene Konstrukte mit dem rekombinanten dessen Einzelheiten in Protokoll 1.2 erwähnt. Kurz gesagt, kombiniert drei Eingabe Klone dβh -pDONRP4-P1R, ALKF1174L- pENTRY1A (oder ALKWT -pENTRY1A) und P3E-polyA, in die modifizierte Zielvektor, der I-SceI-Erkennungsstellen (ein großzügiges Geschenk von Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institut für Technologie, Karlsruhe, Deutschland), mit LR Clonase Enzym-Mischung, nach dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Mischen Sie die d &amp; bgr; h: ALKF1174L (oder dβh: ALKWT) und dβh: mCherry DNA-Konstrukte zu einem 3: 1-Verhältnis und linearisieren sie mit I-SceI Enzym wie in PROTOKOLL 1,5-1,6 beschrieben. </li></ol> 2. Mikroinjektion <ol><li> Verwenden Sie Glasmikropipetten mit 1,0 mm Durchmesser für alle Injektionen 37. Brechen Sie die Spitze der Glasmikropipetten mit einer Rasierklinge vor der Injektion. Kalibrieren Sie das Injektionsvolumen von spritzening H 2 O in einen Tropfen Mineralöl. Der Durchmesser der resultierenden Tröpfchen und einstellen Mikroinjektor (Druck oder die Dauer der Druckimpuls), um sicherzustellen, dass das Injektionsvolumen von weniger als 10% des gesamten Zellvolumens von einem zell Embryonen. </li><li> Fügen Sie eine zusätzliche 0,5 ml frisches I-SceI Enzym (5 Einheiten / ul) in 5 ul Injektionslösung, die DNA-Konstrukte direkt vor der Injektion die Effizienz der Transgenese 38 zu erhöhen. Injizieren 50-80 pg linearisierter DNA-Konstrukte in das Zytoplasma einer Zelle-Embryonen. Um den Erfolg von Injektions sicherzustellen, mischen die Probe mit 0,25% Phenolrot zur Visualisierung. Wenn Zellen rot nach der Injektion, bedeutet dies, die Mikroinjektion erfolgreich ist. Um eine hohe Erfolgsquote für die Erzeugung transgener Fische zu gewährleisten, haben wir spritzen typischerweise bis zu 500 Embryonen. </li><li> Um transgene Fische stabil exprimieren MYCN erzeugen, coinject das linearisierte d &amp; bgr; h: EGFP-MYCN und MITF: MITF-DNA-Konstrukten (in einer 3: 1-Verhältnis) in Embryonen der Pigmentierung Mutante Perlmuttzebrafisch beim Ein-Zell-Stadium. Die Expression Mitf dient als Reporter für die Integration der transgenen Konstrukte im Fischgenom. </li><li> Für Mosaikexpression von ALK in dem Wildtyp oder MYCN transgenen Embryos, Co-Injektion das linearisierte d &amp; bgr; h: ALK F1174L (oder dβh: ALKWT) mit dβh: mCherry DNA-Konstrukte (bei ​​einem Verhältnis 3: 1) in die Ein-Zelle Embryonen aus der Zucht von F1 heterozygot Tg (dβh: EGFP-MYCN) erhaltenen transgenen Fisch mit Wildtyp AB Fische. So die Hälfte der Nachkommen transgen sind für MCYN und die Hälfte sind Wildtyp. </li></ol> 3. Bildschirm für stabile oder Mosaic transgene Fische <ol><li> Um die Effizienz der Identifizierung von stabilen MYCN -exprimierenden Leitungen zu erhöhen, zu betäuben vorwiegend injiziert Perlmutt Embryonen Tricaine (0,02%) at Tage 3-5 des postfertilization und Bildschirm für die Pigmentierung. Übertragen Sie die Embryonen mit Pigmentierung auf eine neue Petrischale mit frischen Ei Wasser und heben Sie sie bis zur Geschlechtsreife für weitere Überprüfungen für den Gründer Fisch, der den d &amp; bgr; h durchzuführen: EGFP-MYCN Transgen in den Keimzellen. </li><li> So ermitteln Sie den Gründer mit Keimbahntransmission von EGFP-MYCN, Outcross pigmentierte F0 wachsene Fische mit Wildtyp AB Fische und Bildschirm für EGFP-positiven Embryonen im 1-2 Tage nach der Befruchtung für weitere Genotypisierung. Legen Sie eine einzelne EGFP-positiven F1 Embryo in ein PCR-Röhrchen und entfernen Sie alle Flüssigkeit. In 50 ul von gDNA Extraktionspuffer, die 12,5 ul der 4x Lysepuffer, 35 ul H 2 O und 2,5 ul Proteinase K (10 mg / ml), um Embryo enthält. Inkubieren der Reaktion für 2-3 h bei 55 ° C, gefolgt von 10 Minuten Inkubation bei 98 ° C zur Inaktivierung von Proteinase K. Zu 50 ml 4x Lysepuffer machen, 500 &amp; mgr; l von 1 M Tris (pH 8,4), 2,5 ml 1 M KCl to 47 ml H 2 O. HINWEIS: Nach dem F0 MYCN stabile transgene Fische mit Wildtyp AB Fische gezüchtet, die alle die Nachkommen pigmentiert sind. So Pigmentierung nicht als Marker zur Identifizierung von MYCN- positive Fisch servieren. Während in der MYCN transgene Fische wird das EGFP-MYCN Fusionsprotein im PSNS exprimiert, einschließlich der sympathischen Neuronen des oberen Halsganglien und sequentiellen Ganglien des sympathischen Kette und den nicht PSNS dopaminergen Neuronen wie die Medulla oblongata und Kopfganglien 8. So kann die Expression von EGFP als Marker zur Identifizierung der MYCN stabilen transgenen Embryos dienen. </li><li> Verwenden Sie 2 ul von gDNA aus der pigmentierten F1 Embryo als Vorlage extrahiert Primer MYCN -test F1: 5&#39;-CTG CTT GAG GAG AAC CTG TG-3 &#39;; MYCN -R3: 5&#39;-AGG CAT CGT TTG AGG ATC AG-3 &#39;, und das folgende Programm Witzh die GC-RICH PCR System: 1 Zyklus 95 ° C für 3 min, 25 Zyklen von 95 ° C für 30 sec, 58 ° C für 30 sec, und 72 ° C für 3 min. Wir Genotyp typischerweise 14-16 pigmentierten Embryonen aus einer Paarung, die Anwesenheit von integrierten MYCN Transgen in den pigmentierten Embryonen wurden über 6 Gründer Fisch überexprimieren MITF und MYCN wurden durch dieses Verfahren identifiziert bestätigen. </li><li> Heben Sie den Rest der EGFP-positiven F1-Embryonen. Fin Clip und Genotyp sie bei 2-3 Monate alt Verwendung des obigen Protokolls, um die Integration des Transgens in MYCN Fisches weiter zu bestätigen. Breed F1 MYCN stabile transgene Fische mit Wildtyp AB Fische. Co-spritzen den linearisiert d &amp; bgr; h: ALK F1174L (oder dβh: ALKWT) mit dβh: mCherry DNA-Konstrukte in den einzelligen Embryonen in Protokoll 2.4 beschrieben. </li><li> Sortieren Sie die MYCN exprimierenden Embryos im Experiment in PROTOKOLL 2.4 beschrieben mit einem stereoskopischen Fluorescence Mikroskop und Bildschirm, die in erster Linie injizierten Embryonen an den Tagen 1-3 von postfertilization für die Expression von EGFP-MYCN im PSNS. Dann, während der Tage 2-5 des postfertilization, betäuben die Embryonen mit Tricaine (0,02%) und sortieren diese MYCN- positive oder negative Embryonen wieder basierend auf der Expression von mCherry im PSNS Verwendung eines stereoskopischen Fluoreszenzmikroskop. Die Expression mCherry dient als Marker für die Coexpression von ALK in Geweben der Mosaikprimär injizierten Tieren. HINWEIS: ~ 600 Nachkommen aus der Zucht von MYCN stabile transgene Fische mit Wildtyp-Fisch resultierenden Pro Gruppe wurden mit den linearisierte DNA-Konstrukte injiziert, einschließlich d &amp; bgr; h: ALK F1174L und dβh: mCherry, dβh: ALKWT und dβh: mCherry oder dβh : mCherry allein sind. Mosaik Expression mCherry in 70-90% des hauptsächlich eingespritzten Fische beobachtet werden. Die Hälfte einer ein-Drittel des injizierten Fische überlebten durch die Larvenstadium zur Tumor Uhr. </li><li> Heben Sie die gesamte mCherry + MYCN + und mCherry + MYCN - Embryonen gemäß den Standardprotokollen aus der Zebrafisch-Buch 39 und überwachen Tumor Beginn beginnend bei 5 Wochen postfertilization. </li></ol> 4. Tumor Watch in Mosaic transgene Fische <ol><li> Überwachen mCherry- positive primär injiziert Fisch alle 2 Wochen ab 5 Wochen postfertilization zum Nachweis von Tumor Beginn. </li><li> Anesthetize Fisch mit Tricaine (0,02%) und der Bildschirm für die Anwesenheit von mCherry - und EGFP-exprimierenden Tumoren in den PSNS unter Nikon SMZ-1500 stereoskopischen Fluoreszenzmikroskop mit einer Digitalsicht DS-U1-Kamera ausgestattet. </li><li> Um zu bestätigen, ob die Tumoren der ALK Transgen exprimieren, isolieren mCherry- und EGFP-positive Massen für ALK Genotypisierung PCR. </li><li> Unter Verwendung von PCR, verstärken genomischer DNAALK P7:: 5&#39;-AGG CCA GGT GTC CGG AAT GC-3 &#39;und ALK P18: 5&#39;-TGT CTT CAG GCT GAT GTT GC-3&#39; und die folgende PCR-Reaktion: 1 Zyklus aus entwickelten Tumoren mit den folgenden Primern extrahiert von 94 ° C für 5 min, 30 Zyklen (94 ° C für 30 sec, 55 ° C für 30 sec, und 72 ° C für 60 sec). Dann Folge das PCR-Produkt mit ALK P7 Primer weiter die Existenz von mutierten oder Wildtyp-ALK in den mCherry-positiven Tumoren bestätigen. </li></ol>

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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

In dieser repräsentativen Studie verwendeten wir transiente Co-Injektion und Co-Expression von aktivierten ALK mit dem mCherry Reportergens in MYCN exprimierenden transgene Fische, um zu zeigen, dass diese Gene zusammenarbeiten, um deutlich zu beschleunigen den Ausbruch von Neuroblastom, im Einklang mit unseren früheren Feststellung in Verbindung stabil transgene Fische Koexpression beide aktiviert ALK und MYCN 8. Dieses Mosaik transgenen Ansatz besitzt mehrere d...

Krebserkrankungen sind progressive Erkrankungen, die durch die Anhäufung von pathologischen Mutationen, Deletionen und Chromosomen gewinnt mit der Zeit gekennzeichnet. Diese genetischen Anomalien können mehrere zelluläre Prozesse, die vom Zellzyklus, Zelltod, energetische Metabolismus und Zusammensetzung des Zytoskeletts zu Reaktionen wie Hypoxie Stress beeinflussen. Daher spiegelt die Tumorgenese kollektive Aktionen von mehreren genetischen Veränderungen in einem breiten Spektrum von biologischen Prozessen. Neue integrative genomische Forschung, einschließlich Sequenzierung ganzer Genome, Exoms Sequenzierung, die gezielte Sequenzierung, deep sequencing und genomweiten Assoziationsstudien haben eine wachsende Zahl von neuen genetischen Veränderungen im Wesentlichen alle Arten von Tumoren 1-4 identifiziert. In vielen Fällen gemeinsam auftreten die genetischen Läsionen in einem nicht-zufälligen Weise 5-8, was darauf hindeutet, ihre Zusammenarbeit bei der Krankheitsentstehung. Sezieren der onkogenen Rollen der großen Palette von aberrant exprimierter Gene resultierenden from diese genomische Veränderungen ist notwendig, um neue therapeutische Strategien zu entwickeln und um die Antworten von Tumorzellen gegenüber diesen Substanzen zu verstehen, aber das hat sich als eine schwierige Aufgabe sein, die eine sehr robuste Tiermodellsysteme für die Durchführung von Hochdurchsatz-funktionelle Genomanalyse vivo. Obwohl Säugetiere, insbesondere Nagetiere, sind bevorzugte Modelle in der Krebsbiologie hat der Zebrafisch begonnen, erhebliche Aufmerksamkeit zu erregen. Die Knochenfische Zebrabärbling (Dario rerio) als Modellorganismus für die Entwicklungsstudie seit 1960 im Einsatz und wurde zum ersten Mal auf die Untersuchung von Tumor Pathogenese 1982 9-11 angewendet. Einfache Wartung, geringe Körpergröße, und hohe Fruchtbarkeit machen den Zebrafisch ein robustes Modell für eine groß angelegte Vorwärts genetischen Screens von Mutationen, die abnorme und pathologische Phänotypen 10 verleihen identifizieren. Die optische Transparenz der Zebrafischembryonen ist ein weiteres wichtiges Merkmal unterstützt breitere Verwendung dieser Krebs-Modell, wiesie ermöglicht in vivo-Bildgebung, um durchgeführt, um die Tumorentwicklung in Echtzeit 9 zu finden, eine Anwendung, die bei Nagern 12 relativ schwer werden. Neueste vergleichende Genomik Analyse der Zebrafisch Referenzgenom (ZV9) ergab 26.206 Protein kodierende Gene, mit 71% mit menschlichen Orthologe, von denen 82% sind mit krankheitsassoziierten Genen im Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) Datenbank 13 korreliert, 14. Folglich ist die Zebrafisch wurde verwendet, um diverse Arten von menschlichen Krebsarten, einschließlich Neuroblastom Muster 8, T-Zell-akute lymphatische Leukämie (T-ALL), 15,16, 17,18 Melanom, Ewing-Sarkom 19, Rhabdomyosarkom 20,21, Pankreaskarzinom 22, 23 und Leberzellkarzinom myeloischen malignen Erkrankungen, 24,25, und wurde ausgewählt, wie ein Krebs-Modell für die Xenotransplantation studiert 11,26. Eine stabile transgeneAnsatz im Zebrafisch wird häufig verwendet, um die Wirkung der Verstärkung-of-Funktion von Genen in der normalen Entwicklung oder Pathogenese 27,28 studieren. Ein solches Modell (Figur 1A) zu entwickeln, injiziert man ein DNA-Konstrukt, das das Gen von Interesse durch einen gewebespezifischen Promotor in die Ein-Zellen Wildtyp-Embryonen angetrieben enthält. Drei bis vier Monate nach der Injektion, wenn die injizierten Embryos geschlechtsreif sind, werden sie mit Wildtyp-Fischen ausgekreuzt, um diejenigen, die die Integration des DNA-Konstrukts in ihrer Keimbahn, die sie als Gründer Fisch Bildschirm Lizenzen. Viele Faktoren, wie beispielsweise die Kopienzahl und die Integrationsstelle des Transgens, beeinflussen die Expression des Transgens in stabilen transgenen Linien. Somit, um eine transgene Tumormodell zu entwickeln, haben, mehreren stabilen transgenen Linien Expression eines einzelnen Onkogen, zunächst erzeugt und für die Linie, die das Transgen in einer Ebene, die zu Tumorentstehung führen könnte exprimieren gescreent werden. Allerdings, wenn die Überexpression eines Kandidaten oncogene toxisch für Keimzellen, ist es schwierig, eine stabile transgene Linie erzeugt durch direkte Überexpression des Transgens 29. Daher kann dieser Ansatz sehr zeitaufwändig sein, mit einem hohen Risiko des Scheiterns, um ein geeignetes Modell Krebs erzeugen. Hier zeigen wir eine alternative Strategie, die auf Mosaik transiente Transgenese (1B), die einzigartige Vorteile gegenüber herkömmlichen stabilen Transgenese für funktionelle genomische Untersuchung in vivo zur Verfügung stellt. In diesem Ansatz werden eine oder mehrere transgene Konstrukte in der Ein-Zell-Stadium von transgenen und Wildtyp-Embryos injiziert. Die injizierten DNA-Konstrukte, die Transgene sind dann mosaik und zufällig in den Primär injiziert Fisch integriert, was zu einer gemischten Genotypen in mehreren Zellpopulationen in den einzelnen Fisch 30. Außerdem Koinjektion von mehreren DNA-Konstrukte in einem Zellembryonen zu Co-Integration in die gleiche Zelle an zufälligen Stellen, so dass man trace die Zellen mit Expression von Transgenen und erkunden Sie die Wechselwirkungen verschiedener Gene im Krankheitsentstehung in den Mosaik-Tiere 31. Als Beweis für das Prinzip, transient wir im peripheren sympathischen Nervensystems (PSNS) unter der Kontrolle des Dopamin-beta-Hydroxylase (d &amp; bgr; h) Promotors in Wildtyp-Fisch und transgene Fische überexprimierenden MYCN überexprimiert Mutation aktiviert ALK (F1174L) mit mCherry Reportergens. ALK, das einen Rezeptor-Tyrosin-Kinase kodiert, ist das am häufigsten mutierte Gen in Hochrisiko-Neuroblastom 5-7,32,33. ALK (F1174L), als eine der häufigsten und potente somatischen aktivierenden Mutationen ist in überrepräsentiert MYCN- verstärkt Neuroblastom-Patienten mit hohem Risiko und wirkt synergistisch mit MYCN Expression auf Neuroblastom Tumorentstehung in der stabilen transgenen Mäusen und transgenen Zebrafisch Modelle 8,34,35 beschleunigen. Durch Mosaiktransiente Überexpression von ALK (F1174L) mit mCherry im MYCN transgene Fische, rekapituliert wir die Beschleunigung der in der stabilen transgenen Fischen Überexpression sowohl ALK (F1174L) und MYCN beobachteten Tumor Beginn, was darauf hindeutet, dass das Mosaik Transgenese Strategie kann schnell und effizient eingesetzt werden Bewertung der relativen Beiträge mehrerer Onkogene in Tumorinitiation in vivo.

<table><tbody><tr><td>Expand Long Template PCR System&amp;nbsp;</td><td>Roche Applied Science, IN</td><td>11681834001</td><td></td></tr><tr><td>pCR-TOPO vector&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen, CA</td><td>451641</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>New England Biolabs, MA</td><td>M0202M</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR Clonase II enzyme&lt;br/&gt; Mix</td><td>Invitrogen, CA</td><td>11791-100</td><td></td></tr><tr><td>Gateway&amp;reg; BP Clonase&amp;reg; II enzyme mix</td><td>Invitrogen, CA</td><td>11789-020</td><td></td></tr><tr><td>GC-RICH PCR System&amp;nbsp;</td><td>Roche Applied Science, IN</td><td>12 140 306 001</td><td></td></tr><tr><td>Meganuclease I-SceI&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs, MA</td><td>R0694S</td><td></td></tr><tr><td>Nikon SMZ-1500 stereoscopic fluorescence microscope&amp;nbsp;</td><td>Nikon, NY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon digital sight DS-U1 camera</td><td>Nikon, NY</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mosaic zebrafish transgenesis for functional genomic analysis of candidate cooperative genes in tumor pathogenesis

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers. To robustly and efficiently identify oncogenic &#8220;drivers&#8221; among these tumors and define their complex relationships with concurrent genetic alterations during tumor pathogenesis remains a daunting task. Recently, zebrafish have emerged as an important animal model for studying human diseases, largely because of their ease of maintenance, high fecundity, obvious advantages for in vivo imaging, high conservation of oncogenes and their molecular pathways, susceptibility to tumorigenesis and, most importantly, the availability of transgenic techniques suitable for use in the fish. Transgenic zebrafish models of cancer have been widely used to dissect oncogenic pathways in diverse tumor types. However, developing a stable transgenic fish model is both tedious and time-consuming, and it is even more difficult and more time-consuming to dissect the cooperation of multiple genes in disease pathogenesis using this approach, which requires the generation of multiple transgenic lines with overexpression of the individual genes of interest followed by complicated breeding of these stable transgenic lines. Hence, use of a mosaic transient transgenic approach in zebrafish offers unique advantages for functional genomic analysis in vivo. Briefly, candidate transgenes can be coinjected into one-cell-stage wild-type or transgenic zebrafish embryos and allowed to integrate together into each somatic cell in a mosaic pattern that leads to mixed genotypes in the same primarily injected animal. This permits one to investigate in a faster and less expensive manner whether and how the candidate genes can collaborate with each other to drive tumorigenesis. By transient overexpression of activated ALK in the transgenic fish overexpressing MYCN, we demonstrate here the cooperation of these two oncogenes in the pathogenesis of a pediatric cancer, neuroblastoma that has resisted most forms of contemporary treatment.

Um zu untersuchen, ob die Überexpression von Mutation aktiviert ALK F1174L oder Wildtyp-ALK konnte mit MYCN in Neuroblastom-Induktions zusammenzuarbeiten, überexprimiert wir entweder aktivierten menschlichen ALK oder Wildtyp-menschlichen ALK unter der Kontrolle der d &amp; bgr; h Promotor in der PSNS transgener Fische überexprimierenden MYCN. Eine der folgenden Konstrukte, dβh - ALKF1174L oder dβh - in einzelligen Wildtyp oder...

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Mosaik-Zebrafisch-Transgenese zur funktionellen Genomanalyse von in Frage kommenden kooperativen Genen bei der Tumorpathogenese | Entwicklungsbiologie | Video

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis

The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

Mosaic Zebrafisch Transgenese für Funktionelle Genomanalyse Candidate Cooperative Gene in Tumor Pathogenese

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers.  To robustly and efficiently ...

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11.1K Aufrufe.  Mayo Clinic College of Medicine, Center for Individualized Medicine. The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

Serie: Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to assess potential patient response to therapy. Current methods largely depend on using syngeneic or immune-compromised animals to avoid rejection of the tumor graft. Such methods require the use of specific genetic strains that often prevent the analysis of immune-tumor cell interactions and/or are limited to specific genetic backgrounds. An alternative method in zebrafish takes advantage of an incompletely developed immune system in the embryonic brain before 3 days, where tumor cells are transplanted for use in short-term assays (i.e., 3 to 10 days). However, these methods cause host lethality, which prevents the long-term study of tumor cell behavior and drug response. This protocol describes a simple and efficient method for the long-term orthotopic transplantation of zebrafish brain tumor tissue into the fourth ventricle of a 2-day-old immune-competent zebrafish. This method allows: 1) long-term study of tumor cell behaviors, such as invasion and dissemination; 2) durable tumor response to drugs; and 3) re-transplantation of tumors for the study of tumor evolution and/or the impact of different host genetic backgrounds. In summary, this technique allows cancer researchers to assess engraftment, invasion, and growth at distant sites, as well as to perform chemical screens and cell competition assays over many months. This protocol can be extended to studies of other tumor types and can be used to elucidate mechanisms of chemoresistance and metastasis.

The transplantation of cancer cells is an important tool for the identification of cancer mechanisms and therapeutic responses. Current techniques depend on immune-incompetent animals. Here, we describe a method to transplant zebrafish tumor cells into immune-competent embryos for the long-term analysis of tumor cell behavior and in vivo drug responses.

Transplantation von Zebrafisch-pädiatrischen Hirntumoren in immune-kompetente Wirte für die Langzeitstudie von Tumorzellverhalten und Drug Response

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

Forschung

Krebsforschung

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Genomic studies of human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered in tumors1,2,3. A challenge arising from these studies is that many genes are altered, and it can be difficult to distinguish genetic alterations that drove tumorigenesis from that those arose incidentally during transformation. To draw this distinction it is beneficial to have an assay that can quantitatively measure the effect of an altered gene on tumor initiation and other processes that enable tumors to persist and disseminate. Here we present a rapid means to screen large numbers of candidate melanoma modifiers in zebrafish using an autochthonous tumor model4 that encompasses steps required for melanoma initiation and maintenance. A key reagent in this assay is the miniCoopR vector, which couples a wild-type copy of the mitfa melanocyte specification factor to a Gateway recombination cassette into which candidate melanoma genes can be recombined5. The miniCoopR vector has a mitfa rescuing minigene which contains the promoter, open reading frame and 3'-untranslated region of the wild-type mitfa gene. It allows us to make constructs using full-length open reading frames of candidate melanoma modifiers. These individual clones can then be injected into single cell Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf)zebrafish embryos. The miniCoopR vector gets integrated by Tol2-mediated transgenesis6 and rescues melanocytes. Because they are physically coupled to the mitfa rescuing minigene, candidate genes are expressed in rescued melanocytes, some of which will transform and develop into tumors. The effect of a candidate gene on melanoma initiation and melanoma cell properties can be measured using melanoma-free survival curves, invasion assays, antibody staining and transplantation assays.

A rapid way to screen for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model is presented. It takes advantage of the miniCoopR vector which allows for expression of candidate melanoma genes in melanocytes. A method to obtain melanoma-free survival curves, an invasion assay, a protocol for antibody staining of scale melanocytes and a melanoma transplantation assay are described.

Screening für Melanom Modifiers mit einem Zebrafisch Autochthone Tumormodell

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Medizin

Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly visualizing the response to anti-cancer therapies (chemo, radiotherapy, and biologicals), angiogenesis and metastasis with single cell resolution, places the zebrafish xenograft model as a top choice to develop preclinical studies.

The zebrafish larval xenograft assay presents several experimental advantages compared to other models, but probably the most striking is the reduction of size scale and consequently time. This reduction of scale allows single cell imaging, the use of a relatively low number of human cells (compatible with biopsies), medium-high-throughput drug screenings, but most importantly enables a significant reduction of the time of the assay. All these advantages make the zebrafish xenograft assay extremely attractive for future personalized medicine applications.

Many zebrafish xenograft protocols have been developed with a wide diversity of human tumors; however, a general and standardized protocol to efficiently generate zebrafish larval xenografts is still lacking. Here we provide a step-by-step protocol, with tips to generate xenografts and guidelines for tumor behavior analysis, whole-mount immunofluorescence, and confocal imaging quantification.

Here, we provide a step-by-step protocol, with tips to generate xenografts and guidelines for tumor behavior analysis, whole-mount immunofluorescence, and confocal imaging quantification.

Generation von Zebrafischen Larval Xenografts und Tumorverhaltensanalyse

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly ...

Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing technologies applied in zebrafish modeling, the ease of maintenance, high-yield productivity, and powerful live imaging altogether make the zebrafish a valuable model system to study metastasis and cellular and molecular bases underlying this process in vivo. The first zebrafish neuroblastoma (NB) model of metastasis was developed by overexpressing two oncogenes, MYCN and LMO1, under control of the dopamine-beta-hydroxylase (d&#946;h) promoter. Co-overexpressed MYCN and LMO1 led to the reduced latency and increased penetrance of neuroblastomagenesis, as well as accelerated distant metastasis of tumor cells. This new model reliably reiterates many key features of human metastatic NB, including involvement of clinically relevant and metastasis-associated genetic alterations; natural and spontaneous development of metastasis in vivo; and conserved sites of metastases. Therefore, the zebrafish model possesses unique advantages to dissect the complex process of tumor metastasis in vivo.

This paper introduces the method of developing, characterizing, and tracking in real-time the tumor metastasis in zebrafish model of neuroblastoma, specifically in the transgenic zebrafish line with overexpression of MYCN and LMO1, which develops metastasis spontaneously.

Zebrafisch-Modell der Neuroblastom-Metastasierung

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling processes of excitable neuronal and muscular cells and many other biological processes, such as embryonic developmental patterning. However, there is a need for in vivo electrical activity monitoring in vertebrate embryogenesis. The advances of genetically encoded fluorescent voltage indicators (GEVIs) have made it possible to provide a solution for this challenge. Here, we describe how to create a transgenic voltage indicator zebrafish using the established voltage indicator, ASAP1 (Accelerated Sensor of Action Potentials 1), as an example. The Tol2 kit and a ubiquitous zebrafish promoter, ubi, were chosen in this study. We also explain&#160;the processes of Gateway site-specific cloning, Tol2 transposon-based zebrafish transgenesis, and the imaging process for early-stage fish embryos and fish tumors using regular epifluorescent microscopes. Using this fish line, we found that there are cellular electric voltage changes during zebrafish embryogenesis, and fish larval movement. Furthermore, it was observed that in a few zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors, the tumor cells were generally polarized compared to the surrounding normal tissues.

Here, we show the process of creating a cellular electric voltage reporter zebrafish line to visualize embryonic development, movement, and fish tumor cells in vivo.

Visualisierung von zellulären elektrische Aktivität im frühen Zebrafish Embryos und Tumoren

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Entwicklungsbiologie

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray technology is used in numerous biological disciplines in a variety of applications including global gene expression analysis in relation to developmental stage, to a disease state, and in toxic responses. Herein, we include a demonstration of global gene expression analysis using a comprehensive zebrafish-specific oligonucleotide microarray platform. The zebrafish expression microarray platform contains 385,000 probes, 60 base pairs in length, interrogating 37,157 targets with up to 12 probes per target. For this platform, all cDNA and genomic information available for the zebrafish was collected from various genomic databases including Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu), and ZFIN (http://www.zfin.org). As a result this expression array provides complete coverage of the current zebrafish transcriptome. The zebrafish expression microarray was printed by Roche NimbleGen (Madison, WI). This technical demonstration includes the fluorescent labeling of a cDNA product, hybridization of the labeled cDNA product to the microarray platform, and array scanning for signal acquisition using the one color analysis strategy.  

Gene microarrays are powerful tools in gene expression profiling at a genome-wide level. This technology has application in a variety of biological disciplines including developmental biology and toxicology. In this video, we detail a protocol for global gene expression analysis using a comprehensive oligonucleotide microarray platform for the zebrafish.

Globale Genexpressionsanalyse Mit einem Zebrafisch Oligonukleotid-Microarray-Plattform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Biologie

Normal and Malignant Muscle Cell Transplantation into Immune Compromised Adult Zebrafish

Zebrafish have become a powerful tool for assessing development, regeneration, and cancer. More recently, allograft cell transplantation protocols have been developed that permit engraftment of normal and malignant cells into irradiated, syngeneic, and immune compromised adult zebrafish. These models when coupled with optimized cell transplantation protocols allow for the rapid assessment of stem cell function, regeneration following injury, and cancer. Here, we present a method for cell transplantation of zebrafish adult skeletal muscle and embryonal rhabdomyosarcoma (ERMS), a pediatric sarcoma that shares features with embryonic muscle, into immune compromised adult rag2E450fs homozygous mutant zebrafish. Importantly, these animals lack T cells and have reduced B cell function, facilitating engraftment of a wide range of tissues from unrelated donor animals. Our optimized protocols show that fluorescently labeled muscle cell preparations from &#945;-actin-RFP transgenic zebrafish engraft robustly when implanted into the dorsal musculature of rag2 homozygous mutant fish. We also demonstrate engraftment of fluorescent-transgenic ERMS where fluorescence is confined to cells based on differentiation status. Specifically, ERMS were created in AB-strain myf5-GFP; mylpfa-mCherry double transgenic animals and tumors injected into the peritoneum of adult immune compromised fish. The utility of these protocols extends to engraftment of a wide range of normal and malignant donor cells that can be implanted into dorsal musculature or peritoneum of adult zebrafish.

Here, we present a protocol for cell transplantation of zebrafish skeletal muscle and embryonal rhabdomyosarcoma (ERMS) into adult immune compromised rag2E450fs homozygous mutant zebrafish. This protocol allows for the efficient analysis of regeneration and malignant transformation of muscle cells.

Normalen und malignen Muscle Cell Transplantation in immungeschwächten Adult Zebrafisch

Zebrafish have become a powerful tool for assessing development, regeneration, and cancer. More recently, allograft cell transplantation protocols have ...

Immunologie und Infektion

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences

The completion of the human genome sequence, along with that of many other species, has highlighted the challenge of ascribing specific function to non coding sequences. One prominent function carried out by the non coding fraction of the genome is to regulate gene transcription; however, there are no effective methods to broadly predict cis-regulatory elements from primary DNA sequence. We have developed an efficient protocol to functionally evaluate potential cis-regulatory elements through zebrafish transgenesis. Our approach offers significant advantages over cell-culture based techniques for developmentally important genes, since it provides information on spatial and temporal gene regulation. Conversely, it is faster and less expensive than similar experiments in transgenic mice, and we routinely apply it to sequences isolated from the human genome. Here we demonstrate our approach to selecting elements for testing based on sequence conservation and our protocol for cloning sequences and microinjecting them into zebrafish embryos.

We demonstrate our approach to finding potential enhancer elements from developmentally regulated genes and evaluating their function through mosaic zebrafish transgenesis.

Mosaic Zebrafisch Transgenese zur Beurteilung Enhancer-Sequenzen

The completion of the human genome sequence, along with that of many other species, has highlighted the challenge of ascribing specific function to non ...

Verwendung von Zebrafischlarven für effiziente In-vivo-Tumorstudien

A Simple, Rapid, and Effective Method for Tumor Xenotransplantation Analysis in Transparent Zebrafish Embryos

In vivo studies of tumor behavior are a staple of cancer research; however, the use of mice presents significant challenges in cost and time. Here, we present larval zebrafish as a transplant model that has numerous advantages over murine models, including ease of handling, low expense, and short experimental duration. Moreover, the absence of an adaptive immune system during larval stages obviates the need to generate and use immunodeficient strains. While established protocols for xenotransplantation in zebrafish embryos exist, we present here an improved method involving embryo staging for faster transfer, survival analysis, and the use of flow cytometry to assess disease burden. Embryos are staged to facilitate rapid cell injection into the yolk of the larvae and cell marking to monitor the consistency of the injected cell bolus. After injection, embryo survival analysis is assessed up to 7 days post injection (dpi). Finally, disease burden is also assessed by marking transferred cells with a fluorescent protein and analysis by flow cytometry. Flow cytometry is enabled by a standardized method of preparing cell suspensions from zebrafish embryos, which could also be used in establishing the primary culture of zebrafish cells. In summary, the procedure described here allows a more rapid assessment of the behavior of tumor cells in vivo with larger numbers of animals per study arm and in a more cost-effective manner.

Autor im Rampenlicht: Weiterentwicklung von Krebstherapeutika mit Tumor-Xenotransplantation im Zebrafisch

We describe a protocol for xenotransplantation into the yolk of transparent zebrafish embryos that is optimized by a simple, rapid staging method. Post-injection analyses include survival and assessing the disease burden of xenotransplanted cells by flow cytometry.

Eine einfache, schnelle und effektive Methode zur Analyse der Tumor-Xenotransplantation in transparenten Zebrafischembryonen

In vivo studies of tumor behavior are a staple of cancer research; however, the use of mice presents significant challenges in cost and time. Here, we ...

Mosaic Zebrafisch Transgenese für Funktionelle Genomanalyse Candidate Cooperative Gene in Tumor Pathogenese

Zusammenfassung

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Transplantation von Zebrafisch-pädiatrischen Hirntumoren in immune-kompetente Wirte für die Langzeitstudie von Tumorzellverhalten und Drug Response

Screening für Melanom Modifiers mit einem Zebrafisch Autochthone Tumormodell

Generation von Zebrafischen Larval Xenografts und Tumorverhaltensanalyse

Zebrafisch-Modell der Neuroblastom-Metastasierung

Visualisierung von zellulären elektrische Aktivität im frühen Zebrafish Embryos und Tumoren

Globale Genexpressionsanalyse Mit einem Zebrafisch Oligonukleotid-Microarray-Plattform

Normalen und malignen Muscle Cell Transplantation in immungeschwächten Adult Zebrafisch

Mosaic Zebrafisch Transgenese zur Beurteilung Enhancer-Sequenzen

Eine einfache, schnelle und effektive Methode zur Analyse der Tumor-Xenotransplantation in transparenten Zebrafischembryonen

Eine einfache, schnelle und effektive Methode zur Analyse der Tumor-Xenotransplantation in transparenten Zebrafischembryonen