This work is supported by a grant from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC: 418391-2012). AC receives a scholarship from the Centre th&#233;matique de recherche en Neurosciences (CTRN). HDB is funded by a scholarship from the Fonds de Recherche en Sant&#233; du Qu&#233;bec (FRSQ) and ML is a FRSQ Chercheur-Boursier.

HINWEIS: Die Experimente wurden in Übereinstimmung mit den kanadischen Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und wurden von der Université Laval Tierschutzkommission genehmigt. 1. Probenvorbereitung HINWEIS: In diesem Beispiel haben wir Mäusegehirnen bei postnatalen Tag 1. <ol><li> Verwenden Hypothermie Anästhesie in zerstoßenem Eis für 3 bis 4 Minuten für Welpen, dann zerlegen Gehirn so schnell wie möglich in eiskaltem L15 Medium. Führen Sie diesen Schritt innerhalb von 2 min. </li><li> Über seziert Gehirn in das Einbetten (Liste von Gütern vgl.) Form und füllen mit gefrorenen Gewebeeinbettungsmedien darauf achten, dass die Probe in der gewünschten Position zu orientieren. Frieren Proben sofort in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C. Führen Sie diesen Schritt innerhalb von 30 Sekunden. HINWEIS: Die Proben können einige Monate gelagert werden, ohne die RNA-Qualität. </li></ol> 2. Schnitte <ol><li> Treat Membran coated Glasobjektträger (vgl. Liste der Material) mit Oberflächen RNAse Dekontaminationslösung, um jede Spur von RNAsen zu beseitigen. Waschen Sie die Folien in DEPC-Wasser und trocknen lassen. Alternativ backen Plättchen über Nacht bei 200 ° C. </li><li> Übertragen Sie eingefrorenen Proben in einem Kryostaten zuvor mit einer Oberfläche RNAse Dekontaminationslösung gereinigt. Stellen Kryostatkammer Temperatur bei -20 ° C und in Scheiben schneiden Proben bei 10 &amp; mgr; m Dicke. Sammeln Gewebeschnitte auf die Membran beschichteten Objektträgern und trocknen lassen 10 Minuten vor der Färbung. Alternativ gleitet bei -80 ° C bis zur Färbung. </li></ol> 3. Herstellung von Färbelösungen <ol><li> Bereiten alle Lösungen unmittelbar vor dem Beginn des Experiments, und mit RNAse Inhibitor in allen Färbelösungen (außer Waschlösungen), um RNA-Abbau zu verhindern. </li><li> Bereiten Sie die Pufferlösung. Verwenden des gleichen Puffers in allen Lösungen (RNase-freies Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS besteht) von 1% BSA ergänzt war,0,2% Triton und 2% RNAse-Inhibitor). Für jede Folie, bereiten 400 ul Pufferlösung (200 ul für den primären und 200 ul für die Sekundärantikörper). </li><li> Bereiten Sie die Fixierungslösung: Verwenden Sie 70% Ethanol aufbewahrt bei -20 ° C. Halten der Gewebefixierung Verfahren minimal um eine drastische Verringerung der RNA Extraktionsausbeute zu vermeiden. HINWEIS: Alternativ können 95% Ethanol-Lösung von 5% Essigsäure ergänzt war, bei 20 ° C gehalten. </li><li> Bereiten Sie die primäre Antikörperlösung durch Verdünnen des primären Antikörpers in der Pufferlösung. Für dopaminergen Neuronen Kennzeichnung, verwenden Sie ein Antikörper, der auf die Tyrosin-Hydroxylase (TH, geschwindigkeitsbestimmende Enzym für Dopamin-Produktion). Mit einer hohen Konzentration des Antikörpers, um für die schnelle Inkubationszeit kompensieren. Verwenden TH-Antikörper in einer Verdünnung von 1:25. HINWEIS: Im normalen Immunfluoreszenz-Protokoll, diese Antikörper gibt ein starkes Signal, wenn über Nacht bei einer Verdünnung von 1: 1000. In diesem Protokoll wird es verwendet, 40x Konzentrataufgrund der kurzen Inkubationszeit ed. Aufgrund der hohen Konzentration des Antikörpers für dieses Verfahren verwendet, führen Sie eine Standard-Immunfärbung parallel, um jede Zunahme der nicht-spezifische Markierung überprüfen. </li><li> Vorbereiten des sekundären Antikörperlösung durch Verdünnung des sekundären Antikörpers in der Pufferlösung. Verwenden eines biotinylierten sekundären Antikörpers in einer Konzentration von 1: 100. HINWEIS: In diesem Beispiel wurde ein Anti-Kaninchen-Antikörper biotinyliert. </li><li> Vorbereiten des Avidin-Biotin-Komplex (ABC) Lösung zum Nachweis von biotinylierten sekundären Antikörper. Make ABC-Lösung durch Zugabe der Verbindung A und der Verbindung B in einer Konzentration von 1: 100 in DEPC PBS verdünnt, ergänzt mit 2% RNAse Inhibitor. Bereiten Sie die Avidin-Biotin-Komplex 30 Minuten, bevor Sie den Folien. </li></ol> 4. Die Färbung <ol><li> Tauen Sie ein oder zwei Folien zu der Zeit von -80 ° C nach schneller schnippte sie in der Luft (oder ein Luftgebläse). Surround Abschnitten mit einer hydrophobenBarriere Stift und lassen Sie für ein paar Sekunden trocknen. <ol><li> Die Objektträger in der kalten Fixierungslösung für nicht mehr als 5 min bei -20 ° C. Einmal schütteln, in der Luft, um mehr als Fixierungslösung anschließend in DEPC PBS 6-8 mal zum Waschen entfernen, schnell die Objektträger. </li><li> Streichen Sie die Folien, um überschüssige DEPC PBS zu entfernen. Stellen Sie sicher, dass die Schieber Auftauen Schritt ist 5 Minuten nicht überschreiten. </li></ol></li><li> Objektträger auf eine saubere Schale (mit einer Oberfläche RNAse Dekontaminationslösung vorbehandelt, um jede Spur von RNAsen beseitigen) und setzte 200 ul des primären Antikörperlösung auf jeder Folie (Kaninchen-Anti-TH) für 10 min bei Raumtemperatur. Dip gleitet schnell in DEPC PBS 3 mal zum Waschen und Flick die Folien einmal, um den Überschuss an DEPC PBS zu entfernen. </li><li> Setzen 200 ul des sekundären Antikörperlösung auf jedem Objektträger 6 Minuten lang bei Raumtemperatur. Dip gleitet schnell 3 mal in DEPC PBS zum Waschen und Flick die Folien, um das überschüssige DEPC PBS zu entfernen. </li><li> Setzen Sie 200 ul der ABC Lösungention auf jedem Objektträger für 4 min bei Raumtemperatur. Dip gleitet schnell in DEPC PBS 3 mal für das Waschen und die Folien blättern, um das überschüssige DEPC PBS zu entfernen. </li><li> Bereiten Sie die DAB (3,3 &#39;Diaminobenzidin) Lösung während der 4 min Inkubation in der ABC-Lösung. Verwenden Sie die Reagenzien im Kit (DAB Peroxidasesubstrat Kit) zur Verfügung gestellt. Mix 1 Tropfen vorgesehen Puffer, 1 Tropfen DAB-Lösung und 1 Tropfen 30% H 2 O 2 in 2,5 ml DEPC-Wasser. Mischen Sie die Lösung durch Umdrehen. </li><li> Nehmen Sie 196 ul der DAB-Lösung und fügen Sie 4 ul (2%) von RNAse Inhibitor-Lösung kurz vor Aufbringen auf Objektträger. Die Objektträger auf einer sauberen Schale (mit einer Fläche RNAse Dekontaminationslösung vorbehandelt) und legte die 200 ul der DAB-Lösung auf den Objektträgern. HINWEIS: DAB-Lösung sollte within1 oder 2 min reagieren. </li><li> Dip gleitet schnell in DEPC PBS 3 mal zum Waschen und legte Folien für einige Sekunden in absolutem Ethanol. Trocknen Sie die Folien durch flicking sie in der Luft (oder ein Luftgebläse). &lt;br /&gt; Hinweis: Folien können bei -80 ° C für eine spätere Verwendung gelagert oder für LCM verarbeitet werden. </li></ol> 5. Laser Capture Mikrodissektion <ol><li> Tauen Sie gleitet schnell durch flicking sie in der Luft (oder ein Luftgebläse). Stellen Sie sicher, dass die Schieber Auftauen Schritt ist 5 Minuten nicht überschreiten. </li><li> Fahren Sie mit LCM. Den Objektträger unter dem Mikroskop mit Blick auf das Sammelrohr Kappe der Probenseite. Wählen die beste Vergrößerung für die Probe. Stellen Sie den Fokus, um die Zellen von Interesse zu sehen. <ol><li> Legen Sie den Schnittbereich und fang an zu schneiden mit dem Laser. Sammeln seziert Zellen oder Gewebestück in der Sammelrohrkappe mit 50 ul Lysepuffer (von RNA-Extraktions-Kits) gefüllt. Sicherzustellen, dass der Schritt des LCM ist 30 min nicht übersteigt. </li></ol></li><li> Auszug Gesamt-RNA aus Zellen isoliert unter Verwendung einer RNA-Extraktions-Kits (vgl. Liste der Materialien). Folgen Sie dem Protokoll des Herstellers. <ol><li> Inkubieren gesammelten Zellen für 30 min bei 42 ° C zuLyse der Zellen. Voraussetzung der RNA Reinigungskolonne durch Zugabe von 250 ul der Konditionierungspuffer. Last 50 ul Ethanol zu lysierten Zellen. Laden Sie die 100 ul der lysierten Zellen auf eine vorkonditionierte Reinigungssäule. </li><li> Zentrifugieren Sie die Spalte bei 16.000 g für 2 Minuten bei Raumtemperatur. Zweimal Die Säule wird mit Waschpuffer. Eluieren in der minimal empfohlenen Volumen (11 ul) von RNase-freies Wasser (nicht behandelt DEPC wie es mit dem Bioanalyzer stören). Halten Sie 2 ul Testqualität. HINWEIS: Alle Lösungen und Reagenzien sind im Kit enthalten. </li></ol></li></ol> 6. cDNA Synthese und Quantitative RT-PCR <ol><li> Reverse Transkription und RNA-Proben aus dem Laser eingefangen dopaminergen Zellen in komplementäre DNA mittels reverser Transkriptase und Oligo (dT). Folgen Sie dem Protokoll des Herstellers (vgl. Liste von Material). </li><li> Verwenden 1 ul cDNA für qRT-PCR-Amplifikation mit genspezifischen Primern. Richten PCR reactions in 20 ul Volumen mit einer einkomponentigen Heißstartreaktionsmischung für quantitative PCR, wie vom Hersteller empfohlen. Führen Sie jede Reaktion in dreifacher Ausfertigung. <ol><li> Für die hier beschriebenen Experimente, die folgenden Primerpaare: GAPDH-F (5&#39;-CCA CCC AGA AGA CTG TGG AT-3 &#39;) / GAPDH-R (5&#39;-GGA TGC AGG GAT GAT GTT CT-3&#39;); Rpl13a-F (5&#39;-ACA GCC ACT CTG GAG GAG AA-3 &#39;) / Rpl13a-R (5&#39;-CTG CCT GTT TCC GTA ACC TC-3&#39;); Th-F (5&#39;-CAG TGG AGG ATG TGT CTC -3 &#39;) / Th-R (5&#39;-GAA AAT GGG CAG ACA CAC G-3&#39;); AADC-F (5&#39;-CAT AGC GAG TTC TGC CCT TC-3 &#39;) / AADC-R (5&#39;-GGA TGT GGT CCC TGT CAG AG-3&#39;). </li></ol></li><li> Führen quantitative RT-PCR-Amplifikation unter Verwendung der folgenden Rapid Cycling-Parameter: 95 ° C für 5 min, gefolgt von 45 Zyklen von 10 sec 95 ° C, 10 sec bei 60 ° C und 10 sec bei 72 ° C. Führen Schmelzkurvenanalyse mit dem Standard-Einstellung des Instruments auf Bestimne homogene Produktbildung. </li><li> Analysieren Sie die Daten mit Hilfe der integrierten Software. <ol><li> Normalisierung der Expressionswerte DA Marker Gene Th und AADC mit der Expression der beiden Referenzgenen GAPDH und Rpl13a um relative Expressionsniveaus zu erhalten, wie zuvor beschrieben 14. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Der kritischste Punkt dieses Verfahrens besteht darin, die Markierung von Zellen von Interesse, während verhindert RNA-Abbau. Wie RNAsen in wässrigen Lösungen aktiv sind, abnehm Inkubationszeiten verbessert RNA Erhaltung 11,15. Alle verwendeten Lösungen müssen mit DEPC, um RNasen zu inaktivieren behandelt werden. Alle Materialien und Oberflächen benötigen, um mit einer Oberfläche RNAse Dekontaminationslösung zu RNAsen Kontamination zu verhindern behandelt werden. Schließlich wird in diesen Bedingung...

Das Gehirn ist von einer großen Vielfalt von verschiedenen Neuronentypen Bilden komplexer Netzwerke zusammen. Diese Neuronen sind in verschiedene Gruppen und Untergruppen nach ihrer Morphologie, Konnektivität und Genexpressionsmuster 1 organisiert. Die Entwicklung von Mikroarrays, der nächsten Generation Sequenzierung und qRT-PCR bot die Möglichkeit, Genexpressionsprofile von neuronaler Populationen in verschiedenen biologischen Kontexten 1,2 zu vergleichen. Diese empfindlichen Analysen erfordern die präzise Identifizierung und Isolierung von Zelltypen von Interesse während RNA Integrität 2-4. Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) Technik wurde allgemein verwendet, um spezifische Zelltypen, basierend auf Zelloberflächen-Marker und / oder Morphologie zu isolieren. FACS benötigt eine Zellabtrennungsschritt vor der Sortierung, die in einem vollständigen Verlust der räumlichen Auflösung 5 führt. Viele neuronalen Subpopulationen voneinander unterschieden entsprechend ihrer anatomischen Verteilung in the Gehirn. Laser Mikrodissektion auf dünnen Gehirnschnitte angewendet bietet eine geeignete Option für spezifische Isolierung von Zellen mit hoher räumlicher Auflösung 6-8. Eine Hauptbeschränkung von LCM wurde die Notwendigkeit, Zellen von Interesse, basierend auf morphologischen Kriterien oder fluoreszierenden Reporterproteine ​​genetisch in Tiermodellen entwickelt identifizieren. Die Entwicklung neuer Techniken, um schnell Immunomarkierung Methoden, die RNA-Integrität bewahrt, in Kombination mit LCM durchzuführen, erlaubt nun die Isolierung von Zellpopulationen mit Gen-Profiling-Experimente fort. Dieser Ansatz wurde bereits durchgeführt wurden und kurz in einigen Publikationen 1,9-13 beschrieben. Hier zeigen wir ein detailliertes Verfahren zu hochwertigen RNA von einer bestimmten Untergruppe von Zellen in einer komplexen Gewebestruktur durch Kombinieren schnellen Immunmarkierung mit LCM erhalten. Wir zeigen, wie die wichtigsten kritischen Schritte durchführen, um eine maximale RNA-Gewinnung zu erhalten und zu vermeiden RNA-Abbau wie es siglich Auswirkungen Genexpressionsanalysen. Zur Demonstration dieses Protokoll wurden dopaminergen Neuronen von einem Tag alten Maushirn abgezielt. Dopaminergen Neuronen kann mit Hilfe eines gegen Tyrosinhydroxylase (TH) gerichteten Antikörpers, des geschwindigkeitsbestimmenden Enzyms für Dopaminsynthese immunolabeled werden. Nach TH Immunfärbung können einzelne oder Gruppen von dopaminergen Neuronen dann mit LCM isoliert werden. Mikrodissezierten Zellen werden in Lysepuffer gesammelt und RNA wird mit Hilfe eines RNA-Extraktions-Kit extrahiert. Qualität und Quantität der RNA extrahiert werden mit einem Bioanalyzer 5 gemessen. Die weitere Analyse der Genexpression mit: RNA-Sequenzierung, Microarray oder qRT-PCR kann anschließend durchgeführt 2,4,6 werden. Als ein Beispiel wird ein zweistufiger qRT-PCR von den Laser erfassten isolierten dopaminergen Domänen gezeigt. Die relative Quantifizierung der Expressionsniveaus von zwei dopaminergen Neurons Markergene zeigt die Selektivität dieses Protokolls.

<table><tbody><tr><td>Membrane coated slides&amp;nbsp;</td><td>Leica Biosystems</td><td>11505158</td><td>MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 &amp;micro;m; 50 pcs</td></tr><tr><td>Surface RNAse decontamination solution</td><td>Life technologies</td><td>AM9780</td><td>RNaseZap</td></tr><tr><td>Fixative</td><td></td><td></td><td>70% Ethanol kept at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Anti-TH&amp;nbsp;</td><td>Pel-Freez</td><td>P40101</td><td>&amp;nbsp;1:25</td></tr><tr><td>RNAse free buffer</td><td></td><td></td><td>DEPC PBS + 1% BSA+0.02% triton</td></tr><tr><td>RNAse inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2615</td><td>Rnasine Plus Rnase Inhibitor 40 kU/ml (stock)</td></tr><tr><td>Anti-rabbit biotinylated</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-1000</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain Elite ABC kit Standard</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td>8&amp;micro;l/ml</td></tr><tr><td>DAB Peroxidase Substrate Kit&amp;nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4100</td><td></td></tr><tr><td>RNA isolation kit</td><td>Life technologies</td><td>KIT0204</td><td>Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit</td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 30%</td><td>Sigma</td><td>HC4060</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol absolute</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser microdissection system</td><td>Leica microsystems</td><td></td><td>Model AS-LMD</td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Alfa Aesar</td><td>B22753-14</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td></td><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td></tr><tr><td>Embedding mold&amp;nbsp;</td><td>Leica Biosystems</td><td>14702218311</td><td>6x8mm</td></tr><tr><td>Hydrophobic barrier pen&amp;nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Frozen tissue embedding media</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer chip</td><td>Aligent Technologies</td><td>5067-1513</td><td>RNA 6000 Pico LabChip used with Agilent 2100 Bioanalyzer</td></tr><tr><td>Hot start reaction mix for quantitative PCR</td><td>Roche</td><td>6402712001</td><td>Fast Start Essential DNA Green Master</td></tr><tr><td>Reverse transcriptase</td><td>Life technologies</td><td>11752-050</td><td>SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR</td></tr></tbody></table>

rna isolation from cell specific subpopulations using laser-capture microdissection combined with rapid immunolabeling

Laser-Capture-Mikrodissektion (LCM) ermöglicht die Isolierung von spezifischen Zellen von Gewebedünnschnitten mit hoher räumlicher Auflösung. Effektive LCM erfordert eine genaue Identifizierung von Zellen-Subpopulationen aus einer heterogenen Gewebe. Identifizierung von Zellen von Interesse hinsichtlich LCM wird normalerweise auf morphologischen Kriterien oder fluoreszierendes Protein Reporter basiert. Die Kombination von LCM und schnelle Immunomarkierung bietet eine Alternative und effizientes Mittel, um spezifische Zelltypen zu visualisieren und um sie vom umgebenden Gewebe zu isolieren. Hochwertige RNA kann dann von einer reinen Zellpopulation extrahiert werden und für nachgelagerte Anwendungen, einschließlich RNA-Sequenzierung, Microarray oder qRT-PCR weiterverarbeitet werden. Dieser Ansatz wurde bereits durchgeführt wurden und kurz in einigen Veröffentlichungen beschrieben. Das Ziel dieses Artikels ist es zu zeigen, wie eine schnelle Immunmarkierung einer Zellpopulation durchzuführen und dabei RNA Integrität, und wie man diese spezifischen Zellen mit LCM isolieren. Hierin zeigen wird dieses mehrstufigen Verfahrens durch Immunmarkierung und die Erfassung dopaminergen Zellen im Hirngewebe von einem Tage alten Mäusen. Wir heben Taste kritischen Schritte, die besondere Beachtung verdienen. Dieses Protokoll kann auf eine Vielzahl von Geweben und Zellen von Interesse angepasst werden. Forscher aus verschiedenen Bereichen wird wahrscheinlich von der Demonstration dieses Ansatzes profitieren.

Diese schnelle Immunomarkierung Verfahren ermöglicht die Visualisierung von Zellen von Interesse während RNA Integrität. 1 veranschaulicht die Schritte der Gewebeaufbereitung vor RNA-Extraktion. Nach Kryoschneiden werden dopaminergen Neuronen mit einem gegen die Tyrosin-Hydroxylase gerichteten Antikörper (markierten Neuronen in braun angezeigt) gekennzeichnet. Je nach der experimentellen Frage, können einzelne Zellen oder größere Region von Interesse mit LCM isoliert werden (1D -...

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RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

Genexpressionsanalyse einer Untergruppe von Zellen in einem spezifischen Gewebe stellt eine große Herausforderung. Dieser Artikel beschreibt, wie man qualitativ hochwertige Gesamt-RNA aus einer bestimmten Zellpopulation durch die Kombination einer schnellen Immunomarkierung Verfahren mit Laser Mikrodissektion zu isolieren.

RNA-Isolierung aus zellspezifische Subpopulationen Mit Laser-Mikrodissektion In Verbindung mit Rapid-Immunmarkierung

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

rna-isolation-from-cell-specific-subpopulations-using-laser-capture

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

12.4K Aufrufe.  Université Laval.  Genexpressionsanalyse einer Untergruppe von Zellen in einem spezifischen Gewebe stellt eine große Herausforderung. Dieser Artikel beschreibt, wie man qualitativ hochwertige Gesamt-RNA aus einer bestimmten Zellpopulation durch die Kombination einer schnellen Immunomarkierung Verfahren mit Laser Mikrodissektion zu isolieren. 

Serie: RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell activation, stress, or stimulation. Single-cell multiplex gene expression enables the simultaneous assessment of tens of genes1,2,3. At the single-cell level, multiplex gene expression determines population heterogeneity4,5. It allows for the distinction of population heterogeneity by determining both the probable mix of diverse precursor stages among mature cells and also the diversity of cell responses to stimuli.
Innate lymphoid cells (ILC) have been recently described as a population of innate effectors of the immune response6,7. In this protocol, cell heterogeneity of the ILC hepatic compartment is investigated during homeostasis.
Currently, the most widely used technique to assess gene expression is RT-qPCR. This method measures gene expression only one gene at a time. Additionally, this method cannot estimate heterogeneity of gene expression, since multiple cells are needed for one test. This leads to the measurement of the average gene expression of the population. When assessing large numbers of genes, RT-qPCR becomes a time-, reagent-, and sample-consuming method. Hence, the trade-offs limit the number of genes or cell populations that can be evaluated, increasing the risk of missing the global picture.
This manuscript describes how single-cell multiplex RT-qPCR can be used to overcome these limitations. This technique has benefited from recent microfluidics technological advances1,2. Reactions occurring in multiplex RT-qPCR chips do not exceed the nanoliter-level. Hence, single-cell gene expression, as well as simultaneous multiple gene expression, can be performed in a reagent-, sample-, and cost-effective manner. It is possible to test cell gene signature heterogeneity at the clonal level between cell subsets within a population at different developmental stages or under different conditions4,5. Working on rare populations with large numbers of conditions at the single-cell level is no longer a restriction.

This protocol describes how to assess the expression of a large array of genes at the clonal level. Single-cell RT-qPCR produces highly reliable results with a strong sensitivity for hundreds of samples and genes.

Einzellige Gene Expression Mit Multiplex-RT-qPCR zum Charakterisieren Heterogene Rare Lymphatische Populations

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Forschung

Genetik

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

Laser Capture Mikrodissektion von Drosophila Peripheren Neuronen

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Neurowissenschaften

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. LMD techniques rely on a thermo labile membrane placed either on top of, or underneath, the tissue section. In one method, focused laser energy is used to melt the membrane onto the underlying cells, which can then be lifted out of the tissue section. In the other, the laser energy vaporizes the foil along a path "drawn" on the tissue, allowing the selected cells to fall into a collection device. Each technique allows the selection of cells with a minimum resolution of several microns. DNA, RNA, protein, and lipid samples may be isolated and analyzed from micro-dissected samples. In this video, we demonstrate the use of the Leica AS-LMD laser microdissection instrument in seven segments, including an introduction to the principles of LMD, initializing the instrument for use, general considerations for sample preparation, mounting the specimen and setting up capture tubes, aligning the microscope, adjusting the capture controls, and capturing tissue specimens. Laser-capture micro-dissection enables the investigator to isolate samples of pure cell populations as small as a few cell-equivalents. This allows the analysis of cells of interest that are free of neighboring contaminants, which may confound experimental results.

Laser Capture Mikrodissektion von Säugetiergewebe

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Biologie

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that is critical for learning, memory and executive function.1,2 Hence our studies focus on gene expression analysis of specific neuronal populations in distinct subregions of the hippocampus. The technique of laser capture microdissection (LCM), introduced in 1996 by Emmert-Buck, et al.,3 has allowed for significant advances in gene expression analysis of single cells and enriched populations of cells from heterogeneous tissues such as the mammalian brain that contains thousands of functional cell types.4 We use LCM and a well established rat model of traumatic brain injury (TBI) to investigate the molecular mechanisms that underlie the pathogenesis of TBI. Following fluid-percussion TBI, brains are removed at pre-determined times post-injury, immediately frozen on dry ice, and prepared for sectioning in a cryostat. The rat brains can be embedded in OCT and sectioned immediately, or stored several months at -80 &deg;C before sectioning for laser capture microdissection. Additionally, we use LCM to study the effects of TBI on circadian rhythms. For this, we capture neurons from the suprachiasmatic nuclei that contain the master clock of the mammalian brain. Here, we demonstrate the use of LCM to obtain single identified neurons (injured and degenerating, Fluoro-Jade-positive, or uninjured, Fluoro-Jade-negative) and enriched populations of hippocampal neurons for subsequent gene expression analysis by real time PCR and/or whole-genome microarrays. These LCM-enabled studies have revealed that the selective vulnerability of anatomically distinct regions of the rat hippocampus are reflected in the different gene expression profiles of different populations of neurons obtained by LCM from these distinct regions. The results from our single-cell studies, where we compare the transcriptional profiles of dying and adjacent surviving hippocampal neurons, suggest the existence of a cell survival rheostat that regulates cell death and survival after TBI.

We describe how to use laser capture microdissection (LCM) to obtain enriched populations of hippocampal neurons or single neurons from frozen sections of the injured rat brain for subsequent gene expression analysis using quantitative real time PCR and/or whole-genome microarrays.

Laser Capture Mikrodissektion von Angereichert Populationen von Neuronen oder Single Neurons zur Genexpressionsanalyse Nach Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor (EGF) and fibroblast growth factor (FGF) to provide an abundant supply of cells. NPCs were differentiated in the presence of a new combination of nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), dibutyryl cAMP (DBC) and retinoic acid on dishes coated with poly-L-lysine and mouse laminin to obtain neuron-rich cultures. NPCs were also differentiated in the absence of neurotrophins, DBC and retinoic acid and in the presence of ciliary neurotrophic factor (CNTF) to yield astrocyte-rich cultures. Differentiated NPCs were characterized by immunofluorescence staining for a panel of neuronal markers including NeuN, synapsin, acetylcholinesterase, synaptophysin and GAP43. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and STAT3, astrocyte markers, were detected in 10-15% of differentiated NPCs. To facilitate cell-type specific molecular characterization, laser capture microdissection was performed to isolate neurons cultured on polyethylene naphthalate (PEN) membrane slides. The methods described in this study provide valuable tools to advance our understanding of the molecular mechanism of neurodegeneration.

Human neuroprogenitor cells (NPCs) were expanded under proliferating conditions. NPCs were differentiated into neuron-rich cultures in the presence of a combination of neurotrophins. Neuronal markers were detected by immunofluorescence staining. To isolate a pure population of neurons, NPCs were differentiated on PEN membrane slides and laser capture microdissection was performed.

Laser Capture Mikrodissektion von Neuronen aus Differenzierte Menschen Neuroprogenitor Zellen in Kultur

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue sections on a microscope slide. When combined with immunohistochemistry, LCM can be used to isolate individual cells types based on a specific protein marker. Here, the LCM technique is described for collecting a specific population of dopamine neurons directly labeled with&#160;tyrosine hydroxylase immunohistochemistry and for isolation of the dopamine neuron containing region of the ventral tegmental area using indirect tyrosine hydroxylase immunohistochemistry on a section adjacent to those used for LCM. An infrared (IR) capture laser is used to both dissect individual neurons as well as the ventral tegmental area off glass slides and onto an LCM cap for analysis. Complete dehydration of the tissue with 100% ethanol and xylene is critical. The combination of the IR capture laser and the ultraviolet (UV) cutting laser is used to isolate individual dopamine neurons or the ventral tegmental area when using PEN membrane slides. A PEN membrane slide has significant advantages over a glass slide as it offers better consistency in capturing and collecting cells, is faster collecting large pieces of tissue, is less reliant on dehydration and results in complete removal of the tissue from the slide. Although removal of large areas of tissue from a glass slide is feasible, it is considerably more time consuming and frequently leaves some residual tissue behind. Data shown here demonstrate that RNA of sufficient quantity and quality can be obtained using these procedures for quantitative PCR measurements. Although RNA and DNA are the most commonly isolated molecules from tissue and cells collected with LCM, isolation and measurement of microRNA, protein and epigenetic changes in DNA can also benefit from the enhanced anatomical and cellular resolution obtained using LCM.

The isolation of individual dopamine neurons or the ventral tegmental area with direct or indirect immunohistochemistry is demonstrated using laser capture microdissection. Parameters for isolation of tissue from a glass slide using an infrared laser and from membrane slides using the combination of an infrared and ultraviolet laser are discussed.

Laser Mikrodissektion - Eine Demonstration der Isolation der einzelnen Dopamin-Neuronen und die gesamte ventrale Tegmentum

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive human diseases. Considerable advances have been made to uncover the molecular signatures of homeostatic microglia as well as alterations of their gene expression in response to environmental stimuli. With the advent and maturation of single-cell genomic methodologies, it is increasingly recognized that heterogenous microglia may underlie the diverse roles they play in different developmental and pathological conditions. Further dissection of such heterogeneity can be achieved through efficient isolation of microglia from a given region of interest, followed by sensitive profiling of individual cells. Here, we provide a detailed protocol for the rapid isolation of microglia from different brain regions in a single adult mouse brain hemisphere. We also demonstrate how to use these sorted microglia for plate-based deep single-cell RNA sequencing. We discuss the adaptability of this method to other scenarios and provide guidelines for improving the system to accommodate large-scale studies.

We provide a protocol for isolation of microglia from different dissected regions of an adult mouse brain hemisphere, followed by semi-automated library preparation for deep single-cell RNA sequencing of full-length transcriptomes. This method will help to elucidate functional heterogeneity of microglia in health and disease.

Isolierung von regionsspezifischer Mikroglia von einer Erwachsenenmaus Gehirnhälfte für tiefe einzellige RNA-Sequenzierung

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene expression in these tissues. Thus, to analyze cell-specific gene expression profiles from Drosophila tissues, it may be necessary to isolate specific cell types with high purity and at sufficient yields for downstream applications such as transcriptional profiling and chromatin immunoprecipitation. However, the irregular cellular morphology in tissues such as the central nervous system, coupled with the rare population of specific cell types in these tissues, can pose challenges for traditional methods of cell isolation such as laser microdissection and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Here, an alternative approach to characterizing cell-specific gene expression profiles using affinity-based isolation of tagged nuclei, rather than whole cells, is described. Nuclei in the specific cell type of interest are genetically labeled with a nuclear envelope-localized EGFP tag using the Gal4/UAS binary expression system. These EGFP-tagged nuclei can be isolated using antibodies against GFP that are coupled to magnetic beads. The approach described in this protocol enables consistent isolation of nuclei from specific cell types in the Drosophila larval central nervous system at high purity and at sufficient levels for expression analysis, even when these cell types comprise less than 2% of the total cell population in the tissue. This approach can be used to isolate nuclei from a wide variety of Drosophila embryonic and larval cell types using specific Gal4 drivers, and may be useful for isolating nuclei from cell types that are not suitable for FACS or laser microdissection.

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila tissues often contain a heterogeneous mixture of cell types.&#160;To examine gene expression in specific cell types from a particular tissue, nuclei can be genetically tagged and subsequently isolated using an affinity-based approach. Isolated nuclei can be used for downstream applications such as gene expression analysis and chromatin immunoprecipitation.

Affinity-basierte Isolierung von Tagged Kerne aus<em&gt; Drosophila</em&gt; Tücher für Genexpressionsanalyse

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

Erfassung von Gewebeproben der oralen submukösen Fibrose für die Spatial-Omics-Analyse

Isolation of Cells with Morphological and Spatial Information from Oral Submucous Fibrosis Samples by Laser Capture Microdissection

Oral submucous fibrosis (OSF) is a common type of potentially malignant disorder in the oral cavity. The atrophy of epithelium and fibrosis of the lamina propria and the submucosa are often found on histopathological slides. Epithelial dysplasia, epithelial atrophy, and senescent fibroblasts have been proposed to be associated with the malignant transformation of OSF. However, because of the heterogeneity of potentially malignant oral disorders and oral squamous cell carcinoma, it is difficult to identify the specific molecular mechanisms of malignant transformation in OSF. Here, we present a method to obtain a small number of epithelial or mesenchymal cells carrying morphological data and spatial information by laser capture microdissection on formalin-fixed paraffin-embedded tissue slides. Using a microscope, we can precisely capture microscale (~500 cells) dysplastic or atrophic epithelial tissue and fibrotic subepithelial tissue. The extracted cells can be evaluated by genome or transcriptome sequencing to acquire genomic and transcriptomic data with morphological and spatial information. This approach removes the heterogeneity of bulk OSF tissue sequencing and the interference caused by cells in non-lesioned areas, allowing for precise spatial-omics analysis of OSF tissue.

Autor im Rampenlicht: Die Geheimnisse oraler potenzieller Malignome entschlüsseln 

Laser capture microdissection of oral submucous fibrosis tissues allows for precise extraction of cells from histological regions of interest for the analysis of multi-omics data with morphological and spatial information.

Isolierung von Zellen mit morphologischen und räumlichen Informationen aus oralen submukösen Fibroseproben mittels Laser-Capture-Mikrodissektion

Oral submucous fibrosis (OSF) is a common type of potentially malignant disorder in the oral cavity. The atrophy of epithelium and fibrosis of the lamina ...

RNA-Isolierung aus zellspezifische Subpopulationen Mit Laser-Mikrodissektion In Verbindung mit Rapid-Immunmarkierung

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Einzellige Gene Expression Mit Multiplex-RT-qPCR zum Charakterisieren Heterogene Rare Lymphatische Populations

Laser Capture Mikrodissektion von Drosophila Peripheren Neuronen

Laser Capture Mikrodissektion von Säugetiergewebe

Laser Capture Mikrodissektion von Angereichert Populationen von Neuronen oder Single Neurons zur Genexpressionsanalyse Nach Traumatic Brain Injury

Laser Capture Mikrodissektion von Neuronen aus Differenzierte Menschen Neuroprogenitor Zellen in Kultur

Laser Mikrodissektion - Eine Demonstration der Isolation der einzelnen Dopamin-Neuronen und die gesamte ventrale Tegmentum

Isolierung von regionsspezifischer Mikroglia von einer Erwachsenenmaus Gehirnhälfte für tiefe einzellige RNA-Sequenzierung

Affinity-basierte Isolierung von Tagged Kerne aus

Isolierung von Zellen mit morphologischen und räumlichen Informationen aus oralen submukösen Fibroseproben mittels Laser-Capture-Mikrodissektion

Isolierung von Zellen mit morphologischen und räumlichen Informationen aus oralen submukösen Fibroseproben mittels Laser-Capture-Mikrodissektion