We thank Zhaohua Irene Tang in the W. M. Keck Science Department for the use of her epifluorescence microscope and the Werren lab for donating Nasonia for dissections. This work was supported in part by an NIH-NRSA fellowship (5F32GM105317-02) to AML.

1. Die Gewebe Dissection und Fixation (60 min) <ol><li> Für Drosophila Gehirn legen 3. Larvenstadium in einem Tropfen 1x PBS (phosphatgepufferte Salzlösung). Wählen Sie große 3. Larvenstadium, die aktiv kriechen aus Ampullen oder Flaschen, die nicht überfüllt sind. <ol><li> Verwenden Sie einen ultrafeinen Pinzettenpaar zu halten den Mund Haken und andere Pinzettenpaar zu greifen zwei Drittel über die gesamte Länge des Körpers (1A, B) zu greifen. Ziehen Sie vorsichtig an den Mund Haken, um das Gehirn, ventralen Ganglien, Speicheldrüsen und ein Teil der Larvenverdauungstrakt aus. Mit der Pinzette, um das Gehirn und ventralen ganglia trennen (1A, B) von den anderen Geweben und in einem Tröpfchen 1x PBT (phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit Tween) auf einer Kunststoff-Petriplatte. </li></ol></li><li> Für Nasonia Hoden Dissektionen, wählen Männchen 3 Tage alten Puppen (gelber Körper mit roten Augen). Männlich Nasonia haben kleine Flügelblocklängen in Bezug auf females im Puppenstadium (1C). <ol><li> Halten Sie die Puppe an der Spitze des Bauches in der Nähe des Brustbereich mit einer Pinzette Paar, und mit dem anderen Paar Pinzette, greifen die sehr distalen Spitze des Bauches, und ziehen Sie die tropfenförmigen Hoden (sie werden von Fett umgeben sein Körper, die leicht geschüttelt werden kann weg; 1D). Trennen Sie alle Karosserieaußenteile aus den Hoden, die richtige Quetschen, und in einem Tropfen 1x PBT auf einer Kunststoffpetrischale verhindert. </li></ol></li><li> Für jede Folie, sezieren insgesamt vier oder fünf Gewebeproben (dh., Drosophila Larven Gehirn oder Nasonia Hoden). HINWEIS: Mehr als fünf Proben werden überfüllt Kerne und Chromosomen führen. </li><li> Optional, einige Trennung von Schwesterchromatiden in euchromatischen Regionen der mitotischen Chromosomen erreichen, behandeln das Gewebe mit einer hypotonischen Lösung: Transfer Gehirne von 1x PBT einem Rückgang von 0,5% Natriumcitrat 5-10 (nicht mehr als 10) min. HINWEIS: Colchicin (a Mitoseinhibitor) kann hilfreich für die Erhöhung der Anzahl von Mitosen auf Metaphase 11 sein. Jedoch ist seine Verwendung nicht erforderlich, wenn sehr große gesunde Larven werden verwendet, und sogar unerwünscht, da sie sich negativ auf das Chromosom Auflösung, Ausbreiten und Morphologie. </li><li> Platzieren eines Tröpfchens (~ 20 &amp; mgr; l) der Fixierungslösung (2,5% Paraformaldehyd in 45% Essigsäure) auf die Oberfläche einer sauberen Sigmacote behandelten Deckgläschen. HINWEIS: Stellen Sie Fixierlösung frisch für jeden Tag der Nutzung. Fixative Lösungen, die 1,8 bis 3,7% Paraformaldehyd in 45% Essigsäure die besten Ergebnisse für die Fische. Die Verwendung anderer als Verstand oder Hoden Gewebe oder Anpassung dieses Protokoll für Immuno-FISH kann verlangen, das Experimentieren mit verschiedenen Fixiermitteln (für eine Liste von verschiedenen Fixiermittel, siehe 12). </li><li> Jede Gewebeprobe aus dem Seziersaal Puffers (1x PBT) vorsichtig in die Fixierungstropfens über mit ultrafeinen Pinzette, minimizing die Übertragung von Sezieren Puffer in die Fixierlösung. Positionieren der Gewebeproben, so dass sie gleichmäßig voneinander im Fixiermittel Tröpfchen beabstandet. Das Gewebe in Fixativ Inkubieren für 4 min bei Raumtemperatur. </li><li> Vorsichtig ein Poly-Lysin-beschichteten Objektträger nach unten, auf das Gewebe und Deckglas. Nicht nach unten drücken zu diesem Zeitpunkt nicht, sondern ermöglichen die beiden auf die leichte Schulter zu kontaktieren, damit das Deckglas klebt an der Unterseite des Schlittens. Kehren Sie die Rutsche so dass das Deckglas nach oben zeigt. </li><li> Sandwich die Folie / Gewebe / Deckglas in einem gefalteten Stück Filterpapier. Auf eine stabile Oberfläche, mit dem Daumen drücken ganz fest gerade nach unten auf die Position direkt über dem Deckglas. Achten Sie darauf, seitliche Verrutschen des Deckglases (dies führt dazu, dass ein Verschmieren des Gewebes). </li><li> Tauchen Sie den Schiebe / Gewebe / Deckglas in flüssigen Stickstoff (siehe Gerät in 1E, F), und stehen lassen, bis die Stickstoff stoppt Kochen (mehr ist fin). Entfernen Sie die Folie und sofort abknicken das Deckglas mit einer frischen Rasierklinge über einen Schiebe Ecke des Deckglas nach oben (nicht zerkratzt fixiertem Gewebe mit der Rasierklinge). <ol><li> Vorkühlung des Schiebe- / Gewebe / Deckglas auf einem Block von Trockeneis, Abdeckung nach oben rutschen, für 1-2 Minuten vor dem Eintauchen in flüssigen Stickstoff wird verhindert, dass die Folien vor dem Knacken. </li></ol></li><li> Sofort den Objektträger mit Gewebe in eine Coplin-Gefäß mit 100% Ethanol bei Raumtemperatur gefüllt und lassen Sie stehen für mindestens 5 min (diese Zeit kann länger sein, wenn erforderlich). HINWEIS: kaltem 100% Ethanol ebenfalls verwendet werden könnten. </li><li> Entfernen Sie die Folie mit dem Gewebe, Docht überschüssige Ethanol mit einem Kimwipe (ohne Berührung der festen Gewebe), und lassen Sie die Folie an der Luft trocknen für 1 Stunde. <ol><li> Gehen Sie direkt zu Schritt 2 oder Folien halten trocken in geringer Luftfeuchtigkeit Luft oder in einer Trocknungskammer für Wochen, sogar Monate vor der Durchführung der Hybridisierung. </li></ol></li></ol> Abbildung 1: (A) A 3. Larvenstadium Drosophila Larve (rechts), mit Positionen, wo die Mundhaken greifen angezeigt (gekennzeichnet mit *) und 2/3 der Weg nach unten die Larven Gehirn sezieren; (Links) eine schematische Darstellung einer Larve eine der gleichen Entwicklungsstufe, der Darstellung der relativen Position des Gehirns im Larvenkopf. (B) Das Gehirn und ventralen Ganglien von einem 3. Larvenstadium Drosophila Larve (rechts) und eine schematische Darstellung dieses seziert Gewebe (links). (C) 3 Tage alten Nasonia Puppe an der Gelbkörper-Rote-Augen-Bühne. (D) Ein Paar Hoden von einem 3 Tage alten Nasonia männlichen Puppe (rechts) seziert mit Positionen anzeigt, wo die Puppe greifen am hinteren Teil des Abdomens (bezeichnet mit einem *) und in der Mitte auf dem Körper; (Links) Schema, männlich und weiblich warp Puppen; männliche Puppen durch Flügel, die nicht an der sagittalen Profil (schwarzer Pfeil) erstrecken, im Gegensatz zu den Weibchen, die Flügel, die hinter dem Profil erstrecken unterschieden werden; die relative Position des Hodens Paar wird im männlichen Puppe (E) Das Gerät-ein String von Büroklammern-und (F) Verfahren verwendet werden, um Folien in einem Behälter mit flüssigem Stickstoff getaucht gezeigt.. Mehrere Büroklammer-Strings können zur gleichzeitigen Eintauchen der mehrere Folien verwendet werden. 2. In situ-Hybridisierung (30 min am Tag 1; 1 h &amp; ndash; 2,5 h bei langen Sonden-am Tag 2) <ol><li> 1 ul (100 ng) jeder Sonde zu 20 ul 1,1x Hybridisierungspuffer. Pipettensonde / Hybridisierungspuffer auf die Oberfläche der festen Gewebe (berühren Sie nicht die Gewebe). </li><li> Vorsichtig ein Deckglas direkt auf die Sonde / Hybridisierungspuffer, um sicherzustellen, dass das Deckglas wird direkt über das Gewebe zentriert. Der Puffer sollte die Migration zu thE äußeren Rand des Deckglases, so dass keine Luftblasen. HINWEIS: Kleine Blasen, die nicht in Verbindung treten Gewebe keine Probleme mit dem Verfahren stellen. Entfernen Sie große Blasen durch vorsichtiges Anheben einer Ecke des Deckglases und sorgfältig fallen sie zurück auf die Folie. </li><li> Legen Sie das Dia / Gewebe / Deckglas auf die Oberfläche eines Blocks zu 95 ° C vorgewärmt (Deckglas nach oben). Deckel mit einem großen Stück Alufolie auf Belichtung zu verhindern. Lassen der Schieber Inkubieren bei 95 ° C für 5 min. HINWEIS: Eine typische Wärmeblock mit Bohrungen für Rohre können umgedreht werden, um eine ebene Fläche, auf der die Folie / Gewebe / Deckglas legen werden. </li><li> Entfernen Sie die Folie und lassen ihn etwas abkühlen lassen, bis es warm anfühlen wird. Ein Stück Parafilm gestreckt sorgfältig einzuwickeln um das Deckglas, um die Flüssigkeit unter ihm zu versiegeln. </li><li> Das verschlossene Rutsche in einer feuchten Kammer und legen Sie die Kammer in einem Inkubator auf 30 ° C vorgewärmt. Inkubiere bei 30 ° C für 4 h bis über Nacht.<ol><li> Erstellen Sie eine Feuchtigkeitskammer von einer leeren Spitze Box oder Deckeltupperdose mit angefeuchteten Kimwipes oder Papiertücher an der Unterseite angebracht. HINWEIS: Einzelstrang-DNA-Oligo-Sonden wurden für 28-33 Basen, um eine theoretische Schmelztemperatur (T m) von 45-47 ° C zu erreichen. Diese Länge und T m Bereiche spiegeln die Tatsache wider, dass viele repetitive Sequenzen, die wir studiert haben, sind AT-reichen und damit sehr niedrige GC-Gehalt. Längere Sonden werden wahrscheinlich höhere T m -Werte; Diese können erhöhte Hintergrund-Hybridisierung auf dem Standard-Hybridisierungstemperatur von 30 ° C führen. So können einige Fehlersuche mit Hybridisierungstemperaturen erforderlich, um die besten Ergebnisse zu erzielen. Um die beste Hybridisierungstemperatur, Zunahme (oder Abnahme) die Temperatur um 5 ° C zu finden, inkrementell. </li></ol></li><li> Entfernen Sie vorsichtig den Parafilm von der Folie und dann vorsichtig die Deckglas durch langsames Anheben einer Ecke. Wash der Schlitten drei Mal für je 15 min in 0,1 × SSC Waschpuffer. Decken Sie die Coplin-Gefäß mit Aluminiumfolie in den Waschanlagen, um Belichtung zu minimieren. </li><li> Wenn nicht mit einem langen biotinylierte Sonde, fahren Sie mit Schritt 2.8. <ol><li> Wenn Sie eine lange biotinylierte Sonde, trocknen Sie den Bereich um das Gewebe mit einer Kimwipe, man aufpassen, das Gewebe selbst nicht zu berühren. Zeigen 100 l Blocking-Lösung über das Gewebe und die Abdeckung vorsichtig mit einem Deckglas, wobei darauf zu Fangblasen zu vermeiden. Wickeln Sie die Folie über das Deckglas mit Parafilm und bei 37 ° C für 30 min. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig das Deckglas und tupfen um das Gewebe mit einer Kimwipe. Je 100 &amp; mgr; l von Rhodamin-Avidin, 1: 1000 in SBT über das Gewebe und die Abdeckung vorsichtig mit einem Deckglas, wobei darauf zu achten Fangblasen. Wickeln Sie die Folie über das Deckglas mit Parafilm und bei 37 ° C für 30 min. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig das Deckglas und waschen Sie die Folie 3 Mal für jeweils 5 min in 4x SSCT- und dann3-mal für jeweils 5 min in 0,1 x SSC. HINWEIS: Folien können für längere Zeiträume gewaschen werden. </li></ol></li><li> Entfernen Sie die Folie und tupfen um das Gewebe mit einem trockenen Kimwipe um überschüssige Puffer zu entfernen (berühren Sie nicht die Gewebe). Stellen Sie den Schiebegewebeseite nach oben an einem dunklen Ort für 10-15 Minuten oder bis die Feuchtigkeit vollständig verflüchtigt. </li><li> Pipette 11 ul Vectashield Befestigungsmediums (4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol-DAPI) auf das Gewebe. Vorsichtig ein sauberes Deckglas (nicht mit Sigmacote behandelt) direkt über der Mitte des Montagemedium und Gewebe. Die Einschlussmittel sollte langsam nach außen zu den Kanten des Deckglases zu migrieren. HINWEIS: Wenn die Montagemedium ausfällt, um die Kante des Deckglases an allen Seiten zu erreichen, wird eine zusätzliche 1-2 ul Befestigungsmedium kann mit einer Position am Rand des Deckglases aufgebracht, um in der benötigten Volumen füllen. In diesem Fall müssen Sie wischen Sie überschüssiges Medium aus der Gleitfläche vorAbdichtung. </li><li> Seal die Ränder des Deckglases mit Nagellack. Vermeiden Sie die Malerei der Nagellack über die Gewebeprobe. </li><li> Den Objektträger aufrecht an einem dunklen Ort und lassen Sie den trockenen Nagellack bis zur vollständigen Fest (in der Regel 30 Minuten oder mehr). An dieser Stelle Bild das Gewebe oder bei -20 ° C für bis zu 1 Woche für die spätere Bildgebung. </li></ol> Buffer / Lösung Rezepte 10x PBS <ul><li> 80 g NaCl </li><li> 2,0 g KCl </li><li> 14,4 g Na 2 HPO 4 </li><li> 2,4 g KH 2 PO 4 </li><li> pH auf 7,4, H 2 O auf 1 l </li></ul> 1x PBT <ul><li> 5 ml 10x PBS </li><li> 45 ml H 2 O </li><li> 0,1% Tween 20 </li></ul> 20x SSC <ul><li> 175,3 g NaCl </li><li> 88,2 g Na-Citrat </li><li> in 800 ml H 2 O </li><li> pH-Wert auf 7, H 2 O auf 1 l </li></ul> 4x SSCT- <ul><li> 200 ml 20x SSC </li><li> 799 ml H 2 </sub&gt; O </li><li> 0,1% Tween 20 </li></ul> 0,1x SSC <ul><li> 5 ml 20x SSC </li><li> 995 ml H 2 O </li></ul> Hybridisierungsmischung (20 &amp; mgr; l; ab 11 modifiziert) <ul><li> 10 ul Formamid </li><li> 4 ul 50% Dextransulfat </li><li> 2 ul 20x SSC </li><li> 4 &amp; mgr; l H 2 O </li></ul> SBT 8 (10 ml) <ul><li> 2 ml 20x SSC </li><li> 0,01 g Rinderserumalbumin (BSA) </li><li> 10 ul Tween 20 </li><li> 7,9 ml H 2 O </li></ul> Blockierungslösung 8 (10 ml) <ul><li> 0,3 g BSA </li><li> 10 ul Tween 20 </li><li> 2 ml 20x SSC </li><li> 8 ml H 2 O </li></ul> Fixierlösung mit Paraformaldehyd (1 ml) <ul><li> 393,75 ul H 2 O (Wasser hinzufügen zuerst) </li><li> 450 ul Eisessig </li><li> 156,25 &amp; mgr; l 16% igem Paraformaldehyd </li></ul>

<ol>
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The authors declare that they have no competing financial or any other conflict of interest.

DNA ISH wird häufig verwendet, um spezifische Sequenzen auf Chromosomen kartieren. Wir haben ein einfaches Verfahren zur DNA ISH für hohe Kopienzahl, hetero Sequenzen optimiert beschrieben. Anstatt mit Waschungen in einem Formamid-Lösung, die eine Anforderung in anderen vorhandenen DNA ISH Protokolle ist, legen wir gewebe Dias direkt auf einen vorgeheizten Block an DNA zu denaturieren. Dieses Verfahren umgeht die Verwendung von großen Mengen an Formamid. Ein wichtiger Schritt für die Herstellung von klaren Hybridis...

DNA in situ Hybridisierung (ISH DNA) ist ein häufig verwendetes Verfahren zum Abbilden von Sequenzen an spezifischen Chromosomenregionen. Sonden an einzelne Kopie Regionen innerhalb Euchromatin kann durch eine Handvoll von Ansätzen, darunter Nick-Translation oder Endmarkierung langer DNA-Produkte 1,2 und den Einbau von deoxygenin (DIG) -attached Nukleotide und ihre Anerkennung durch eine Vielzahl von erzeugt werden Gruppe-konjugierte Antikörper 1-3. Visualisierung der euchromatischen Sequenzen in wenigen oder einzelnen Kopienzahl erfordert die Verwendung von entweder einzelne große Sonden mit hoher spezifischer Aktivität oder einen Cocktail aus mehreren, kleineren Sonden, die gemeinsam zu verbessern Signal. Im Gegensatz dazu hoch repetitive Sequenzen in heterochromatin gefunden, wie Satelliten-DNAs, sind leichter Ziele für DNA ISH weil sie existieren normalerweise als zehn bis Tausende von Wiederholungen im einzelnen Chromosomenregionen als Blöcke bekannt geclustert. Transposons können auchbei hohen Kopienzahlen an bestimmten chromosomalen Loci 2 gefunden. In diesen Fällen können einzelne Sonden mit geringer spezifischer Aktivität effektiv beschriften hetero Sequenzen aufgrund ihrer Hybridisierung an mehreren Standorten. Sonden an repetitive Sequenzen können im Handel als kurze Oligonukleotide (30-50 bp) synthetisiert und mit einer der mehreren verschiedenen fluoreszierenden Gruppen chemisch konjugiert. Mapping repetitiven Sequenzen im Heterochromatin durch Verwendung genom Sequenziertechnologien ist schwierig aufgrund der Herausforderungen im Gebäude Gerüste in stark repetitiven Satelliten Blöcke 4-6,7 gestoßen. Derzeit steht ISH als die effektivste Möglichkeit, die Zuordnung dieser Sequenzen am Unterchromosomenebene. Diese Strategie ist wichtig für die Zuordnung einer großen Anzahl von repetitiven Sequenzen, die von laufenden Genom und Transkriptom-Sequenzierung Studien aufgedeckt werden. Die Effizienz und einfache Zuordnung repetitiven Sequenzen auf Objektträger angebrachten Chromosomen würde gre werdenatly durch ein vereinfachtes Protokoll für DNA ISH verbessert. So können bereits vorhandene Protokolle für DNA ISH beinhalten mehrere Wäschen hybridisiert Gewebe in Formamid-Lösung 2,8, somit im wesentlichen auf die erforderliche Zeit für die Zuordnung von Sequenzen hinzufügen und auch große Mengen chemischen Abfalls für diese teuren Reagenz. Hier beschreiben wir eine geänderte DNA ISH Verfahren, das die Notwendigkeit für Formamid Wäschen umgeht und setzt grundlegende Laborgeräten und Reagenzien. Dieses Verfahren wurde ursprünglich für die rasche Kartierung hoch repetitive DNA-Sequenzen in heterochromatischen Regionen Drosophila Larvenneuroblasten mit handels synthetisierte Oligonukleotide, die mit Fluoreszenzfarbstoffe konjugiert sind entworfen. Allerdings funktioniert diese Methode auch für die Abbildung repetitiven Sequenzen durch den Einsatz größerer Sonden durch andere Mittel 9,10 und über mehrere verschiedene Gewebe und Chromosomentypen synthetisiert. Zusätzlich kann dieses Verfahren verwendet werden, um euchromatic Sequenzen mithilfe länger oder multip abzubildenle, kurze Sonden innerhalb der euchromatischen Sequenz von Interesse.

<table><tbody><tr><td>Poly-L-lysine coated slides (regular slides also can be used)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrafine tweezers (5 gauge)</td><td>Dumont</td><td></td><td></td></tr><tr><td>22 x 22 mm cover slips</td><td>Fisher</td><td></td><td>Sigmacote-treated by immersion for 15 sec, blotting dry, and wiping away all traces of Sigmacote so that cover slip is clear</td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filter paper</td><td></td><td></td><td>75 - 150 mm</td></tr><tr><td>Paraffin wax paper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heat block with thermometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dry incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Razor blades</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humidity chamber</td><td></td><td></td><td>empty pipette tip box or Tupperware, lined with moistened paper towels or Kimwipes</td></tr><tr><td>Coplin jars</td><td></td><td></td><td>with slide grooves</td></tr><tr><td>Aluminum foil</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipettes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml microfuge tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nail polish</td><td></td><td></td><td>clear or colored</td></tr><tr><td>P20 micropipette and plastic tips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paperclips</td><td></td><td></td><td>20 - 25 standard metal paperclips linked to form a chain</td></tr><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>16% EM grade paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Reagents</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% Ethanol, chemical grade</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Commercially synthesized, fluorescently labeled oligos</td></tr><tr><td>Long biotinylated probe</td><td>Invitrogen; Alternative steps 2.7.1-2.7.3</td><td></td><td>&lt;em&gt;e.g.,&lt;/em&gt; nick translated and biotinylated with BioNick from Invitrogen</td></tr><tr><td>Rhodamine-Avidin</td><td>Roche; Alternative steps 2.7.1-2.7.3</td><td></td><td>for detection of long biotinylated probe</td></tr><tr><td>Hybridization buffer</td><td>Recipe above</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4x SSCT</td><td>Recipe above</td><td></td><td>saline-sodium citrate + Tween</td></tr><tr><td>0.1x SSC</td><td>Recipe above</td><td></td><td>saline-sodium citrate</td></tr><tr><td>Blocking solution</td><td>Recipe above</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SBT</td><td>Recipe above</td><td></td><td>SSC, bovine serum albumin, Tween</td></tr><tr><td>1x PBT</td><td>Recipe above</td><td></td><td>phosphate-buffered saline + Tween</td></tr><tr><td>1x PBS</td><td></td><td></td><td>phosphate-buffered saline</td></tr><tr><td>Hypotonic solution</td><td></td><td></td><td>0.5% sodium citrate in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield mounting medium with DAPI</td><td>Vector laboratories</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

simple method for fluorescence dna in situ hybridization to squashed chromosomes

DNA in situ Hybridisierung (ISH DNA) ist ein häufig verwendetes Verfahren zum Abbilden von Sequenzen an spezifischen Chromosomenregionen. Dieser Ansatz ist besonders effektiv bei der Kartierung hoch repetitive Sequenzen an heterochromatischen Regionen, in denen Rechenansätze gegen prohibitiv Herausforderungen. Hier beschreiben wir eine optimierte Protokoll für DNA ISH, die Formamid wäscht die Standardschritte in anderen DNA ISH Protokolle umgeht. Unser Protokoll zur Hybridisierung mit kurzen Einzelstrang-DNA-Sonden, die Fluoreszenzfarbstoffe, die effektiv zu markieren repetitive DNA-Sequenzen in hetero chromosomalen Regionen in einer Anzahl verschiedener Insektengewebetypen durch optimiert. Jedoch können Anwendungen erweitert werden, um mit größeren Sonden und Visualisierung von Einzelkopie (nicht-wiederkehrende) DNA-Sequenzen zu verwenden. Wir zeigen, diese Methode durch die Abbildung verschiedene repetitive Sequenzen zu gequetscht Chromosomen von Drosophila melanogaster Nervenzellen und Nasoniavitripennis Spermatozyten. Wir zeigen Hybridisierungsmuster für beide klein, kommerziell synthetisiert Sonden und für eine größere Sonde zum Vergleich. Bei diesem Verfahren wird einfach Laborbedarf und Reagenzien, und ist ideal für Ermittler, die wenig Erfahrung mit der Durchführung DNA ISH haben.

Um dieses Verfahren zu demonstrieren, hybridisierten wir eine Reihe von kleinen kommerziell synthetisiert Oligos, die chemisch mit Fluoreszenz-Konjugate (Abbildung 2) und einem längeren biotinylierte Sonde verändert wurden (durch Nick-Translation eines PCR-Produktes hergestellt; 2B), um die Chromosomen aus verschiedenen Gewebe Typen (siehe Tabelle 1). Die Zielsequenzen enthalten Satelliten-Wiederholungen in pericentromeric (Heterochromatin) Regionen der mitotischen Ch...

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Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

Einfache Methode zur Fluoreszenz DNA<em&gt; In-situ-</em&gt; Die Hybridisierung an Squashed Chromosomen

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

simple-method-for-fluorescence-dna-situ-hybridization-to-squashed

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

18.0K Aufrufe.  University of Rochester. Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

Serie: Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect and count individual RNA molecules. Complementary to deep sequencing-based methods, smFISH provides information about the cell-to-cell variation in transcript abundance and the subcellular localization of a given RNA. Recently, we have used smFISH to study the expression of the gene&#160;NDC80&#160;during meiosis in budding yeast, in which two transcript isoforms exist and the short transcript isoform has its entire sequence shared with the long isoform. To confidently identify each transcript isoform, we optimized known smFISH protocols and obtained high consistency and quality of smFISH data for the samples acquired during budding yeast meiosis. Here, we describe this optimized protocol, the criteria that we use to determine whether high quality of smFISH data is obtained, and some tips for implementing this protocol in&#160;other yeast strains and growth conditions.

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

This single molecule fluorescence in situ hybridization protocol is optimized to quantify the number of RNA molecules in budding yeast during vegetative growth and meiosis.

Einzigen Molekül Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (SmFISH) Analyse in Knospen Hefe vegetativen Wachstums und Meiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Forschung

Genetik

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. One important application of this method is the development of high-quality physical maps useful for improving the genome assemblies for various organisms. The natural banding pattern of polytene and mitotic chromosomes provides guidance for the precise ordering and orientation of the genomic supercontigs. Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, a well-established chromosome-based mapping technique has been developed only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes 1. As a result of genome mapping efforts, 88% of the An. gambiae genome has been placed to precise chromosome positions 2,3 . Two other mosquito genera, Aedes and Culex, have poorly polytenized chromosomes because of significant overrepresentation of transposable elements in their genomes 4, 5, 6. Only 31 and 9% of the genomic supercontings have been assigned without order or orientation to chromosomes of Ae. aegypti 7 and Cx. quinquefasciatus 8, respectively. Mitotic chromosome preparation for these two species had previously been limited to brain ganglia and cell lines. However, chromosome slides prepared from the brain ganglia of mosquitoes usually contain low numbers of metaphase plates 9. Also, although a FISH technique has been developed for mitotic chromosomes from a cell line of Ae. aegypti 10, the accumulation of multiple chromosomal rearrangements in cell line chromosomes 11 makes them useless for genome mapping. Here we describe a simple, robust technique for obtaining high-quality mitotic chromosome preparations from imaginal discs (IDs) of 4th instar larvae which can be used for all three genera of mosquitoes. A standard FISH protocol 12 is optimized for using BAC clones of genomic DNA as a probe on mitotic chromosomes of Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus, and for utilizing an intergenic spacer (IGS) region of ribosomal DNA (rDNA) as a probe on An. gambiae chromosomes. In addition to physical mapping, the developed technique can be applied to population cytogenetics and chromosome taxonomy/systematics of mosquitoes and other insect groups.

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, physical genome mapping techniques were established only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes. For the genera of Aedes and Culex, however, cytogenetic mapping remains challenging because of the poor quality of polytene chromosomes. Here we present a universal protocol for obtaining high-quality preparations of mitotic chromosomes and an optimized FISH protocol for all three genera of mosquitoes.

Fluoreszierend<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung auf mitotischen Chromosomen der Moskitos

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

Immunologie und Infektion

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological advantages provided by the giant salivary gland polytene chromosomes of third instar larvae.  In this tissue the chromosomes undergo many rounds of replication in the absence of cell division giving rise to approximately 1000 copies.  The DNA remains aligned after each replicative cycle resulting in greatly enlarged chromosomes that provide a unique opportunity to correlate chromatin morphology with the localization of specific proteins.  Consequently, there has been a high level of interest in defining the epigenetic modifications present at different genes and at different stages of the transcription process. An important tool for such studies is the labeling of polytene chromosomes with antibodies to the enzyme, transcription factor, or histone modification of interest. This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

Vorbereitung von Drosophila Polytäne Chromosome Kürbisse für Antikörpermarkierung

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological ...

Biologie

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological processes. In particular, appropriate regulation of calcium activity patterns during embryogenesis is necessary for many aspects of vertebrate neural development, including proper neural tube closure, synaptogenesis, and neurotransmitter phenotype specification. While the observation that calcium activity patterns can differ in both frequency and amplitude suggests a compelling mechanism by which these fluxes might transmit encoded signals to downstream effectors and regulate gene expression, existing population-level approaches have lacked the precision necessary to further explore this possibility. Furthermore, these approaches limit studies of the role of cell-cell interactions by precluding the ability to assay the state of neuronal determination in the absence of cell-cell contact. Therefore, we have established an experimental workflow that pairs time-lapse calcium imaging of dissociated neuronal explants with a fluorescence in situ hybridization assay, allowing the unambiguous correlation of calcium activity pattern with molecular phenotype on a single-cell level. We were successfully able to use this approach to distinguish and characterize specific calcium activity patterns associated with differentiating neural cells and neural progenitor cells, respectively; beyond this, however, the experimental framework described in this article could be readily adapted to investigate correlations between any time-series activity profile and expression of a gene or genes of interest.

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

We present a two-part protocol that combines fluorescent calcium imaging with in situ hybridization, allowing the experimenter to correlate patterns of calcium activity with gene expression profiles on a single-cell level.

Fluoreszierende Calcium-Bildgebung und anschließende In-Situ-Hybridisierung zur neuronalen Vorläufercharakterisierung bei Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Entwicklungsbiologie

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

High-Throughput-Physikalische Kartierung von Chromosomen unter Verwendung von Automated<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

Chromosome Replizieren Timing mit Fluorescent Kombiniert<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA FISH) represents the most direct way to visualize the location of gene loci, chromosomal sub-regions or entire territories in individual cells. This type of analysis provides insight into the global architecture of the nucleus as well as the behavior of specific genomic loci and regions within the nuclear space. Immunofluorescence, on the other hand, permits the detection of nuclear proteins (modified histones, histone variants and modifiers, transcription machinery and factors, nuclear sub-compartments, etc). The major challenge in combining immunofluorescence and 3D DNA FISH is, on the one hand to preserve the epitope detected by the antibody as well as the 3D architecture of the nucleus, and on the other hand, to allow the penetration of the DNA probe to detect gene loci or chromosome territories 1-5. Here we provide a protocol that combines visualization of chromatin modifications with genomic loci in 3D preserved nuclei.

Here we describe a protocol for simultaneous detection of histone modifications by immunofluorescence and DNA sequences by DNA FISH followed by 3D microscopy and analyses (3D immuno-DNA FISH).

Kombiniert Immunfluoreszenz und DNA FISH auf 3D erhaltene Interphase Nuclei, um Änderungen in 3D Nuclear Organization Study

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

3D DNA FISH has become a major tool for analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations of the technique have been published. In this article we describe a protocol which has been optimized for robustness, reproducibility, and ease of use. Brightly fluorescent directly labeled probes are generated by nick-translation with amino-allyldUTP followed by chemical coupling of the dye. 3D DNA FISH is performed using a freeze-thaw step for cell permeabilization and a heating step for simultaneous denaturation of probe and nuclear DNA. The protocol is applicable to a range of cell types and a variety of probes (BACs, plasmids, fosmids, or Whole Chromosome Paints) and allows for high-throughput automated imaging. With this method we routinely investigate nuclear localization of up to three chromosomal regions.

We describe a robust and versatile protocol for analyzing nuclear architecture by 3D DNA FISH using directly labeled fluorescent probes.

Robust 3D DNA FISH Mit Direkt markierten Sonden

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci

The genome is associated with several structures inside cell nuclei, in order to regulate its activity and anchor it in specific locations. These structures are collectively known as the nucleoskeleton and include the nuclear lamina, the nucleoli, and nuclear bodies. Although many variants of fluorescence in situ hybridization (FISH) exist to study the genome and its organization, these are often limited by resolution and provide insufficient information on the genome&#39;s association with nuclear structures. The DNA halo method uses high salt concentrations and nonionic detergents to generate DNA loops that remain anchored to structures within nuclei through attachment regions within the genome. Here, soluble nuclear proteins, such as histones, lipids, and DNA not tightly bound to the nuclear matrix, are extracted. This leads to the formation of a halo of unattached DNA surrounding a residual nucleus which itself contains DNA closely associated with internal nuclear structures and extraction-resistant proteins. These extended DNA strands enable increased resolution and can facilitate physical mapping. In combination with FISH, this method has the added advantage of studying genomic interactions with all the structures that the genome is anchored by. This technique, termed HALO-FISH, is highly versatile whereby DNA halos can be coupled with nucleic acid probes to reveal gene loci, whole chromosomes, alpha satellite, telomeres and even RNA. This technique provides an insight into nuclear organization and function in normal&#160;cells and in disease progression such as with cancer.

Combining DNA halo preparations with fluorescence in situ hybridization enables high-resolution analysis of genomic interactions with the nucleoskeleton. Attached genome leads to hybridized fluorescent signals located within the residual extracted nuclei, whereas non-attached genome is in the halo of DNA surrounding the residual nuclei.

Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung auf DNA-Halo-Präparaten zur Aufdeckung ganzer Chromosomen, Telomere und Genorte

The genome is associated with several structures inside cell nuclei, in order to regulate its activity and anchor it in specific locations. These ...

HCR-DNA FISH: A Fluorescence In Situ Hybridization Technique to Detect Viral DNA in Infected Cells

Source: Wei Liu&#160;et al., <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/58950"> Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection</a>, J. Vis. Exp. (2019).
In this video, the cells infected with MCPyV virions were subjected to in situ hybridization chain reaction to detect MCPyV specific genomes. Further, the DNA-HCR technique was combined with FISH to visualize the MCPyV DNA in infected human skin cells.

HCR-DNA FISH: Eine Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierungstechnik zum Nachweis viraler DNA in infizierten Zellen

Source: Wei Liu&#160;et al.,  Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection, J. Vis. Exp. (2019).
In this video, the cells infected with MCPyV virions ...

Einfache Methode zur Fluoreszenz DNA

Zusammenfassung

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