The authors thank Bryan T. Vinyard of the USDA, Agricultural Research Service, Henry A. Wallace Beltsville Agricultural Research Center, Biometrical Consulting Service, Beltsville, MD for statistical analyses. This work was supported in part by a grant to J.C.D. from the Deployed War Fighter Protection (DWFP) Research Program funded by the Department of Defense through the Armed Forces Pest Management Board (AFPMB).

1. Aufzucht Ae. aegypti Erwachsene <ol><li> Hatch Eier in etwa ¾ Zoll Wasser in flache Schale. Überbelegung wird die Größe des Erwachsenen zu reduzieren. </li><li> Rück Larven bei 25 ° C (12-hl: 12-HD) und führen mit Grundfischfutter. HINWEIS: Überfütterung kann die Überlebensraten zu reduzieren. </li><li> Entfernen Puppen einzeln von Pasteur-Pipette täglich und Transfer in Plastikschalen (9 cm x 5,5 cm) in kleinen Contain Eimer mit feinmaschigen Deckel und schafft so 24 Stunden Altersgruppen. </li><li> Feed erwachsenen Mücken 10% Saccharose-Lösung mit Wattebausch auf den Bildschirm Wände eines Käfiggehäuse platziert die Mücken in einer Klimakammer bei 27 ° C und 70% relativer Luftfeuchtigkeit unter dem gleichen Photoperiode als Larven. </li><li> Für Elektrophysiologie, verwenden 5-10 Tage alten Tieren. Im Allgemeinen werden größere Tiere zu besseren Ergebnissen führen. Für die RNA-Isolierung, verwenden Sie Tiere, die in einem einzigen 24-Stunden-Alter Gruppierung in der 5-10 Tage alten Reihe sind. </li></ol><ol><li> Bestimmen eines geeigneten Elektrolytkonzentration (zB 1-10 mM), die minimale Aktivität von ausgewählten sensorischen Neuronen auslöst. 10 mM NaCl und 1 mM KCl, vernünftig sind Elektrolyte zur Baseline-Aktivität zu testen, wenn zu Beginn eines Experiments. </li><li> Löse jede Versuchschemikalie geeigneten Lösungsmittel (wenn nicht Wasser, mit Ethanol oder DMSO), die wenig oder keine Wirkung auf Spike-Aktivität im Vergleich zu allein Elektrolyten. Endkonzentrationen von 10% Ethanol oder 1% DMSO, vernünftig sind Ausgangskonzentrationen. </li><li> Wählen Sie die entsprechende (zB Chinin für bitter oder Saccharose süß) Steuer Chemikalien, die gut beschrieben sind Fütterung Abschreckung oder Stimulanzien in Insekten. </li></ol> 3. Elektrophysiologie (Spitze Aufnahme 8, Abbildung 1) <ol><li> Form-Glaselektroden durch mechanisches Ziehen von Glaskapillaren. Optimieren Wärme und ziehen Sie die Einstellungen auf Glas zu ziehen, um entsprechend geformte recordi bildenng Elektroden. Vorsichtig abbrechen Ende Glaselektrode mit einer Pinzette unter einem Binokular zu Elektrodenspitze Öffnung, die breit genug ist, um die Ziel Sensillum Umschlag, aber klein genug, um den Kontakt mit benachbarten Strukturen zu vermeiden erstellen. </li><li> Unter dem Mikroskop visuell durch Morphologie identifizieren und positionieren Sie den Ziel Sensillen / Sensillum, um die Wiederholbarkeit der Spitze Aufnahme zu gewährleisten. Prep Tiere freien Zugang zu Sensillen von Winkel Elektroden Eintrag kann. </li><li> Kalte Anesthetize erwachsenen Insekten in Gefrierschrank bei -20 ° C. Schäden an peripheren Neuronen durch übermäßige Kälte zu vermeiden. Schneiden Sie schmale Streifen Klebeband mit Rasierklinge auf Glasobjektträger. Immobilisieren ganze Insekt auf einem Glasobjektträger mit schmalen Streifen. </li><li> Legen Sie eine chemisch geschärft Wolframdraht in die dorsalen Thorax oder Augen als indifferent (Masse) Elektrode dienen. </li><li> Füllen Glaselektrode in Schritt 3.1 mit einer anregenden Lösung von Interesse gemacht. Mit einem einge Spritze, füllen KappeIllary aus zog Ende stumpfen Ende. Streichen Sie alle Luftblasen, halten zog Ende nach unten. Legen Sie eine Silberdraht (chloriding optional) in die Glaselektrode in Schritt 3.1, um als Aufnahme und Stimulationselektrode zu dienen. </li><li> Schließen Elektroden an einen Vorverstärker, der für Aufnahmen von Kontakt chemorezeptiven Sensillen von Insekten ausgelegt ist. Dieser Vorverstärker (300 Hz-3 kHz-Bandpassfilter) wird die Einschwingzeit auf neuronale Aktivität so nah wie möglich Einführung Reiz einzufangen reduzieren. Sammeln, speichern und elektrische Signale mit einem Mikrocomputer mit Spike-Recording-Software ausgestattet analysieren. HINWEIS: Die Erdung des Aufnahme-Setup richtig kann Signal-zu-Rausch-Verhältnis deutlich verbessern. </li><li> Stimulieren Sensillen mit einer Kontrolllösung (Elektrolyt nur), um die Funktionalität zu gewährleisten. Graf Spikes ab 200 msec nach dem Reizartefakt für alle Zubereitungen. </li><li> Zufälliger Reihenfolge Testchemikalien für alle Experimente, außer Dosis-Wirkungs-Studienzum Vorspannen zu beseitigen. Für Dosis-Wirkungs-Studien, aufzudecken sensilla steigenden Konzentrationen der Versuchschemikalie. Warten Sie mindestens 3 Minuten zwischen Stimulationen eine ausreichende Erholung sicherzustellen. HINWEIS: Diese Anforderung kann je nach Insekten und Sensillen variieren. Threshold ist als die Konzentration, für die Standardfehler nicht mit der Standardfehler für die geringste untersuchte Konzentration lappen definiert. </li></ol> 4. RNA Isolierung und Sequenzierung (Figur 2) <ol><li> Bereiten Sie die dicht schließende RNase-freien Stößel durch Abkühlung auf Trockeneis vor Gewebe disruption.Prepare Begleit RNase-freies Stößel, der Schnappdeckel Rohre eng anliegen. Halten Sammelröhrchen, wenn aktiv sezieren, um überschüssige Kondensation zu vermeiden geschlossen. </li><li> Mit gefiltert Sauger, legen 30 bis 40 Kalt betäubt Mücken (15 sec in -20 ° C Tiefkühlschrank) auf Kältestufe und Art von Sex. Platz Tieren dorsalen Seite nach unten, Greifen Flügel Geschmack Anhängsel nicht beschädigen.</li><li> Mit zwei Paaren von feinen Pinzette, sezieren gepaarten labella oder tarsi von Männern oder Frauen unter einem Binokular und Einbeziehung der angrenzenden Gewebe zu begrenzen. HINWEIS: 500 gepaart labella ergibt etwa 800-1.000 ng Gesamt-mRNA. 400 Einzel tarsi (5 Segmente jeweils) zu erhalten 1.200-1.800 ng Gesamt-mRNA. </li><li> Mit einem Paar keuchenden-Pinzette, leicht begreifen Mücke Rüssel proximal labella auszusetzen inneren Mandrins. Mit anderen Paar der Sammlung-Pinzette entfernen labella und fügen Gewebe Seite kalten Sammelröhrchen. </li><li> Mit einer Pinzette, leicht begreifen Moskito Bein an der Kreuzung von Schienbein und Fußwurzelknochen ersten Segment. Mit anderen Pinzette, entfernen tarsi und fügen Gewebe Seite kalten Sammelröhrchen. Hinweis: Beachten Sie die Zelltypen an der Schnittstelle zwischen erwünschten und unerwünschten Gewebe. Während es wichtig ist, die Aufnahme benachbarte Gewebe zu begrenzen, ist es ebenso wichtig, keine Abschnitte von gewünschten Gewebe wegzulassen. Der final Probe muss genau darzustellen das ganze Organ von Interesse. Erstellen Sie eine genaue Grenze mit den Greifzangen, dass Sammelzange präzise durch Schaben oder greifen nur das gewünschte Gewebe zu befreien. </li><li> Von Zeit zu Zeit, Spin-down Sammelröhrchen kurz in 0 ° C Zentrifuge bei 9000 xg, um Gewebe auf dem Boden des Röhrchens zu halten. Wenn sich Feuchtigkeit sammelt sich im Sammelröhrchen beim Präparieren, fügen Sie 50 ul kaltem Trizolreagenz gesammelte Gewebe zu bedecken. </li><li> Mit Anti-Schmutz Labormarker, eindeutig zu kennzeichnen ein RNase-freies 1,5 ml Schnappdeckel Rohr für jeden Gewebetyp für die Sammlung. Mit 1,5-ml-Röhrchen Rack und flüssigem Stickstoff gefrier dann schleifen Gewebe zu feinem Pulver (feine Stücke, wenn in Trizol). Wiederholen Sie einmal. Bringen Gesamtvolumen von 1 ml Trizol zu resuspendieren und Grundgewebe durch Vortexen. </li><li> Geben Sie 200 ul Chloroform und gründlich mischen. Nach 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren in Zentrifuge bei 4 ° C und 11.000 × g für 15 min. Vorsichtighinzuzufügen wässrige Schicht direkt an eine genomische DNA Filtersäule. Spin down bei 11.000 x g für 5 min. Hinzufügen gleichen Volumen RNase-free 70% Ethanol Durchflußrichtung und Mischen mit einer Pipette. Übertragen Flüssigkeit zu einer RNA Sammlung Spalte und weiter RNA-Extraktion gemäß den Anweisungen. </li><li> Messen und bewerten die Reinheit der Gesamt-RNA auf einem Präzisions-Spektralphotometer und fahren mit jedem Standard-RNA-Sequenzierungsmethode. </li></ol> 5. Quantitative RT-PCR-Validierung von RNA Sequencing (Figur 3) <ol><li> Auszuwählen, wie viele Gene wie möglich, um die relative Genexpression über einen Dynamikbereich zu vergleichen, die beide in vorhergesagten Sequenz Fülle und vermuteten chemosensory Genfunktion. </li><li> Design-Primerpaare für jedes Zielgen eine bestimmte 100-180 Basenpaar-PCR-Produkt zu verstärken. Ausschließen unspezifische gDNA Verstärkung durch, die mindestens ein Primer pro Satz umfasst ein Intron-Grenze. Alternativ können Sie DNase-Behandlung, um genomische Kontamination zu verringern. </li><li> SammelnInsektengewebe wie in vorhergehenden Abschnitt beschrieben. Berechnen Sie, wie viel Gewebe ist erforderlich, um genügend RNA bieten alle qRT-PCR-Reaktionen durchzuführen. HINWEIS: Biologische dreifacher Ausfertigung und technische dreifach Reaktionen maximale Vertrauen in Ergebnisse zu liefern. </li><li> Berechnen relativer Genquantifizierung als X Ziel - (Ct [target] -Ct [Referenz]) für jedes Zielgen und Durchschnitt für jede Wiederholung, sowohl biologische und technische. Verwenden Housekeeping-Gen (en) Ct-Werte zwischen biologischen Replikaten zu normalisieren und die Y-Achse Skala im Vergleich der relativen Expression verankern. </li><li> Beurteilen Sie die Ähnlichkeit der RNA-seq und qRT-PCR Datensätze mit dem Regressionsbasis, Bootstrap Gleichwertigkeit Verfahren 9, iterativ angewendet, um die Daten aus jedem Gewebe. HINWEIS: Dieses Verfahren identifiziert das kleinste &quot;Ähnlichkeitsregion&quot;, die sich um die beobachtete RNA-seq und qRT-PCR-Daten konstruiert werden können, und lassen Sie die relative Genexpression durch qRT- gemessenPCR als statistisch äquivalent zur Messung der relativen Genexpression durch RNA-seq werden. </li></ol>

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</ol>

The authors have nothing to disclose.

Die größte Herausforderung bei der Aufnahme von Aktionspotentialen von Geschmacks Sensillen ist zu entscheiden, welche Antworten sind &quot;normal&quot;. Bei der Verwendung von einzelnen Geschmacks Sensillum Spitze der Aufnahme das erste Mal für eine bestimmte Insektenarten, die Gesamtzahl und die Empfindlichkeiten der Geschmacksrezeptorzellen (KNS) sind wahrscheinlich unbekannt. Viele vorläufigen Aufzeichnungen werden zunächst erforderlich, den Bereich und die Konzentrationen von Chemikalien zu testen, zu entschei...

Verbindungen wie DEET, Picaridin, Citronellal und IR3535 wurde gezeigt, dass Mücken, einschließlich der wichtigen Krankheitsüberträger Aedes aegypti 1,2 wirksam abwehren. Wir erfassen Aktionspotentiale aus sensorischen Neuronen mit bestimmten Geschmacks Sensillen verbunden, um die Zellen mit Moskitoabweisung beteiligt zu bestimmen. Mit nachgeschaltetem Sequenzierung der exprimierten Gene in diesen Geweben gekoppelt ist, können wir die Gene wahrscheinlich Vermittlung der Reaktionen dieser Zellen, um neue Verbindungen zu verbessern abweisende Fähigkeiten Bildschirm identifizieren. RNA-seq ist ein mächtiges Werkzeug, schnell zum Standard für die Verfolgung von zeitlichen und räumlichen Veränderungen in der Genexpression. RNA-seq-Analysen von Insekten chemosensory Anhängsel und Organe wurden zur molekularen Rezeptoren in verschiedenen Insektenarten 3-5 aufzudecken, stark von herkömmlichen PCR-basierte Suche Gen Verbesserung von Gen 6. Insekten stellen die verschiedensten Tierklasse, vor,senting viele Möglichkeiten die Verbindung zwischen Genen und einzigartige Phänotypen zu studieren. RNA-seq-Technologie kann auf jedem lebenden Insektengewebe eingesetzt werden. Ebenso können elektrophysiologische Ableitung von Sinneszellen im uniporous Geschmacks Sensillen in vielen verschiedenen Insektenarten erreicht werden. Die Paarung dieser beiden Techniken ermöglicht es den Forschern, die in einem beobachteten chemosensory Phänotyp beteiligt Satz Gene einzugrenzen. Verschiedene Arten werden spezifische Herausforderungen stellen, kann aber die Verbindung zwischen chemosensorischen Rezeptorgene und einer chemosensorischen Anpassung zu informieren. Die Größe und die Morphologie der chemosensorischen Sensillen ist variabel und kann bei der Aufnahme von Aktionspotentialen, um Lärm zu reduzieren und identifizieren reproduzierbare Signale erfordern eine umfangreiche Fehlersuche. Dissektionen chemosensorischer Organen kann trivial oder schwierige und zeitaufwendig, in Abhängigkeit von der Morphologie und Größe des Insekts. Rückgewinnung von hochwertigen RNA kann einige Fehlersuche sowie erfordern, wie beispielsweise die Vermeidung bestimmter Pigmente inGewebesammlung. Zwar zeigen die Auswirkungen der abweisende Verbindungen durch Verhaltensversuche ist direkt und informativ ist dieser Ansatz Zeit intensive und breit in Bezug auf Wirkmechanismus. Elektrophysiologie in Verbindung mit RNA-seq ermöglicht eine spezifische Analysen dessen, was treibt Vermeidungsverhalten in Insekten. Sobald das &quot;Toolkit&quot; von chemischen Diskriminierung in einer Insektenart identifiziert worden, um genauere Versuche verbessern bekannten Repellents sind möglich. Rezeptoren und assoziierten Proteinen in Sinneszellen für diese Verhaltensweisen verantwortlich sind, können heterolog für direkte chemische Screening ausgedrückt werden. Weiterhin können molekulare Modellierung vorherzusagen, welche Chemikalien starken Antworten von diesen Rezeptoren 7 zu entlocken. Die Momentaufnahme aller aktiven Gene in einer engen Gruppe von chemosensorischen Gewebe können auch nützlich bei der Identifizierung von ähnlichen Genen in anderen Spezies. Mit Sequenzhomologie und Ausdruck similarities Forscher können Sätze von molekularen Rezeptoren wahrscheinlich Vermittlung antwortet Repellentien, die breitenwirksame auf Insekten zu bilden. Wir präsentieren den folgenden Protokoll, um Forscher in die Dekonstruktion Insekten chemosensory Wege zu helfen und mehr zu überreden, in die Neuroethologie von nicht-Modell und wirtschaftlich wichtigen Insekten zu vertiefen.

<table><tbody><tr><td>Glass capillary</td><td>A-M Systems</td><td>628000</td><td>Standard, 1.5 mm X 0.86 mm, 4&quot;</td></tr><tr><td>Silver wire</td><td>A-M Systems</td><td>7875</td><td>.015&quot; bare</td></tr><tr><td>Tungsten wire</td><td>Alfa Products</td><td>369</td><td>0.127 mm diameter</td></tr><tr><td>Fine forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252</td><td>#5SF Inox</td></tr><tr><td>Refridgerated stage</td><td>BioQuip Products</td><td>1429</td><td>Chill Table</td></tr><tr><td>Preamplifier</td><td>Syntech</td><td>Taste Probe</td><td>preamplifier</td></tr><tr><td>Software for electrophysiology</td><td>Syntech</td><td>Autospike</td><td>software for electrophysiology</td></tr><tr><td>TetraMin fish food</td><td>Tetra</td><td>Tropical fish food granules</td><td>fish food ground to fine powder</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td>RNA isolation reagent</td></tr><tr><td>RNeasy Plus Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74136</td><td>includes gDNA eliminator and RNeasy spin columns</td></tr><tr><td>Nanodrop spectrophotometer</td><td>Nano Drop Products</td><td>ND-1000</td><td>tabletop spectrometer</td></tr><tr><td>R statistics</td><td>freeware (created by Robert Gentleman and Ross Ihaka)</td><td>www.r-project.org</td><td>Use the lm function of the stats package and the equiv.boot function of the equivalence package in the R computing environment.</td></tr><tr><td>1.5 ml tube rack</td><td>Evergreen</td><td>240-6388-030</td><td>Pour liquid nitrogen into a few empty wells to freeze and grind tissue.</td></tr><tr><td>1.5 ml collection tubes with pestle</td><td>Grainger</td><td>6HAX6</td><td>RNase free</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>11178160</td><td>Spin down frozen tissue to keep at bottom of 1.5 ml tube.</td></tr><tr><td>Primer-BLAST Primer Designing tool</td><td>NCBI</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

physiological recordings and rna sequencing of the gustatory appendages of the yellow-fever mosquito aedes aegypti

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of these disease vectors. We have recently identified a bitter sensing neuron in the labellum of female Aedes aegypti that responds to DEET and other repellents, as well as bitter quinine, through direct electrophysiological investigation. These gustatory receptor neuron responses prompted our sequencing of total mRNA from both male and female labella and tarsi samples to elucidate the putative chemoreception genes expressed in these contact chemoreception tissues. Samples of tarsi were divided into pro-, meso- and metathoracic subtypes for both sexes. We then validated our dataset by conducting qRT-PCR on the same tissue samples and used statistical methods to compare results between the two methods. Studies addressing molecular function may now target specific genes to determine those involved in repellent perception by mosquitoes. These receptor pathways may be used to screen novel repellents towards disruption of host-seeking behavior to curb the spread of harmful viruses.

Die Trace-Aufzeichnungen von Aktionspotentialen von Ae. aegypti Geschmacks Sensillen (Abbildung 1) zeigen die Wirksamkeit der direkten Stimulation mit einer Reihe von Chemikalien. Diese Technik kann verwendet werden, um Antworten auf jede Stimulierung chemischen durch Zählen Spitzen einer gegebenen Amplitude und Dauer über einen angemessenen Zeitraum (im allgemeinen weniger als 500 ms) zu quantifizieren. Trace-Aufzeichnungen müssen unter einem gegebenen Satz von experimentellen Bedingungen l...

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Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Mit beiden Methoden, die Genexpression in den großen Geschmacks Anhängsel Aedes aegypti schätzen, haben wir den Satz von Genen, die mutmaßlich zugrunde liegenden neuronalen Antworten zu bitter und abstoßend Verbindungen identifiziert, wie durch elektrophysiologische Untersuchung bestimmt.

Physiologische Aufnahmen und RNA-Sequenzierung der gustatorischen Anhangsgebilde der Gelbfieber-Moskito-<em&gt; Aedes aegypti</em

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

physiological-recordings-rna-sequencing-gustatory-appendages-yellow

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Research

JoVE Journal

Biology

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

8.0K Aufrufe.  United States Department of Agriculture.  Mit beiden Methoden, die Genexpression in den großen Geschmacks Anhängsel Aedes aegypti schätzen, haben wir den Satz von Genen, die mutmaßlich zugrunde liegenden neuronalen Antworten zu bitter und abstoßend Verbindungen identifiziert, wie durch elektrophysiologische Untersuchung bestimmt. 

Serie: Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Einzel Sensillum Recordings in der Insekten Drosophila melanogaster Und Anopheles gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Forschung

Neurowissenschaften

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol demonstrates dissection techniques for removal of the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes. 



The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for vector pathogens like Plasmodium falciparum and the dengue virus. This video demonstrates the dissection techniques for removing the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes.

Dissection der Dünndarm-und Speicheldrüsen von Ae. aegypti Moskitos

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Biologie

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Mosquitoes are vectors for a number of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites and filarial worms. Laboratories are investigating anti-pathogen components of the innate immune system in disease vector species in the hopes of generating transgenic mosquitoes that are refractory to such pathogens1, 2. The innate immune system of mosquitoes consists of several lines of defense 3. Pathogens that manage to escape the barrier imposed by the epithelium-lined mosquito midgut 4 enter the hemolymph and encounter circulating hemocytes, important cellular components that encapsulate and engulf pathogens 5, 6. Researchers have not found evidence for hematopoietic tissues in mosquitoes and current evidence suggests that the number of hemocytes is fixed at adult emergence and numbers may actually decline as the mosquito ages 7. The ability to properly collect and identify hemocytes from medically important insects is an essential step for studies in cellular immunity. However, the small size of mosquitoes and the limited volume of hemolymph pose a challenge to collecting immune cells. 
Two established methods for collecting mosquito hemocytes include expulsion of hemolymph from a cut proboscis 8, and volume displacement (perfusion), in which saline is injected into the membranous necklike region between the head and thorax (i.e., cervix) and the perfused hemolymph is collected from a torn opening in a distal region of the abdomen 9, 10. These techniques, however, are limited by low recovery of hemocytes and possible contamination by fat body cells, respectively 11. More recently a method referred to as high injection/recovery improved recovery of immunocytes by use of anticoagulant buffers while reducing levels of contaminating scales and internal tissues 11. While that method allows for an improved method of collecting and maintaining hemocytes for primary culture, it entails a number of injection and collecting steps that are not necessary if the downstream goal is to collect, fix and stain hemocytes for diagnostics. Here, we demonstrate our method of collecting mosquito hemolymph that combines the simplicity of perfusion, using anticoagulant buffers in place of saline solution, with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes.

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A simplified yet accurate method to collect and stain mosquito hemocytes is described. Our method combines the simplicity of perfusion with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes. This method facilitates studies requiring knowledge of the types of hemocytes and their abundance.

Ein Protokoll für die Erfassung und Färbung Blutzellen aus dem Gelbfiebermücke Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

Immunologie und Infektion

Genome Editing in the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti using CRISPR-Cas9

The emergence of the clustered, regularly interspersed, short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9 technology has revolutionized the genetic engineering field and opened the doors for precise genome editing in multiple species, including non-model organisms. In the mosquito Aedes aegypti, loss-of-function mutations and DNA insertions have been accomplished with this technology. Here, we describe a detailed protocol for genome editing through embryonic microinjection in the mosquito A. aegypti using the CRISPR-Cas9 technology, focusing on both the generation of gene knockout and knockin lines. In this protocol, quartz needles are filled with a mixture of guide RNA, recombinant Cas9, and a plasmid containing a DNA cassette encoding a gene for a fluorescent marker, if gene knockin is desired. Embryos at the preblastoderm stage are lined up onto a strip of double-sided sticky tape placed onto a coverslip, which is subsequently mounted onto a glass slide. With the help of a microinjector, the needles are inserted gently into the posterior end of the embryos and a small volume of the CRISPR mixture is dispensed. When the embryos are hatched, the larvae are checked under the fluorescent scope, and the pupae are sex-sorted and separated in different cages. Once the adults emerge, these are reciprocally crossed with wild-type individuals, blood-fed, and placed for egg laying. Once these eggs are hatched, the fluorescent larvae collected represent individuals with stable insertion of the DNA cassette into their genome. These larvae are then grown to the adult stage, outcrossed to wild-type individuals, and then further assessed through molecular techniques to confirm that the exact sequence of the DNA cassette is present at the desired site of the mosquito genome. Homozygous lines can also be obtained by following the provided pipeline of crossing schema and molecular screening of the mutations.

Here, we describe a detailed protocol for genome editing through embryonic microinjection in the mosquito A. aegypti using the CRISPR-Cas9 technology.

Genome Editing bei der Gelbfiebermücke Aedes aegypti mittels CRISPR-Cas9

The emergence of the clustered, regularly interspersed, short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9 technology has revolutionized the genetic engineering ...

Genetik

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

Females of certain mosquito species can spread diseases while biting vertebrate hosts to obtain protein-rich blood meals required for egg development. In the laboratory, researchers can deliver animal-derived and artificial blood meals to mosquitoes via membrane feeders, which allow for manipulation of meal composition. Here, we present methods for feeding blood and artificial blood meals to Aedes aegypti mosquitoes and quantifying the volume consumed by individual females.
Targeted feeding and quantification of artificial/blood meals have broad uses, including testing the effects of meal components on mosquito behavior and physiology, delivering pharmacological compounds without injection, and infecting mosquitoes with specific pathogens. Adding fluorescein dye to the meal prior to feeding allows for subsequent meal size quantification. The meal volume consumed by mosquitoes can be measured either by weight, if the females are to be used later for behavioral experiments, or by homogenizing individual females in 96-well plates and measuring fluorescence levels using a plate reader as an endpoint assay. Meal size quantification can be used to determine whether changing the meal components alters the meal volume ingested or if meal consumption differs between mosquito strains. Precise meal size quantification is also critical for downstream assays, such as those measuring effects on host attraction or fecundity. The methods presented here can be further adapted to track meal digestion over the course of days or to include multiple distinguishable markers added to different meals (like nectar and blood) to quantify the consumption of each meal by a single mosquito.
These methods allow researchers to singlehandedly perform high-throughput measurements to compare the meal volume consumed by hundreds of individual mosquitoes. These tools will therefore be broadly useful to the community of mosquito researchers for answering diverse biological questions.

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

The goal of this protocol is to deliver animal-derived and artificial blood meals to Aedes aegypti mosquitoes through an artificial membrane feeder and precisely quantify the volume of meal ingested.

Fütterung und Quantifizierung von Tierblut und künstlichen Mahlzeiten in Aedes aegypti Mosquitoes

Females of certain mosquito species can spread diseases while biting vertebrate hosts to obtain protein-rich blood meals required for egg development. In ...

Heterologous Expression and Functional Analysis of Aedes aegypti Odorant Receptors to Human Odors in Xenopus Oocytes

The mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), a vector of many important human diseases including yellow fever, dengue fever and Zika fever, shows a strong preference for human hosts over other warm-blooded animals for blood meals. Olfactory cues play a critical role for mosquitoes as they explore their environment and seek a human host to obtain blood meals, thus transmitting human diseases. Odorant receptors (ORs) expressed in the olfactory sensory neurons are known to be responsible for the interaction of mosquito vectors with human odors. To gain deeper insights into Ae. aegypti&#8217;s olfactory physiology and investigate their interactions with humans at the molecular level, we used an optimized protocol of Xenopus Oocytes heterologous expression to functionally analyze Ae. aegypti odorant receptors in response to human odors. Three example experiments are presented: 1) Cloning and synthesizing cRNAs of ORs and odorant receptor co-receptor&#160;(Orco) from four to six days old Ae. aegypti antennae; 2) Microinjection and expression of ORs and Orco in Xenopus oocytes; and 3) Whole-cell current recording from Xenopus oocytes expressing mosquito ORs/Orco with a two-electrode voltage-clamp. These optimized procedures provide a new way for researchers to investigate human odor reception in Aedes mosquitoes and reveal the underlying mechanisms governing their host-seeking activity at a molecular level.

<meta charset="utf8"></head><body>Heterologe Expression und funktionelle Analyse von Geruchsrezeptoren von Aedes aegypti für menschliche Gerüche in Xenopus-Eizellen

A protocol is presented that functionally characterizes mosquito ORs in response to human odors using a Xenopus oocyte expression system coupled with a two-electrode voltage clamp, providing a powerful new technique for exploring the responses of mosquitoes ORs to exposure to human odors.

Heterologe Expression und funktionelle Analyse von Geruchsrezeptoren von Aedes aegypti für menschliche Gerüche in Xenopus-Eizellen

The mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), a vector of many important human diseases including yellow fever, dengue fever and Zika fever, shows a strong ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, most notably developmental arrest and reduced metabolism. Global gene expression profiling via RNA-Seq can provide important insights into the transcriptional mechanisms of photoperiodic diapause. The Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, is an outstanding organism for studying the transcriptional bases of diapause due to its ease of rearing, easily induced diapause, and the genomic resources available. This manuscript presents a general experimental workflow for identifying diapause-induced transcriptional differences in A. albopictus. Rearing techniques, conditions necessary to induce diapause and non-diapause development, methods to estimate percent diapause in a population, and RNA extraction and integrity assessment for mosquitoes are documented. A workflow to process RNA-Seq data from Illumina sequencers culminates in a list of differentially expressed genes. The representative results demonstrate that this protocol can be used to effectively identify genes differentially regulated at the transcriptional level in A. albopictus due to photoperiodic differences. With modest adjustments, this workflow can be readily adapted to study the transcriptional bases of diapause or other important life history traits in other mosquitoes.

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

RNA-Seq analyses are becoming increasingly important for identifying the molecular underpinnings of adaptive traits in non-model organisms. Here, a protocol to identify differentially expressed genes between diapause and non-diapause Aedes albopictus mosquitoes is described, from mosquito rearing, to RNA sequencing and bioinformatics analyses of RNA-Seq data.

Eine experimentelle und Bioinformatik-Protokoll für die RNA-seq Analysen der Photoperiodische Diapause in den asiatischen Tigermücke,<em&gt; Aedes albopictus</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect fat body tissue is usually distributed throughout the insect body. However, it is often concentrated in the abdomen and attached to the abdominal body wall.
The mosquito fat body is the sole source of yolk proteins, which are critical for egg production. Therefore, the in vitro culture of mosquito fat body tissues represents an important system for the study of mosquito physiology, metabolism, and, ultimately, egg production. The fat body culture process begins with the preparation of solutions and reagents, including amino acid stock solutions, Aedes physiological saline salt stock solution (APS), calcium stock solution, and fat body culture medium. The process continues with fat body dissection, followed by an experimental treatment. After treatment, a variety of different analyses can be performed, including RNA sequencing (RNA-Seq), qPCR, Western blots, proteomics, and metabolomics.
In our example experiment, we demonstrate the protocol through the excision and culture of fat bodies from the yellow fever mosquito, Aedes aegypti, a principal vector of arboviruses including dengue, chikungunya, and Zika. RNA from fat bodies cultured under a physiological condition known to upregulate yolk proteins versus the control were subject to RNA-Seq analysis to demonstrate the potential utility of this procedure for investigations of gene expression.

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

The fat body is the central metabolic organ in insects. We present a live organ culture system that enables the user to study the responses of isolated fat body tissue to various stimuli.

Fetten Körper Kultur Organsystem in Aedes Aegypti, Überträger von Zika-Virus

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect ...

A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high quality and quantity DNA from a well-preserved individual mosquito sufficient for downstream whole genome sequencing. However, reliance on an expensive automated DNA extraction instrument can be prohibitive for many laboratories. Here, the study provides a budget-friendly magnetic-bead-based DNA extraction protocol, which is suitable for low to medium throughput. The protocol described here was successfully tested using individual Aedes aegypti mosquito samples. The reduced costs associated with high quality DNA extraction will increase the application of high throughput sequencing to resource limited labs and studies.

Described here is a DNA extraction protocol using magnetic beads to produce high quality DNA extractions from mosquitoes. These extractions are suitable for a downstream next-generation sequencing approach.

Ein magnetperlenbasiertes Moskito-DNA-Extraktionsprotokoll für die Sequenzierung der nächsten Generation

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high ...

Physiologische Aufnahmen und RNA-Sequenzierung der gustatorischen Anhangsgebilde der Gelbfieber-Moskito-

Zusammenfassung

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Genome Editing bei der Gelbfiebermücke Aedes aegypti mittels CRISPR-Cas9

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Heterologe Expression und funktionelle Analyse von Geruchsrezeptoren von Aedes aegypti für menschliche Gerüche in Xenopus-Eizellen

Heterologe Expression und funktionelle Analyse von Geruchsrezeptoren von Aedes aegypti für menschliche Gerüche in Xenopus-Eizellen

Eine experimentelle und Bioinformatik-Protokoll für die RNA-seq Analysen der Photoperiodische Diapause in den asiatischen Tigermücke,

Fetten Körper Kultur Organsystem in Aedes Aegypti, Überträger von Zika-Virus

Ein magnetperlenbasiertes Moskito-DNA-Extraktionsprotokoll für die Sequenzierung der nächsten Generation