Wir erkennen an, Amy Thomasson für ihre Unterstützung bei der Vorbereitung dieses Manuskript, und Fredrik Skarstedt und Ryan Christy für ihre Bemühungen bei der Vorbereitung der Zahlen.

Mit der Zustimmung des Institutional Review Board wurde eine Suche des elektronischen Labor-Datenbank durchgeführt, um in Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) Blöcken, die Fälle von Cytomegalovirus (CMV)-Infektion bei gastrointestinalen (GI) Biopsien durch Histopathologie diagnostiziert (Hämatoxylin und identifizieren Eosin (H &amp; E) und / oder Immunhistochemie (IHC)). 1. Gewebeverarbeitung aus FFPE GI Biopsie Gewebe <ol><li> FFPE GI Biopsie Gewebeblöcke Sammeln für Cytomegalovirus (CMV) quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR). Diese Blöcke werden bei Raumtemperatur gelagert. </li><li> Pre-Etikett 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit der Block eindeutige Identifikationsnummer. </li><li> Sperren Sie die Mikrotom Handrad. </li><li> Setzen Sie die Gewebeblock in die Kassette Klemme. </li><li> Mit einem frischen, unbenutzte Klinge, richten Sie den Block an den Messerwinkel am Mikrotom. </li><li> Stellen Sie die Mikrotom bis 10 um dicke Schnitte geschnitten. </li><li> Entsperren thE Handrad und vorab der Block in Richtung der Klinge. </li><li> Cut 5 Sektionen des Blocks bei 10 um dicke Abständen, so dass jeder Schnitt in einer Schriftrolle von Gewebe zu rollen. Stellen Sie sicher, dass jede Rolle enthält eine angemessene Vertretung der gewünschten Biopsie Gewebe. </li><li> Sperren Sie die Mikrotom Handrad. </li><li> Mit Pinzette, legen alle fünf Schriftrollen von Gewebe in der Pre-markierten Zentrifugenröhrchen, wobei darauf geachtet, das Buch nur durch die Manipulation Paraffin, um Potenzial für eine Kreuzkontamination zu verringern. Lassen Sie die Kappe auf dem Rohr und setzen Sie ihn wieder auf den Rost. </li><li> Entfernen Sie die Gewebeblock aus dem Mikrotom. </li><li> Entfernen und Entsorgen der Klinge. </li><li> Dekontaminieren keine Flächen oder Geräte, die in Kontakt mit dem früheren Gewebe kommen kann. </li><li> Legen Sie eine frische, unbenutzte Klinge in den Messerhalter. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1,4-1,14 für jeden zusätzlichen Block zu verarbeiten. Die Mikrozentrifugenröhrchen von Geweberollen enthalten, können bei Raumtemperatur bis zur tim gespeichert werdene der DNA-Extraktion. </li></ol> 2. DNA-Extraktion aus FFPE Scrolls of GI Biopsie Gewebe HINWEIS: Dieses Protokoll wird von der Packungsbeilage des FFPE Gewebe DNA-Extraktions-Kits (: siehe Material Safety Data Sheet (MSDS) VORSICHT) angepasst. <ol><li> 1 ml Xylol (ACHTUNG: siehe Sicherheitsdatenblatt) zu jeder Probe Mikrozentrifugenröhrchen. Den Deckel schließen und kräftig vortexen für 10 Sekunden. </li><li> Fahren Sie mit der DNA-Extraktion, wie insbesondere in Produktbeilage des Herstellers mit den folgenden Modifikationen beschrieben. </li><li> Fügen Sie zuerst 6 ul der internen Kontrolle (IC) zu jedem Mikrozentrifugenröhrchen. <ol><li> Nach dem ATL / Proteinase K-Lyse-Inkubation bei 56 ° C für 1 h, Inkubation bei 99 ° C für 30 Minuten, anstatt 90 ° C für 1 Stunde. </li><li> Während der abschließenden DNA-Elution Schritt, vorsichtig zu öffnen, den Deckel des DNA-Reinigungskolonne und gelten 50 ul destilliertem DNAse / RNAse-freies Wasser in der Mitte der Membran, anstatt buffer ATE. HINWEIS: In der Packungsbeilage für die geeignete Lagerung und Vorbereitung der Reagenzien. DNA sollte von allen 5 FFPE Rollen extrahiert werden. Führen alle Zentrifugationsschritte bei Raumtemperatur (15-25 ° C). </li></ol></li></ol> 3. QPCR für CMV <ol><li> Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Verfahren <ol><li> Generieren Sie ein Excel-Arbeitsblatt für die PCR-CMV-Testlauf. Diese Excel-Tabelle berechnet die Gesamtmenge jedes Reagenz notwendig sind, um den Master-Mix mit Mg. Er multipliziert die Menge von jedem Reagenz, die pro Probe (siehe unten) mal der Anzahl der Proben und Kontrollen plus eins (um den Verlust durch Pipettieren zu kompensieren). <ol><li> Gehören die folgenden Reagenzien in jeder PCR-Reaktion in der Höhe angegeben: Reagens0; Menge pro Probe CMV-LC-Master-Mix Fläschchen 12,5 ul Mg-Lösung gelben Phiole 2,5 ul Gesamtvolumen 15,0 ul </li></ol></li><li> Fügen Sie bei jedem Test, führen Sie ein Wasser oder keine Zielkontrolle (NTC), Negativkontrolle, einen niedrigen positiven Kontrolle, eine hohe positive Kontrolle und entweder QS3 oder QS4 und alle Patientenproben. Die Kapillaren sollte in dieser Reihenfolge gesetzt werden. </li><li> Der Kühlblock erhalten, die spezifisch für die Echtzeit-PCR-Instrument, das bei 4 ° C gelagert wird Legen Sie die entsprechenden Kapillaren in den Kühlblock. Die Oberfläche der Kapillaren nicht berühren. Verwenden Sie immer Handschuhe bei der Handhabung der Kapillaren. </li><li> Richten Sie alle Polymerase-Kettenreaktionen in einer sauberen Haube nicht mit der Verstärkung der Produktion verunreinigtts. <ol><li> Entfernen Sie die richtige Anzahl von Master-Ampullen aus dem PCR-Kit, um alle Patientenproben, plus 5 Kontrollen zu testen. Lassen Sie die Master-Fläschchen, Mg-Lösung und PCR-Wasser Tauwetter in den Kühlblock. Jeder Master-Fläschchen enthält genügend Reagenzien für 12 Tests. </li><li> Vorsichtig vortexen die Stamm Fläschchen und schnell drehen sie in der Zentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit. </li><li> Die Inhalte der einzelnen Master-Fläschchen in einem Fläschchen, und sanft wieder Wirbel. </li><li> Kombinieren Sie den Master-Mix-und Mg-Lösung in den auf dem PCR-Arbeitsblatt angegeben in einem einzigen sterilen Mikrozentrifugenröhrchen beträgt. </li><li> Vorsichtig mischen und 15 ul Aliquot Master-Mix mit Mg in jede Kapillare, mit Ausnahme der Kapillare in Position 5, die für die Quantifizierung Standard (QS) ist. </li></ol></li><li> Bewegen Sie den Kühlblock die Kapillaren und Master-Mix enthalten, mit Mg von der sauberen Haube zu einer Verarbeitungs Kapuze. </li><li> In 2 ul der internen Kontrolle (IC) auf die verbleibenden 30 ul Mastermischen mit Mg. Vorsichtig mischen und 15 ul Aliquot in die Kapillare in Position 5 (Position für die QS). </li><li> Pipette 10 ul Wasser, Kontroll-DNA oder Proben-DNA in den geeigneten Kapillarrohr. Verschließen Sie die Kapillaren mit dem Capping-Tool. </li><li> Nehmen Kühlblock / Proben auf der Echtzeit-PCR-Instrument. </li></ol></li><li> Programmieren Sie die Echtzeit-PCR-Instrument (siehe Tabelle 1) </li><li> Amplifikation und Detektion auf der Echtzeit-PCR-Gerät durchgeführt <ol><li> Melden Sie sich auf dem Computer </li><li> Klicken Sie doppelt auf das Gerätesymbol und melden Sie sich in der Software. </li><li> Schalten Sie den Echtzeit-PCR-Instrument </li><li> Klicken Sie auf &quot;CMV / EBV&quot; aus der Frontscheibe. </li><li> Folgen Sie den Anweisungen des Assistenten, Makro. </li><li> Wählen Sie die Box, um einen Selbsttest durch, wenn sie von der Software dazu aufgefordert werden. Ein Selbsttest muss einmal pro Tag das Gerät im Einsatz durchgeführt werden. </li><li> Nennen Sie den Lauf. </li><li> Stellen Sie die Probenzahl in der oberen befindet left Ecke der Seite auf die Summe der Kontrollen und Patienten im Vorfeld enthalten und die Identifizierungsnummer jeder Patientenprobe. </li><li> Klicken Sie auf der Registerkarte &quot;Abs Quant&quot;. </li><li> Unter &quot;Sample-Typ&quot;, weisen Sie den entsprechenden Probentyp für den Standard. </li><li> Geben Sie die zu erwartenden Konzentrationen für die Quantifizierung Standard (QS). </li><li> Entfernen der Kapillarröhrchen an dem Kühlerblock und sie in der entsprechenden Position in dem Karussell (Kühlblock Probe Nr. 1 ist in Position 1 auf dem Karussell angebracht werden, etc.). </li><li> Legen Sie das Karussell in die Zentrifuge und Start drücken des Instruments. </li><li> Öffnen und entfernen Sie die Zentrifuge Karussell. </li><li> Legen Sie das Karussell in die Echtzeit-PCR-Instrument. Schließen Sie den Deckel. </li><li> Drücken Sie &quot;Start Ausführen&quot;. </li><li> Die Echtzeit-PCR-Instrument wird jede Position für eine Probe zu prüfen. Sie vom Instrument weg gehen nicht bis diese Prüfung abgeschlossen ist, vorallem wenn eine der Kapillaren nicht in dem Karussell. Das Instrument wird dies beachten und fragen, ob der Lauf fortgesetzt werden. Antwort ja vor der Abreise. </li><li> Nachdem der Lauf beendet ist, schließen Sie den Bericht, der generiert wurde. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Absolute Quantifizierung&quot;. </li><li> Klicken Sie auf den Pfeil neben Farbe Compensation. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Wählen Sie die Farbkorrektur&quot; aus der Drop-Down-Feld. </li><li> Wählen Sie das aktuelle Farbkompensationsdatei auf der Flucht an. </li><li> Klicken Sie auf OK, wenn die Box erscheint. </li><li> Klicken Sie auf den Pfeil von Standard-Kurve. </li><li> Wählen Sie &quot;extern&quot; aus der Drop-Down-Menü. </li><li> Wählen Sie den aktuellen externen Standardkurve Datei, klicken Sie dann auf OK. </li><li> Schauen Sie sich jede Kurve unter der Absolute Quantifizierung Menü, um sicherzustellen, dass Kurven vorhanden und nicht flache Linie sind, wenn eine Konzentration zugeordnet ist. Die absolute Quantifizierung für die 705/Back 530 wird automatisch analysiert. </li></ol></li><li> Qunalität Steuer <ol><li> Erzeugen Sie eine neue Standardkurve, wenn eine neue Charge von Reagenzien empfangen wird, oder alle sechs Monate, je nachdem, was häufiger ist. </li><li> In 10 ul jeder Standard-zum Master-Mix mit Mg. Betrachten Sie die mit dem Kit wie zuvor extrahierten DNA enthalten Standards. </li><li> 1 ul der internen Kontrolle für jeden Standard an den Master-Mix mit Mg bei der Erzeugung der Standardkurve verwendet, um genaue Quantifizierung zu gewährleisten. Sie IC an den Master-Mix mit Mg für den Leerwert-Kontrolle (NTC) nicht hinzu. </li><li> Bereiten Sie ein NTC und drei Wiederholungen von Quantifizierung Standards QS 4, 3, 2, 1, und einer 1:10-Verdünnung von QS4 für den Lauf um die Standardkurve zu erzeugen, insgesamt in 16 Datenpunkten. </li><li> Wählen Sie &quot;Replikat&quot; in der Drop-Down-Menü für die wiederholte Standards </li><li> Wählen Sie Kanal 530/back keine, und schalten Sie die Farbkompensation bei der Analyse der Sicht, </li><li> Unter &quot;Standard Curve (In Run)&quot; wählen Sie &quot;Speichern unter Exinternen &quot;und benennen Sie die Kurve. Geben Sie den Kommentar &quot;als Standardkurve aufgetragen&quot; beim Speichern. </li><li> Grafik die Ergebnisse. Die daraus resultierende Linearitätskoeffizient muss ≥ 0,81 werden. </li><li> Für die tägliche Abfahrten, sind eine Kopie des QS3 oder QS4 als Kontrolle in der Flucht. Die aktuelle externe Standardkurve kann während der Analysephase in den Lauf eingeführt werden. </li><li> Führen Kontrollen: keine DNA Kontrolle, Negativkontrolle, niedrige und hohe positive Kontrollen. Erwartete Viruslast bestimmt und für jeden Lieferanten und Chargennummer angepasst. </li><li> In einer IC zu jeder Probe und während der DNA-Extraktion zu kontrollieren. </li><li> Wenn eine der Kontrollen fallen außerhalb des Bereichs, notieren Sie die Ergebnisse inakzeptabel und verweisen den Test für die Fehlersuche. </li></ol></li><li> Die Häufigkeit der Kontrollen <ol><li> Fügen Sie in jedem Lauf: ein NTC, negativ, schwach positiv, hohe positive und Standardsteuerung. </li></ol></li></ol> Hinweis: Der zulässige Grenzwerte für Kontrollen. Keine Spitzen sollten beobachtend für die ohne Vorlage (NTC) und Negativkontrollen. Peaks sollte in der 530-Kanal vorhanden sein und die erwarteten Viruslast bestimmt und für jeden Lieferanten und Chargennummer für den niedrigen und hohen positiven Kontrollen angepasst.

<ol>
	<li>Hodinka, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Clnical Microbiology. 2, 1558-1574 (2011).</li><li>Lasry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interstrain+variations+in+the+cytomegalovirus+(CMV)+glycoprotein+B+gene+sequence+among+CMV-infected+children+attending+six+day+care+centers.">Interstrain variations in the cytomegalovirus (CMV) glycoprotein B gene sequence among CMV-infected children attending six day care centers.</a> The Journal of infectious diseases. 174, 606-609 (1996).</li><li>Murph, J. R., Baron, J. C., Brown, C. K., Ebelhack, C. L., Bale Jr, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+occupational+risk+of+cytomegalovirus+infection+among+day-care+providers.">The occupational risk of cytomegalovirus infection among day-care providers.</a> JAMA : the journal of the American Medical Association. 265, 603-608 (1991).</li><li>Pass, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccine+prevention+of+maternal+cytomegalovirus+infection.">Vaccine prevention of maternal cytomegalovirus infection.</a> The New England journal of medicine. 360, 1191-1199 (2009).</li><li>McCoy, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=qPCR+increases+sensitivity+to+detect+cytomegalovirus+in+paraffin-embedded,+formalin-fixed+tissue+of+gastrointestinal+biopsies.">qPCR increases sensitivity to detect cytomegalovirus in paraffin-embedded, formalin-fixed tissue of gastrointestinal biopsies.</a> Human Pathology. 45, 48-53 (2014).</li><li>Mills, A. M., Guo, F. P., Copland, A. P., Pai, R. K., Pinsky, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+CMV+detection+in+gastrointestinal+mucosal+biopsies+using+immunohistochemistry+and+PCR+performed+on+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissue.">A comparison of CMV detection in gastrointestinal mucosal biopsies using immunohistochemistry and PCR performed on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> The American journal of surgical pathology. 37, 995-1000 (2013).</li><li>Krech, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement-fixing+antibodies+against+cytomegalovirus+in+different+parts+of+the+world.">Complement-fixing antibodies against cytomegalovirus in different parts of the world.</a> Bulletin of the World Health Organization. 49, 103-106 (1973).</li><li>Chou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newer+methods+for+diagnosis+of+cytomegalovirus+infection.">Newer methods for diagnosis of cytomegalovirus infection.</a> Reviews of infectious diseases. 12 Suppl 7, (1990).</li><li>Brytting, M., Xu, W., Wahren, B., Sundqvist, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytomegalovirus+DNA+detection+in+sera+from+patients+with+active+cytomegalovirus+infections.">Cytomegalovirus DNA detection in sera from patients with active cytomegalovirus infections.</a> Journal of clinical microbiology. 30, 1937-1941 (1992).</li><li>Revello, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cytomegalovirus+in+blood+of+immunocompetent+persons+during+primary+infection:+prognostic+implications+for+pregnancy.">Human cytomegalovirus in blood of immunocompetent persons during primary infection: prognostic implications for pregnancy.</a> The Journal of infectious diseases. 177, 1170-1175 (1998).</li><li>Shinkai, M., Bozzette, S. A., Powderly, W., Frame, P., Spector, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+urine+and+leukocyte+cultures+and+plasma+DNA+polymerase+chain+reaction+for+identification+of+AIDS+patients+at+risk+for+developing+human+cytomegalovirus+disease.">Utility of urine and leukocyte cultures and plasma DNA polymerase chain reaction for identification of AIDS patients at risk for developing human cytomegalovirus disease.</a> The Journal of infectious diseases. 175, 302-308 (1997).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Viele Labormethoden sind für die Diagnose des Cytomegalovirus (CMV)-Infektion, darunter Serologie, Viruskultur, Molekularbiologie Virämie Assays, Histologie von Biopsiematerial und, wie kürzlich gezeigt, molekulare Tests von Formalin-fixierte, in Paraffin eingebetteten (FFPE) Biopsie verfügbar Gewebe 5,6. Serologie, einst eine tragende Säule der Diagnose, nur zuverlässig identifiziert Belichtung und nicht gut mit akuten CMV-Infektion 7 korrelieren. Viruskultur, sowohl konventionelle als früh...

Interpretation von Cytomegalovirus (CMV)-Infektion in klinischen Proben ist von entscheidender Bedeutung. CMV ist ein Mitglied der Unterfamilie Betaherpesvirinae von Herpesviren. Ähnlich wie bei anderen Herpesviren, hat die Fähigkeit, CMV dauerhafte oder latente Infektion zu etablieren, gekennzeichnet durch einen Mangel der aktiven Virusreplikation 1. Reaktivierung des Virus kann in Zeiten von Stress oder andere Immunsuppression auftreten, was zu aktiver Virusreplikation, gekennzeichnet durch Virion Mitteilung, die von Krankheitsmanifestationen 2-4 begleitet sein kann. Gastrointestinale (GI) CMV-Erkrankung Symptome sind häufig Bauchschmerzen und / oder Blut im Stuhl ein. Die Diagnose der CMV Gastroenteritis durch Histologie nutzt Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E), um virale CMV Einschlüsse identifizieren. In Fällen, in denen der klinische Verdacht hoch noch keine offensichtlichen Einschlüsse beobachtet werden, ist der Immunhistochemie (IHC) häufig als Ergänzung Testverfahren verwendet. Jedoch IHCkann auch durch nicht-klassische selten auftretenden Zellfärbungsmuster (zweideutig) behindert werden, so dass die Interpretation erschweren (Abbildung 2) 5. Es wurde versucht, aus Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) GI Biopsiegewebe und quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) auf CMV in GI Biopsien erkennen extrahierten DNA zu verwenden. Diese Technik hat sich gezeigt, wertvoll bei der Detektion von CMV in GI Biopsien werden und ist besonders nützlich in zweideutigen IHC Färbung Fällen 5,6. Auch hat qPCR auch gezeigt, dass auch mit zusätzlichen klinischen CMV Testdaten zu korrelieren, wenn es 6 ist verfügbar. Verwendung von qPCR bei der Aufdeckung von CMV kann auf frühere Diagnose und Behandlung in Fällen, in denen der klinische Verdacht auf CMV ist hoch führen, aber H &amp; E-und CMV-IHC negativ sind.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="745">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">1.7 mL microfuge tubes</td>
			<td style="width:195px;">Costar</td>
			<td align="right" style="width:160px;">3620</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">serrated forceps</td>
			<td style="width:195px;">Electron Microscopy Services</td>
			<td style="width:160px;">62086-1S</td>
			<td>Micro Forceps MF-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Tabletop centrifuges (microfuge)</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:160px;">5424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Xylene</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific: X3P</td>
			<td>1 gallon</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Ethanol</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific: ET108</td>
			<td>96-100%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">microtome</td>
			<td style="width:195px;">Leica</td>
			<td style="width:160px;">RM2255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">QIAamp DNA FFPE Tissue Kit</td>
			<td style="width:195px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:160px;">56404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">artus CMV LightCycler PCR ASR</td>
			<td style="width:195px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:160px;">4500025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">CMV LC PCR Supplement Kit</td>
			<td style="width:195px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:160px;">1031873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">LightCycler centrifuge</td>
			<td style="width:195px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:160px;">75005087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">LightCycler Cooling Block</td>
			<td style="width:195px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:160px;">10800058001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">LightCycler Capping Tool</td>
			<td style="width:195px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:160px;">3357317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Color Compensation Kit</td>
			<td style="width:195px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:160px;">2158850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">LightCycler 20 &#956;L Capillaries</td>
			<td style="width:195px;">Roche</td>
			<td style="width:160px;">1 909 339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">blades</td>
			<td style="width:195px;">Sakura</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific: 4689</td>
			<td>Accu-Edge low profile</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

qpcr is a sensitive and rapid method for detection of cytomegaloviral dna in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue

Es ist entscheidend, Cytomegalovirus (CMV)-Infektion im Magen-Darm-Trakt (GI) bei immunsupprimierten Patienten zu identifizieren, aufgrund ihrer höheren Risiko für schwere Infektionen. Viele Laborverfahren zum Nachweis von CMV Infektion entwickelt worden, einschließlich der Serologie, Viruskultur und molekularbiologischer Methoden. Oft sind diese Methoden reflektieren systemische Beteiligung mit CMV und nicht spezifisch lokale Gewebe Beteiligung zu identifizieren. Daher wird der Nachweis von CMV Infektion in den GI-Trakt häufig durch herkömmliche Histologie der Biopsiegewebe gemacht. Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E)-Färbung in Verbindung mit der Immunhistochemie (IHC) haben die Hauptstützen der Untersuchung dieser Biopsien geblieben. H &amp; E und IHC manchmal in atypischen (zweideutig) Färbungsmuster führen, was die Interpretation erschweren. Es wurde gezeigt, dass quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) zur CMV erfolgreich auf Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) Gewebebiopsie durchgeführt werden, für sehrhohe Sensitivität und Spezifität. Das Ziel des Protokolls ist es, zu demonstrieren, wie qPCR Tests für den Nachweis von CMV in FFPE Biopsiegewebe in einer klinischen Laborumgebung durchzuführen. Diese Methode ist wahrscheinlich von großem Nutzen für die Patienten in Fällen von zweideutigen Färbung für CMV in GI Biopsien sein.

Ein insgesamt 228 Gewebeblöcke wurden durch quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR), die von 91 Cytomegalovirus (CMV)-positiven Fällen mit zweideutigen CMV IHC bestand, wurde basierend auf positive Histologie und Immunhistochemie (IHC), 18, und 79 negative Kontrollen getestet. Wie in Abbildung 2 dargestellt, würde CMV-positiven Fällen typische CMV Viruseinschlüsse (A) und / oder positive IHC-Färbung (B) gezeigt haben. Nicht eindeutige Fälle würden seltenen...

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qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

qPCR ist eine empfindliche und schnelle Methode zur Detektion von DNA Zytomegalieviren in Formalin-fixierte, in Paraffin eingebettete Gewebebiopsie

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

qpcr-is-sensitive-rapid-method-for-detection-cytomegaloviral-dna

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

15.7K Aufrufe.  Indiana University School of Medicine. This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

Serie: qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are analyzed. Established methods to detect cell division include direct visualization by continuous microscopy in cell culture, dilution of vital dyes such as carboxy&#64258;uorescein di-aetate succinimidyl ester (CFSE), immuno-detection of mitogenic antigens such as ki67 or PCNA, and thymidine analogues. Thymidine analogues can be detected by a variety of methods including radio-detection for tritiated thymidine, immuno-detection for bromo-deoxyuridine (BrdU), chloro-deoxyuridine (CldU) and iodo-deoxyuridine (IdU), and chemical detection for ethinyl-deoxyuridine (EdU). We have derived a strategy to detect sequential incorporation of different thymidine analogues (CldU and IdU) into tissues of adult mice. Our method allows investigators to accurately quantify two successive rounds of cell division. By optimizing immunostaining protocols our approach can detect very low dose thymidine analogues administered via the drinking water, safe to administer to mice for prolonged periods of time. Consequently, our technique can be used to detect cell turnover in very long-lived tissues. Optimal immunofluoresent staining results can be achieved in multiple tissue types, including pancreas, skin, gut, liver, adrenal, testis, ovary, thyroid, lymph node, and brain. We have also applied this technique to identify oncogenic transformation within tissues. We have further applied this technique to determine if transit-amplifying cells contribute to growth or renewal of tissues. In this sense, sequential administration of thymidine analogues represents a novel approach for studying the origins and survival of cells involved in tissue homeostasis.

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues CldU and IdU in Primary Tissue

We have derived a strategy to detect sequential incorporation of thymidine analogues (CldU and IdU) into tissues of adult mice to quantify two successive rounds of cell division. This strategy is useful to detect cell turnover of long-lived tissues, oncogenic transformation, or transit-amplifying cells.

Immunfluoreszenz-Nachweis von zwei Thymidinanaloga (CldU und IDU) in primärem Gewebe

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are ...

Forschung

Biologie

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Paraffin-Embedded-und Gefrierschnitte von Drosophila Adult Muskeln

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

DNA-Extraktion aus in Paraffin eingebettete Material für genetische und epigenetische Analysen

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale quantitative analysis of formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) tissue. The procedure comprises four distinct steps. The first one is the preparation of sections from the FFPE material and microdissection of cells of interest. In the second step the isolated cells are lysed and processed using 'filter aided sample preparation' (FASP) technique. In this step, proteins are depleted from reagents used for the sample lysis and are digested in two-steps using endoproteinase LysC and trypsin. 
After each digestion, the peptides are collected in separate fractions and their content is determined using a highly sensitive fluorescence measurement. Finally, the peptides are fractionated on 'pipette-tip' microcolumns. The LysC-peptides are separated into 4 fractions whereas the tryptic peptides are separated into 2 fractions. In this way prepared samples allow analysis of proteomes from minute amounts of material to a depth of 10,000 proteins. Thus, the described workflow is a powerful technique for studying diseases in a system-wide-fashion as well as for identification of potential biomarkers and drug targets.

Archival formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) clinical samples are valuable material for investigation of diseases. Here we demonstrate a sample preparation workflow allowing in-depth proteomic analysis of microdissected FFPE tissue.

Proteomik Probenvorbereitung von Formalin fixiert und in Paraffin eingebetteten Gewebe

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA probes. This protocol, originally developed by Kloosterman and colleagues for broad use with Exiqon miRNA probes1, has been modified to overcome challenges inherent in miRNA analysis in kidney tissues. These include issues such as structure identification and hard to remove residual probe and antibody. Use of relatively thin, 5 mm thick, tissue sections allowed for clear visualization of kidney structures, while a strong probe signal was retained in cells. Additionally, probe concentration and incubation conditions were optimized to facilitate visualization of microRNA expression with low background and nonspecific signal. Here, the optimized protocol is described, covering the initial tissue collection and preparation through the mounting of slides at the end of the procedure. The basic components of this protocol can be altered for application to other tissues and cell culture models.

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

This article describes an in situ hybridization protocol optimized for colormetric detection of microRNA expression in formalin fixed kidney sections.

MicroRNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung für Formalin fixiert Nierengewebe

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

Erkennung von Live-<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7-Zellen durch PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to complete. We describe a method for the rapid isolation of mitochondria from mammalian biopsies using a commercial tissue dissociator and differential filtration. In this protocol, manual homogenization is replaced with the tissue dissociator&#8217;s standardized homogenization cycle. This allows for uniform and consistent homogenization of tissue that is not easily achieved with manual homogenization. Following tissue dissociation, the homogenate is filtered through nylon mesh filters, which eliminate repetitive centrifugation steps. As a result, mitochondrial isolation can be performed in less than 30 min. This isolation protocol yields approximately 2 x 1010 viable and respiration competent mitochondria from 0.18 &#177; 0.04 g (wet weight) tissue sample.

A method for rapid isolation of mitochondria from mammalian tissue biopsies is described. Rat liver or skeletal muscle preparations were homogenized with a commercial tissue dissociator and mitochondria were isolated by differential filtration through nylon mesh filters. Mitochondrial isolation time is &#60;30 min compared to 60 - 100 min using alternative methods.

Schnelle Isolierung und Reinigung von Mitochondrien für die Transplantation von Gewebe-Dissoziation und Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is partitioned into ~20,000 nano-sized, water-in-oil droplets, and PCR amplification occurs in individual droplets. The ddPCR approach is in identifying sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving targeted genes. Here, we demonstrate the use of ddPCR as a powerful technique for precisely quantitating rare BRAF V600E mutations in FFPE reference standard cell lines, which is helpful in identifying individuals with cancer. In conclusion, ddPCR technique offers the potential to precisely profile the specific rare mutations in different genes in various types of FFPE samples.

The goal of this video is to demonstrate how to perform&#160;automated DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) reference standard cell lines and digital droplet PCR&#160;(ddPCR) analysis to detect rare mutations in a clinical setting. Detecting mutations in FFPE samples demonstrates the clinical utility of ddPCR in FFPE samples.

Verwendung digitaler Droplet PCR zu BRAF V600E Mutationen in Formalin-fixierte Paraffin Reference Standard-Zelllinien Detect

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

Filtration Isolierung von Nukleinsäuren: Eine einfache und schnelle DNA-Extraktionsmethode

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.

This modified extraction protocol improves RNA and DNA yields from more precisely targeted regions of interest in histopathologic tissue blocks.

Herstellung von Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten Gewebe Cores sowohl für RNA und DNA-Extraktion

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...

qPCR ist eine empfindliche und schnelle Methode zur Detektion von DNA Zytomegalieviren in Formalin-fixierte, in Paraffin eingebettete Gewebebiopsie

Zusammenfassung

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