Wir sind dankbar, dass Dr. Stephen Robinson und Frau Hania Czerwinska (Monash University) für die großzügige Versorgung der Astrozyten-Kulturen.

1. Bestimmen Intrazelluläre Ascorbat in kultivierten Zellen <ol><li> Zellkultur-und Ernte <ol><li> Wachsen Suspension (z. B. Mensch erythroleukemia, K562) oder adhärenten Zellen (zB primäre Astrozyten) mit Standard-Kulturverfahren 19-21,32,38. Hinweis: Um sicherzustellen, Zellen enthalten Ascorbat, laden kultivierten Zellen mit Ascorbat entweder als Ascorbat oder DHA 33,39. </li></ol></li><li> Neues Ascorbat haltigen Zellextrakt <ol><li> Inkubation eine entsprechende Anzahl von Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) gewaschen Aussetzung oder adhärenten Zellen mit 450 ul eiskaltem Zellpermeabilisierung Buffer [CPB; 0,1% (w / v) Saponin in PBS; 4 ° C]. Hinweis: Bestimmen der Anzahl von Zellen erforderlich ist, um einen Absorptionswert im linearen Bereich des Tests zu erhalten (siehe unten) empirisch durch den Endverbraucher. Hinweis: Gewebeextrakte können auch verwendet werden (siehe Diskussion für weitere Details). </li><li> Agitate Zellen auf Eis für 10 Minuten, um eine gründliche zelluläre Lyse zu gewährleisten. </li><li> Erstellen einer geklärten Ascorbat enthaltenden intrazellulären Extrakt durch Entfernen von Zelltrümmern durch Zentrifugieren des rohen Lysats bei 16.000 × g für 5 min in einer Mikrozentrifuge gekühlt (4 ° C). </li><li> Entfernen Sie vorsichtig 4 x 100 ul Aliquots von jeder Probe, und fügen Sie eine horizontale Abfolge von Wells in einer 96-Well-Flachbodenplatte, die entweder 25 ul / Vertiefung PBS (&quot;-AO&quot;) oder nur 25 ul / Vertiefung von 45,5 U enthält / ml Stammlösung von L-Ascorbat-Oxidase (AO) in PBS (&quot;+ AO&quot;). Hinweis: Diese sollten parallel mit der Vorbereitung der Standards durchgeführt werden (siehe unten). </li></ol></li><li> Ascorbat Standard-Kurve Bau (muss für jeden Test neu gebaut werden) <ol><li> Bereiten Sie eine Stammlösung von 10 mM Ascorbinsäure in eiskaltem PBS. Hinweis: Überprüfen Sie, ob die Konzentration von Ascorbat spektrophotometrisch mit einer Quarz-Küvette mit einer 1cm Weglänge bei 265 nm (Extinktionskoeffizient = 14,5 mM -1 cm -1) 40. </li><li> Sorgfältig bereiten eine Reihe von Ascorbat Standards zwischen 0 und 20 uM. </li><li> Parallel zu Schritt 1.2.4, entfernen Sie vorsichtig 4 x 100 ul Aliquots von jedem Standard und fügen Sie zu einer horizontalen Folge von Vertiefungen in einer 96-Well-Flachbodenplatte, die 25 ul / Vertiefung enthält PBS (&quot;AO-&quot;) oder eine 45,5 U / ml Stammlösung von AO in PBS (&quot;+ AO&quot;). Hinweis: 100 ul der oben Ascorbat Standards 0-2 nmol Ascorbat enthalten. Bitte beachten Sie, dass der Zweck der AO für den Beitrag der nicht-Ascorbat Reduktions Reduktion Ferricyanid steuern. </li></ol></li><li> Bestimmen intrazellulären Ascorbat - Schritt 1: selektiv zu entfernen, Ascorbat und quantitativ oxidieren Ascorbat mit Ferricyanid <ol><li> Orbital mischen die 96-Well-Platte bei 550 Upm bei Raumtemperatur für 5 min in der Dunkelheit durch Abdecken der Platte in Folien. Hinweis: Tseinen Schritt sollten alle Ascorbat in den &quot;+ AO&quot; Brunnen DHA zu oxidieren. Die &quot;-AO&quot; Brunnen sollte davon unberührt. </li><li> Dann werden 50 ul 3,5 mM Kaliumferricyanid in PBS zu allen Vertiefungen (hierin als &quot;Ferricyanid&quot; bezeichnet). Die endgültige [Ferricyanid] = 1 mm. Hinweis: Verwenden Sie eine multipipettor. </li><li> Die Platte Orbital mischen bei 550 Umdrehungen pro Minute bei Raumtemperatur für weitere 5 min im Dunkeln. Anmerkung: Dieser Schritt ist bei der Reduktion von Ferricyanid von Ascorbat in einem stöchiometrischen Verhältnis von 2 Molekülen Ferricyanid pro 1 Molekül Ascorbat oxidiert reduziert Cyanoferrat führen. </li><li> Sofort werden 25 ul einer frisch aufgebaut Lösung mit 50% (v / v) Essigsäure und 30% (w / v) Trichloressigsäure (TCA). Hinweis: Verwenden Sie eine multipipettor. </li></ol></li><li> Bestimmen intrazellulären Ascorbat - Schritt 2: Quantifizierung der Menge des gebildeten Blutlaugen 37 <ol><li> 100 l Ferrocyanidtest Bestimmung Lösung 37 bis Each gut. Hinweis: Eine funktionierende Lösung ist unmittelbar vor Gebrauch hergestellt werden: 2 ml 3 M Na-Acetat (pH 6,0); 0,5 ml Eisessig (~ 17,4 M Essigsäure); 2 ml 0,2 M Zitronensäure; 2 ml von 3,3 mM FeCl 3 in 0,1 M Essigsäure; 1 ml 30 mM Ferene-S. Das endgültige Volumen dieser Arbeitslösung sollte 7,5 ml betragen. </li><li> Orbital mischen der Platte im Dunkeln bei 550 UpM für 30 min bei Raumtemperatur. </li><li> Lesen der Absorptionswerte der Vertiefungen bei 593 nm (das heißt das Absorptionsmaximum des Fe (II) (Ferene-S) 3-Komplex). </li><li> Berechnen Sie die Menge der intrazellulären Ascorbat als nmol Ascorbat pro Million Zellen zunächst Subtraktion der A 593 nm Werte für die &#39;+ AO&#39; Brunnen aus den entsprechenden &#39;- AO &quot;Brunnen für jede Probe und dann Interpolation von der Ascorbat Standardkurve (siehe Schritt 1.3 ). Bei der Konstruktion der Standardkurve zeichnen dieses &quot;Differenzwert&quot; für jeden Standard gegen die Höhe der ascorbaß pro Vertiefung. </li></ol></li></ol> 2. Bestimmung von Ascorbat-Ausstrom aus kultivierten Zellen <ol><li> Zellkultur-und Ernte <ol><li> Wachsen Aussetzung oder adhärenten Zellen, wie oben (siehe Schritt 1.1). Hinweis: Durchführung der unter-Assay in einer 24-Well-Format plat mit Federung und adhärenten Zellen für beste Ergebnisse. </li><li> Resuspendieren Suspensionszellen oder lagern adhärenten Zellen mit 400 &amp;mgr; l vorgewärmtem HEPES-gepufferte Salzlösung, mit oder ohne Calcium und Magnesium, und enthaltend 5 mM D-Glucose (HBS / D, pH 7,3, 37 ° C) in Vertiefungen einer 24-Well-Platte. Füge das gleiche Volumen an HBS / D angegeben zellfreien Vertiefungen auf jeder Platte mit 24 Vertiefungen untersucht werden. Hinweis: Letztere wird als zellfreie Kontrollen für die Baseline-Reaktion dienen (siehe unten). </li></ol></li></ol> 3. Bestimmen Sie die Anzahl der Ascorbat freigegeben <ol><li> Sollten die folgenden Stammlösungen vorher vorbereitet werden: 120U / ml AO in HBS / D (frisch zubereiten); 2,4 mM Ferene-S in HBS / D; 120 uM FeCl 3 und 600 uM Na-Citrat in HBS / D (unmittelbar vorzubereiten aus mehr konzentrierte Stammlösungen). </li><li> Um die Reaktions ferrireduction (Endvolumen pro Vertiefung sollte 600 ul sein) zu starten, fügen Sie die folgenden Mengen an Reagenzien an einzelnen Wells bereits 400 ul HBS / D enthält: <ol><li> Dann werden 50 &amp;mgr; l AO (120 U / ml) oder HBS / D in Vertiefungen in dreifacher Ausfertigung gepaart. Die endgültige Konzentration sollte AO 10 U / ml. Hinweis: Label gepaart Brunnen als &quot;- AO&quot; und &quot;+ AO&quot;. </li><li> Mische die Platten sanft orbitalen Mischen für 5 min bei 37 ° C. </li><li> In 50 ul von 2,4 mM Ferene-S in alle Vertiefungen. Die endgültige Ferene-S-Konzentration sollte 200 &amp;mgr; m sein. Mische die Platten wie oben für 5 min bei 37 ° C. </li><li> In 50 ul frisch zubereitet 120 uM Eisen-III-Citrat. Die endgültige Eisen und Citrat-Konzentrationen sollten 10 uM Eisen und 50 uM Citrat sein. Gut mischen. </li></ol&gt; </li><li> In drei dreifach Steuer Brunnen, saugen Sie den darüberliegenden Medium, und fügen Sie 600 ul HBS / D mit 0,1% Saponin. Hinweis: Diese werden als &quot;100% Zell-Lyse&quot; Steuerelemente für ein Laktat-Dehydrogenase (LDH)-Freisetzungstest parallel durchgeführt werden (siehe unten) zu dienen. </li><li> Inkubation für 60 min im Dunkeln bei 37 ° C. </li><li> Am Ende des Ascorbat-Efflux-Assay, schnell absaugen 500 ul von jedem gut, und fügen Sie in einer 24-Well-Platte entsprechend gekennzeichnet Brunnen. Hinweis: für Suspensionszellen, zunächst zu entfernen, die Zellen durch Zentrifugation bei 4 ° C. </li><li> Add 300 ul-Aliquots des Überstandes auf eine 96-Well-Platte und dann bei 593 nm abgelesen. </li></ol> 4. Bestimmung der extrazellulären Ascorbat <ol><li> Lesen Sie die Absorptionswerte der Wells bei 593 nm auf. </li><li> Berechnen der Menge des extrazellulären Ascorbat als Ascorbat nmol pro mg Protein (oder pro Million Zellen), die zur Bestimmung der intrazellulären Ascorbat beschriebenin Schritt 1.5.4. Hinweis: Der Anwender sollte Bedingungen zu optimieren, so dass Ascorbat Freigabe nicht durch intrazelluläre Ascorbat begrenzt. </li></ol> 5. Bestimmung der LDH-Freisetzung <ol><li> Mit den restlichen 200 ul der extrazellulären Lösung von jeder Probe die Durchführung einer LDH-Freisetzungstest 32,41, um das Ausmaß der zellulären Lyse zu bestimmen. Hinweis: berechnet in% des Gesamt lösbare LDH. Bestimmen lösbare LDH aus den Proben, die mit 0,1% Saponin behandelt wurden. </li></ol>

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	<li>Buettner, G. R., Schafer, F. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Albert+Szent-Gy&#246;rgyi:+vitamin+C+identification.">Albert Szent-Gy&#246;rgyi: vitamin C identification.</a> Biochem. J. , (2006).</li><li>Padayatty, S. J., Levine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+physiology+and+pharmacology+of+vitamin.">New insights into the physiology and pharmacology of vitamin.</a> C. Can. Med. Assoc. J. 164, 353-355 (2001).</li><li>Flashman, E., Davies, S. L., Yeoh, K. K., Schofield, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+dependence+of+the+hypoxia-inducible+factor+hydroxylases+(factor+inhibiting+HIF+and+prolyl+hydroxylase+domain+2)+on+ascorbate+and+other+reducing+agents.">Investigating the dependence of the hypoxia-inducible factor hydroxylases (factor inhibiting HIF and prolyl hydroxylase domain 2) on ascorbate and other reducing agents.</a> Biochem. J. 427, 135-142 (2010).</li><li>Manning, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+C+Promotes+Maturation+of+T-Cells.">Vitamin C Promotes Maturation of T-Cells.</a> Antioxid. Redox Signal. 19, 2054-2067 (2013).</li><li>Asard, H., et al., Banerjee, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Redox Biochemistry. , 22-37 (2007).</li><li>Aguirre, R., May, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+in+the+vascular+bed:+Importance+of+vitamin.">Inflammation in the vascular bed: Importance of vitamin.</a> C. Pharmacol. Ther. 119, 96-103 (2008).</li><li>May, J. M., Qu, Z. -. c., Mendiratta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+and+recycling+of+a-tocopherol+in+human+erythrocytes+by+intracellular+ascorbic+acid.">Protection and recycling of a-tocopherol in human erythrocytes by intracellular ascorbic acid.</a> Arch. Biochem. Biophys. 349, 281-289 (1998).</li><li>Chatterjee, I. B., Majumder, A. K., Nandi, B. K., Subramanian, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+some+major+functions+of+vitamin+C+in+animals.">Synthesis and some major functions of vitamin C in animals.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 258, 24-47 (1975).</li><li>Rumsey, S. C., Levine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absorption+transport+and+disposition+of+ascorbic+acid+in+humans.">Absorption transport and disposition of ascorbic acid in humans.</a> J. Nutr. Biochem. 9, 116-130 (1998).</li><li>Nishikimi, M., Fukuyama, R., Minoshima, S., Shimizu, N., Yagi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+chromosomal+mapping+of+the+human+nonfunctional+gene+for+L-gulono-g-lactone+oxidase,+the+enzyme+for+L-ascorbic+acid+biosynthesis+missing+in+man.">Cloning and chromosomal mapping of the human nonfunctional gene for L-gulono-g-lactone oxidase, the enzyme for L-ascorbic acid biosynthesis missing in man.</a> J. Biol. Chem. 269, 13685-13688 (1994).</li><li>Challem, J. J., Taylor, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviruses,+ascorbate,+mutations,+in+the+evolution+of+Homo+sapiens.">Retroviruses, ascorbate, mutations, in the evolution of Homo sapiens.</a> Free Radic. Biol. Med. 25, 130-132 (1998).</li><li>Nishikimi, M., Yagi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+the+deficiency+in+humans+of+gulonolactone+oxidase,+a+key+enzyme+for+ascorbic+acid+biosynthesis.">Molecular basis for the deficiency in humans of gulonolactone oxidase, a key enzyme for ascorbic acid biosynthesis.</a> Am. J. Clin. Nutr. 54, 12038-12088 (1991).</li><li>Linster, C. L., Biosynthesis Van Schaftingen, E. V. i. t. a. m. i. n. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=recycling+and+degradation+in+mammals.">recycling and degradation in mammals.</a> FEBS J. 274, 1-22 (2007).</li><li>May, J. M., Qu, Z. -. c., Qiao, H., Koury, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturational+loss+of+the+vitamin+C+transporter+in+erythrocytes.">Maturational loss of the vitamin C transporter in erythrocytes.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 360, 295-298 (2007).</li><li>Wilson, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+vitamin+C+transport.">Regulation of vitamin C transport.</a> Annu. Rev. Nutr. 25, 105-125 (2005).</li><li>Buettner, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pecking+order+of+free+radicals+and+antioxidants:+lipid+peroxidation,+a-tocopherol,+and+ascorbate.">The pecking order of free radicals and antioxidants: lipid peroxidation, a-tocopherol, and ascorbate.</a> Arch. Biochem. Biophys. 300, 535-543 (1993).</li><li>May, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+ascorbic+acid+an+antioxidant+for+the+plasma+membrane.">Is ascorbic acid an antioxidant for the plasma membrane.</a> FASEB J. 13, 995-1006 (1999).</li><li>Atanassova, B. D., Tzatchev, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbic+acid+-+important+for+iron+metabolism.">Ascorbic acid - important for iron metabolism.</a> Folia Med. (Plovdiv). 50, 11-16 (2008).</li><li>Lane, D. J. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-transferrin+iron+reduction+and+uptake+are+regulated+by+transmembrane+ascorbate+cycling+in+K562+cells).">Non-transferrin iron reduction and uptake are regulated by transmembrane ascorbate cycling in K562 cells).</a> J. Biol. Chem. 283, 12701-12708 (2008).</li><li>Lane, D. J. R., Robinson, S. R., Czerwinska, H., Bishop, G. M., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+routes+of+iron+accumulation+in+astrocytes:+ascorbate-dependent+ferrous+iron+uptake+via+the+divalent+metal+transporter+(DMT1)+plus+an+independent+route+for+ferric+iron.">Two routes of iron accumulation in astrocytes: ascorbate-dependent ferrous iron uptake via the divalent metal transporter (DMT1) plus an independent route for ferric iron.</a> Biochem. J. 432, 123-132 (2010).</li><li>Lane, D. J. R., Chikhani, S., Richardson, V., Richardson, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transferrin+iron+uptake+is+stimulated+by+ascorbate+via+an+intracellular+reductive+mechanism.">Transferrin iron uptake is stimulated by ascorbate via an intracellular reductive mechanism.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1833, 1527-1541 (2013).</li><li>Lawen, A., Lane, D. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+iron+homeostasis+in+health+and+disease:+uptake,+storage,+transport,+and+molecular+mechanisms+of+action.">Mammalian iron homeostasis in health and disease: uptake, storage, transport, and molecular mechanisms of action.</a> Antioxid. Redox Signal. 18, 2473-2507 (2013).</li><li>Gr&#252;newald, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbic+acid+in+the+brain.">Ascorbic acid in the brain.</a> Brain Res. Brain Res. Rev. 18, 123-133 (1993).</li><li>Harrison, F. E., May, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+C+function+in+the+brain:+vital+role+of+the+ascorbate+transporter+SVCT2.">Vitamin C function in the brain: vital role of the ascorbate transporter SVCT2.</a> Free Radic. Biol. Med. 46, 719-730 (2009).</li><li>Rebec, G. V., Pierce, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vitamin+as+neuromodulator:+ascorbate+release+into+the+extracellular+fluid+of+the+brain+regulates+dopaminergic+and+glutamatergic+transmission.">A vitamin as neuromodulator: ascorbate release into the extracellular fluid of the brain regulates dopaminergic and glutamatergic transmission.</a> Prog. Neurobiol. 43, 537-565 (1994).</li><li>Hediger, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+view+at+C.">New view at C.</a> Nat. Med. 8, 445-446 (2002).</li><li>Du, J., Cullen, J. J., Buettner, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbic+acid:+Chemistry,+biology+and+the+treatment+of+cancer.">Ascorbic acid: Chemistry, biology and the treatment of cancer.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1826, 443-457 (2012).</li><li>Wilson, J. X., Peters, C. E., Sitar, S. M., Daoust, P., Gelb, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+stimulates+ascorbate+transport+by+astrocytes.">Glutamate stimulates ascorbate transport by astrocytes.</a> Brain Res. 858, 61-66 (2000).</li><li>Danbolt, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+uptake.">Glutamate uptake.</a> Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).</li><li>May, J. M., Li, L., Hayslett, K., Qu, Z. -. c. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbate+transport+and+recycling+by+SH-SY5Y+neuroblastoma+cells:+response+to+glutamate+toxicity.">Ascorbate transport and recycling by SH-SY5Y neuroblastoma cells: response to glutamate toxicity.</a> Neurochem. Res. 31, 785-794 (2006).</li><li>Rice, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbate+regulation+and+its+neuroprotective+role+in+the+brain.">Ascorbate regulation and its neuroprotective role in the brain.</a> Trends Neurosci. 23, 209-216 (2000).</li><li>Lane, D. J. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glutamate+aspartate+transporter+(GLAST)+mediates+L-glutamate-stimulated+ascorbate-release+via+swelling-activated+anion+channels+in+cultured+neonatal+rodent+astrocytes.">The glutamate aspartate transporter (GLAST) mediates L-glutamate-stimulated ascorbate-release via swelling-activated anion channels in cultured neonatal rodent astrocytes.</a> Cell. Biochem. Biophys. 65, 107-119 (2012).</li><li>Lane, D. J. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbate+and+plasma+membrane+electron+transport+-+enzymes+vs+efflux.">Ascorbate and plasma membrane electron transport - enzymes vs efflux.</a> Free Radic. Biol. Med. 47, 485-495 (2009).</li><li>Davies, A. R. L., Belsey, M. J., Kozlowski, R. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volume-sensitive+organic+osmolyte/anion+channels+in+cancer:+novel+approaches+to+studying+channel+modulation+employing+proteomics+technologies.">Volume-sensitive organic osmolyte/anion channels in cancer: novel approaches to studying channel modulation employing proteomics technologies.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1028, 38-55 (2004).</li><li>Novakova, L., Solich, P., Solichova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPLC+methods+for+simultaneous+determination+of+ascorbic+and+dehydroascorbic+acids.">HPLC methods for simultaneous determination of ascorbic and dehydroascorbic acids.</a> Trends Anal. Chem. 27, 942-958 (2008).</li><li>Vislisel, J. M., Schafer, F. Q., Buettner, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+sensitive+assay+for+ascorbate+using+a+plate+reader.">A simple and sensitive assay for ascorbate using a plate reader.</a> Anal. Biochem. 365, 31-39 (2007).</li><li>Lane, D. J. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+sensitive+colorimetric+microplate+ferrocyanide+assay+applied+to+ascorbate-stimulated+transplasma+membrane+ferricyanide+reduction+and+mitochondrial+succinate+oxidation.">A highly sensitive colorimetric microplate ferrocyanide assay applied to ascorbate-stimulated transplasma membrane ferricyanide reduction and mitochondrial succinate oxidation.</a> Anal. Biochem. 373, 287-295 (2008).</li><li>Lane, D. J. R., Robinson, S. R., Czerwinska, H., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+Na+/H++exchangers+and+intracellular+pH+in+regulating+vitamin+C-driven+electron+transport+across+the+plasma+membrane.">A role for Na+/H+ exchangers and intracellular pH in regulating vitamin C-driven electron transport across the plasma membrane.</a> Biochem. J. 428, 191-200 (2010).</li><li>Corti, A., Casini, A. F., Pompella, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+pathways+for+transport+and+efflux+of+ascorbate+and+dehydroascorbate.">Cellular pathways for transport and efflux of ascorbate and dehydroascorbate.</a> Arch. Biochem. Biophys. 500, 107-115 (2010).</li><li>Laroff, G. P., Fessenden, R. W., Schuler, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electron+spin+resonance+spectra+of+radical+intermediates+in+the+oxidation+of+ascorbic+acid+and+related+substances.">The electron spin resonance spectra of radical intermediates in the oxidation of ascorbic acid and related substances.</a> J. Am. Chem. Soc. 94, 9062-9073 (1972).</li><li>Dringen, R., Kussmaul, L., Hamprecht, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detoxification+of+exogenous+hydrogen+peroxide+and+organic+hydroperoxides+by+cultured+astroglial+cells+assessed+by+microtiter+plate+assay.">Detoxification of exogenous hydrogen peroxide and organic hydroperoxides by cultured astroglial cells assessed by microtiter plate assay.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 2, 223-228 (1998).</li><li>Lane, D. J. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplasma+membrane+electron+transport+comes+in+two+flavors.">Transplasma membrane electron transport comes in two flavors.</a> Biofactors. 34, 191-200 (2009).</li><li>Lin, S., Lin, D. C., Flanagan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+of+the+effects+of+cytochalasin+B+on+transport+and+motile+processes.">Specificity of the effects of cytochalasin B on transport and motile processes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75, 329-333 (1978).</li><li>May, J. M., Qu, Z. C., Juliao, S., Cobb, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbic+acid+decreases+oxidant+stress+in+endothelial+cells+caused+by+the+nitroxide+tempol.">Ascorbic acid decreases oxidant stress in endothelial cells caused by the nitroxide tempol.</a> Free Radic. Res. 39, 195-202 (2005).</li><li>Avron, M., Shavit, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+and+simple+method+for+determination+of+ferrocyanide.">A sensitive and simple method for determination of ferrocyanide.</a> Anal. Biochem. 6, 549-554 (1963).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

In der vorliegenden Arbeit werden zwei schnelle, spezifische und relativ empfindliche kolorimetrische Mikrotiterplatten-Assays zur Bestimmung von Ascorbat aus den intra-und extrazellulären Kompartimenten in kultivierten Zellen. Die Tests können mit Zugang zu Standard-Labor-Ausrüstung und Reagenzien durchgeführt werden. Die nur moderat kostspielig Reagens für den Assay erforderlich ist, AO, was wesentlich ist, da es einen hohen Grad an Spezifität gegenüber Analyt-L-ascorbat verleiht....

Die Entdeckung der chemischen Natur von Ascorbinsäure (Vitamin C), und seiner Identifikation als der lange gesuchte &quot;Anti-Skorbut-Faktor&quot;, von Albert Szent-Györgyi und andere in Papiere von 1928 bis 1934 veröffentlicht waren ein Wahrzeichen Ereignisse in der Geschichte der Biochemie. Tatsächlich trugen diese Entdeckungen Szent-Györgyi auf, die im Jahr 1937 den Nobelpreis für Physiologie oder Medizin. Die ständig wachsende Palette von Rollen für Ascorbat in Tier-und Pflanzenphysiologie, sowie die menschliche Gesundheit, weiterhin die Themen der aktiven wissenschaftlichen sein Untersuchung und Kontroversen. L-Ascorbat ist eine reichlich vorhandene physiologische Reduktionsmittel und Enzym-Cofaktor in Säugersystemen, und trägt zu zahlreichen gut definierten enzymatischen Reaktionen, die die Hydroxylierung von Kollagen, Carnitin-Biosynthese und Norepinephrin, Tyrosin-Stoffwechsel und Peptidhormon Amidierung 2. Interessanterweise Montage evideNCE legt nahe, dass Ascorbat spielt eine Rolle bei der Stimulierung anderer Eisen-abhängige Dioxygenasen, wie die Prolyl-Hydroxylasen und Asparaginyl bei der Hydroxylierung beteiligt und Ausrichtung der Hypoxie-induzierbaren Faktoren (HIFs) und 1α 2α 3. Ein neuer Bericht legt nahe, dass Ascorbat spielt eine Rolle bei der T-Zellreifung durch Chromatin beeinflusst Demethylierung über seine Tätigkeit bei der Stimulierung der Kern Hydroxylasen, Jumonji C (JmjC) Domain-Proteine; von denen die letztere scheinen Ascorbat für volle Aktivität 4 erfordern. Tatsächlich ist die Stimulierung solcher Enzyme durch Ascorbat scheint durch einen ähnlichen Mechanismus auf die Stimulation auftreten durch Ascorbat der HIF-Hydroxylasen und Kollagen. Unter anderen klassischen Wirkungen beiträgt Ascorbat signifikant die zelluläre Antioxidation als wasserlösliches Kettenabbruch Radikalfänger 5 und dem Recycling von Plasmamembran-α-Tocopherol (Vitamin E) über die Reduktion der α-tocopheroxyl Rest 6, welche ist beim Schutz gegen Membranlipidperoxidation 7 wichtig. Wichtig ist, dass obwohl die meisten Säugetiere sind in der Lage, de novo hepatische Synthese von Ascorbat aus D-Glucose, höhere Primaten, Meerschweinchen und einige Fledermäuse hängen von Nahrungsquellen von Vitamin 8. Dies beruht auf der Inaktivierung des Gens GULO die Orthologe davon unberührt in Säugern codieren, das Enzym γ-Gulono-lacton-Oxidase 9-13. Dieses Enzym ist für die endgültige Reaktion in Ascorbat-Biosynthese aus Glucose 13 erforderlich. Nach Transporter-vermittelte Resorption aus dem Darmlumen in den Menschen, Ascorbat während des Körpers durch das Kreislaufsystem verteilt. Das Vitamin wird in der Regel in seiner reduzierten Form in millimolaren Konzentrationen intrazellulär (mit der Ausnahme von Erythrozyten in dem die Konzentrationen sind in der Regel ähnlich wie der vorherrschende Plasmakonzentration) und in mikromolaren konz gefundenentrations (zB 50-200 uM) in den meisten extrazellulären Flüssigkeiten 14,15. Unter physiologischen Bedingungen, Ascorbat in der Regel eine reversible Ein-Elektronen-Oxidation zum Radikal ascorbyl (AFR, auch als monodehydroascorbate oder semidehydroascorbate bekannt). Während der AFR ist ein relativ stabiles Radikal 16, in der Abwesenheit von seiner schnellen Ein-Elektronen-enzymatische Reduktion zurück zu Ascorbat können zwei AFRS disproportioniert einem Ascorbat und ein Dehydroascorbat (DHA) 9,13,17 fördern. Im Inneren der Zelle, die zwei-Elektronen-Oxidationsprodukt von Ascorbat, DHA, schnell wieder auf Ascorbat durch Glutathion und NAD (P) H-abhängige enzymatische und nicht-enzymatische Reaktionen, 13 reduziert werden. Während es klassisch wird akzeptiert, dass Ascorbat einzige bedeutende Rolle im Eisenstoffwechsel ist die Nahrungsaufnahme von Nicht-Häm-Eisen-18 zu stimulieren, die wir und andere zur Verfügung gestellt haben Beweise strongly darauf hindeutet, dass Ascorbat spielt eine stark erweiterte Rolle im Stoffwechsel von diesem Metall. Zunächst erscheint Ascorbat, die durch Ascorbat-voll-Zellen freigesetzt wird, eine wichtige Rolle bei der Modulation der Aufnahme von Nicht-Transferrin-gebundenem Eisen von 19,20 Zellen zu spielen, und sehr neue Hinweise darauf, dass Ascorbat moduliert auch die Aufnahme von Transferrin-gebundenes Eisen von Zellen 21, von denen die letztere entspricht einer physiologischen Haupteisenaufnahmestrecke 22. Ascorbat ist wichtig für die normale Funktion des zentralen Nervensystems bei Säugetieren 23,24. Zusammen mit der Nebennierenrinde, Hypophyse, Thymus, Retina und Gelbkörper enthält das Gehirn hohen Konzentrationen von Ascorbat im Vergleich zu anderen Körpergeweben 23,25-27. Zusätzlich wird die Belichtung beider 28,29 Astrozyten und Neuronen-ähnliche Zellen 30 zu Glutamat bekannt, die Freisetzung von Ascorbat in den extrazellulären Raum, in dem die Auslösung ascorbatE soll helfen Neuronen schützen vor Glutamat-induzierten neuronalen Dysfunktion 31. Während der genaue Mechanismus der Glutamat-induzierten Freisetzung aus Astrozyten Ascorbat unbekannt ist, haben wir vor kurzem legte Beweise, die die Beteiligung der Zelle Schwellungen, die durch Glutamataufnahme verursacht durch die Astrozyten Glutamat und Aspartat-Transporter (GLAST, auch bekannt exzitatorischen Aminosäuretransporter-Isoform 1 [EAAT1 ] beim Menschen) und damit die Aktivierung des Volumens empfindlichen Osmolyten und Anionen-Kanäle (VSOACs), die durchlässig für kleine organische Anionen wie Ascorbat 32. Die molekularen Identitäten der Kanäle in der Plasmamembran VSOAC Bildung beteiligt noch identifiziert werden 33,34. Obwohl viele Assays zur Bestimmung von Ascorbat in biologischen Proben, die spektrophotometrische, fluorometrische und chromatographische Assays 35,36 umfassen entwickelt wurde, gibt es viel Variabilität in der Spezifität, Empfindlichkeit, interference von chemischen Verunreinigungen, effektive linearen Bereich und die Stabilität der Endpunkt Analyten. Zusätzlich können andere wichtige Faktoren, die die Wahl beeinflussen, sind Assay Schnelligkeit, einfache Handhabung und den Zugang zu relativ spezialisierte Ausrüstung wie einer Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC)-Gerät. Hier stellen wir eine einfache und sehr spezifische kolorimetrische Mikrotiterplatten-Assay zur Bestimmung der intrazellulären Ascorbat in kultivierten Zellen, sowie einen separaten Assay zur Bestimmung von Ascorbat-Efflux aus kultivierten Zellen. Letztere Assay zielt darauf ab, das Problem der Unterschätzung der Ascorbat Freisetzung aus den Zellen aufgrund der schnellen Wiederaufnahme des frei Ascorbat durch natriumabhängigen Transport Ascorbat (SVCTs) zu umgehen. Obwohl beide Methoden haben in einigen unserer bisherigen Veröffentlichungen 19,20,32,37,38 erschien, bietet diese Handschrift eine explizite Reihe von Anweisungen und Leitlinien für ihre effiziente Ausführung.

<table><tbody><tr><td>Nunc 96-well flat-bottom plates</td><td>Thermo</td><td>269620</td><td>Any flat-bottom 96-well plate can be used</td></tr><tr><td>Refrigerated benchtop microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td>A non-refrigerated microcentrifuge that has been equilibrated to temperature in a cold room can also be used</td></tr><tr><td>Refrigerated bench-top centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>Swing-bucket</td></tr><tr><td>Bio-Rad Benchmark Plus Microplate Spectrophotometer</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Any microplate spectrophotometer capable of reading at 593 nm can be used and is recommended. If a filter-based plate reader is used, choose the closest wavelength possible and use the standard-curve method.</td></tr><tr><td>Ependorf MixMate (microplate orbital mixer)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>This is a very versatile and reliable microplate mixer and works very well for these assays</td></tr><tr><td>General-purpose buffers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MOPS-buffered saline (MBS); 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;, pH 7.3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MBS + 5 mM D-glucose (MBS/D)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES-buffered saline + 5 mM D-glucose (HBS/D); 137 mM NaCl, 5.2 mM KCl, 1.8 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;bull;2 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 0.8 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;7 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 5 mM D-glucose, 20 mM HEPES-Na&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;, pH 7.3)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell permeabilisation buffer (CPB; 0.1% saponin in PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>General chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-ascorbic acid or sodium L-ascorbate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Highest purity preparations should be obtained</td></tr><tr><td>Dehydro-L-ascorbic acid (DHA) dimer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30790</td><td>Aqueous solutions theoretically yield 2 moles of DHA monomer per mole of DHA dimer</td></tr><tr><td>Cytochalasin B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6762</td><td>Stock solutions prepared in DMSO or ethanol</td></tr><tr><td>Ascorbate oxidase (AO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0157</td><td>Stock solutions (120 U/ml) can be prepared in PBS or MBS and then frozen in aliquots</td></tr><tr><td>Potassium ferricyanide (FIC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>455989</td><td>Trihydrate</td></tr><tr><td>Ferene-S (3-(2-Pyridyl)-5,6-di(2-furyl)-1,2,4-triazine-5&amp;prime;,5&amp;prime;&amp;prime;-disulfonic acid disodium salt)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92940</td><td></td></tr><tr><td>Sodium L-glutamate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td>Prepare a 0.1% stock solution</td></tr><tr><td>Stock solutions for intracellular ascorbate determination assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 M sodium acetate (pH 6.0)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glacial acetic acid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 M citric acid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.3 mM FeCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; in 0.1 M acetic acid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 mM ferene-S</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50% (v/v) acetic acid + 30% (w/v) trichloroacetic acid (TCA)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stock solutions for ascorbate-efflux assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AO (120 U/ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2.4 mM ferene-S</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.12 mM FeCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; in 0.6 mM sodium-citrate</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a rapid and specific microplate assay for the determination of intra- and extracellular ascorbate in cultured cells

Vitamin C (Ascorbat) spielt eine wichtige Rolle bei zahlreichen zellulären Stoffwechsels, von denen viele nur für Licht in den letzten Jahren. Zum Beispiel im Gehirn wirkt Ascorbat in einer neuroprotektiven und neuromodulatorischen Weise, Ascorbat Zyklen zwischen Neuronen und Astrozyten vicinalen beinhaltet - eine Beziehung, die entscheidend für die Homöostase Gehirn Ascorbat zu sein scheint. Darüber hinaus Anzeichen dafür stark darauf hin, dass Ascorbat hat eine stark erweiterte Rolle bei der Regulierung zellulärer und systemischer Eisenstoffwechsel als klassisch anerkannt ist. Die zunehmende Anerkennung der integrale Rolle von Ascorbat in normalen und deregulierte zelluläre Physiologie der Organismen und erfordert eine Reihe von Mitteldurchsatz und hohe Empfindlichkeit analytischer Techniken, die ohne die Notwendigkeit für sehr teure Spezialausrüstung ausgeführt werden können. Hier stellen wir explizite Anweisungen für einen mittleren Durchsatz, spezifische und relativ kostengünstige Mikroassay zur Bestimmung von both intra-und extrazellulären Ascorbat in Zellkultur.

Bestimmung der intrazellulären Ascorbat in kultivierten Suspensionszellen Im ersten Test (Abbildung 1), ist die intrazelluläre Ascorbat bestimmt, nach Ascorbat spezifische (dh, AO-und Kleinschreibung) Reduktion von Ferricyanid zu Ferrocyanid, mit Hilfe der hochempfindlichen Bestimmung von Blutlaugen durch eine zuvor veröffentlichten Verfahren 37. Der Nachweis von Ascorbat auf der kolorimetrischen Chelatisierung von Eisen, die von der Ascorbat-abhängige R...

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A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells

Ascorbat spielt eine wichtige Rolle in zahlreichen zellulären Stoffwechsels, von denen viele nur für Licht in den letzten Jahren. Hier beschreiben wir einen mittleren Durchsatz, spezifisch und kostengünstig Mikrotiterplatten-Assay zur Bestimmung von intra-und extrazellulären Ascorbat in Zellkultur.

Eine schnelle und spezifische Mikroplatten-Assay zur Bestimmung der Intra-und extrazelluläre Ascorbat in kultivierten Zellen

Vitamin C (ascorbate) plays numerous important roles in cellular metabolism, many of which have only come to light in recent years. For instance, within ...

a-rapid-specific-microplate-assay-for-determination-intra

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

13.4K Aufrufe.  University of Sydney.  Ascorbat spielt eine wichtige Rolle in zahlreichen zellulären Stoffwechsels, von denen viele nur für Licht in den letzten Jahren. Hier beschreiben wir einen mittleren Durchsatz, spezifisch und kostengünstig Mikrotiterplatten-Assay zur Bestimmung von intra-und extrazellulären Ascorbat in Zellkultur. 

Serie: A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage by extracellular oxidants. This process of transporting electrons from intracellular reductants to extracellular oxidants is not well defined. Here we present spectrophotometric assays by C2C12 myotubes to monitor tPMET utilizing the extracellular electron acceptors: water-soluble tetrazolium salt-1 (WST-1) and 2,6-dichlorophenolindophenol (DPIP or DCIP). Through reduction of these electron acceptors, we are able to monitor this process in a real-time analysis. With the addition of enzymes such as ascorbate oxidase (AO) and superoxide dismutase (SOD) to the assays, we can determine which portion of tPMET is due to ascorbate export or superoxide production, respectively. While WST-1 was shown to produce stable results with low background, DPIP was able to be re-oxidized after the addition of AO and SOD, which was demonstrated with spectrophotometric analysis. This method demonstrates a real-time, multi-well, quick spectrophotometric assay with advantages over other methods used to monitor tPMET, such as ferricyanide (FeCN) and ferricytochrome c reduction.

The goal of this protocol is to spectrophotometrically monitor trans-plasma membrane electron transport utilizing extracellular electron acceptors and to analyze enzymatic interactions that may occur with these extracellular electron acceptors.

Messung der Trans-Plasma Membran Elektronentransport durch C2C12 Myotubes

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

Forschung

Biochemie

A Comprehensive High-Efficiency Protocol for Isolation, Culture, Polarization, and Glycolytic Characterization of Bone Marrow-Derived Macrophages

Macrophages are among the most important antigen-presenting cells. Many subsets of macrophages have been identified with unique metabolic signatures. Macrophages are commonly classified as M1-like (inflammatory) and M2-like (anti-inflammatory) subtypes. M1-like macrophages are pro-inflammatory macrophages that get activated by LPS and/or pro-inflammatory cytokines such as INF-&#947;, IL-12 &#38; IL-2. M1-like polarized macrophages are involved in various diseases by mediating the host&#39;s defense to a variety of bacteria and viruses. That is very important to study LPS induced M1-like macrophages and their metabolic states in inflammatory diseases. M2-like macrophages are considered anti-inflammatory macrophages, activated by anti-inflammatory cytokines and stimulators. Under the pro-inflammatory state, macrophages show increased glycolysis in glycolytic function. The glycolytic function has been actively investigated in the context of glycolysis, glycolytic capacity, glycolytic reserve, compensatory glycolysis, or non-glycolytic acidification using extracellular flux (XF) analyzers.
This paper demonstrates how to assess the glycolytic states in real-time with easy-to-follow steps when the bone marrow-derived macrophages (BMDMs) are respiring, consuming, and producing energy. Using specific inhibitors and activators of glycolysis in this protocol, we show how to obtain a systemic and complete view of glycolytic metabolic processes in the cells and provide more accurate and realistic results. To be able to measure multiple glycolytic phenotypes, we provide an easy, sensitive, DNA-based normalization method for polarization assessment of BMDMs. Culturing, activation/polarization and identification of the phenotype and metabolic state of the BMDMs are crucial techniques that can help to investigate many different types of diseases.
In this paper, we polarized the na&#239;ve M0 macrophages to M1-like and M2-like macrophages with LPS and IL4, respectively, and measured a comprehensive set of glycolytic parameters in BMDMs in real-time and longitudinally over time, using extracellular flux analysis and glycolytic activators and inhibitors.

This protocol provides detailed and comprehensive methods for the isolation, culture, polarization, and measurement of the glycolytic metabolic state of live bone marrow-derived macrophages (BMDMs). This paper provides step-by-step instructions with realistic visual illustrations for workflow and glycolytic assessment of BMDMs in real-time.

Macrophages are among the most important antigen-presenting cells. Many subsets of macrophages have been identified with unique metabolic signatures. ...

Immunologie und Infektion

Viability Assays for Cells in Culture

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized viability assays are expensive in terms of equipment but can be faster and more objective than manual cell counts. The present report describes the use of three such viability assays. Two of these assays are infrared and one is luminescent. Both infrared assays rely on a 16&#160;bit Odyssey Imager. One infrared assay uses the DRAQ5 stain for nuclei combined with the Sapphire stain for cytosol and is visualized in the 700 nm channel. The other infrared assay, an In-Cell Western, uses antibodies against cytoskeletal proteins (&#945;-tubulin or microtubule associated protein 2) and labels them in the 800 nm channel. The third viability assay is a commonly used luminescent assay for ATP, but we use a quarter of the recommended volume to save on cost. These measurements are all linear and correlate with the number of cells plated, but vary in sensitivity. All three assays circumvent time-consuming microscopy and sample the entire well, thereby reducing sampling error. Finally, all of the assays can easily be completed within one day of the end of the experiment, allowing greater numbers of experiments to be performed within short timeframes. However, they all rely on the assumption that cell numbers remain in proportion to signal strength after treatments, an assumption that is sometimes not met, especially for cellular ATP. Furthermore, if cells increase or decrease in size after treatment, this might affect signal strength without affecting cell number. We conclude that all viability assays, including manual counts, suffer from a number of caveats, but that computerized viability assays are well worth the initial investment. Using all three assays together yields a comprehensive view of cellular structure and function.

Therapeutic compounds are often first examined in vitro with viability assays. Blind cell counts by a human observer can be highly sensitive to small changes in cell number but do not assess function. Computerized viability assays, as described here, can assess both structure and function in an objective manner.

Die Lebensfähigkeit Assays für Zellen in Kultur

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

Biologie

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or eliminated either catalytically or spontaneously. Due to the short life spans of most ROS and the diversity of their sources and subcellular localizations, a complete picture can be obtained only by careful measurements using a combination of protocols. Here, we present a set of three different protocols using OxyBurst Green (OBG)-coated beads, or dihydroethidium (DHE) and Amplex UltraRed (AUR), to monitor qualitatively and quantitatively various ROS in professional phagocytes such as Dictyostelium. We optimised the beads coating procedures and used OBG-coated beads and live microscopy to dynamically visualize intraphagosomal ROS generation at the single cell level. We identified lipopolysaccharide (LPS) from E. coli as a potent stimulator for ROS generation in Dictyostelium. In addition, we developed real time, medium-throughput assays using DHE and AUR to quantitatively measure intracellular superoxide and extracellular H2O2 production, respectively.

We adapted a set of protocols for the measurement of reactive oxygen species (ROS) that can be applied in various amoeba and mammalian cellular models for qualitative and quantitative studies.

Erfassen, Visualisieren und Quantifizierung der Generierung von reaktiven Sauerstoffspezies in einem Modellsystem Amoeba

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

Messung und Analyse von extrazellulären Säureproduktion zu ermitteln glykolytischen Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, prevent fracture. In the interest to both optimize peak bone mass and combat various musculoskeletal diseases (i.e., post-menopausal osteoporosis, anorexia nervosa, type 1 and 2 diabetes mellitus), incredible efforts have been made in the field of bone biology to fully characterize osteoblasts throughout their differentiation process. Given the primary role of mature osteoblasts to secrete matrix proteins and mineralization vesicles, it has been noted that these processes take an incredible amount of cellular energy, or adenosine triphosphate (ATP). The overall cellular energy status is often referred to as cellular bioenergetics, and it includes a series of metabolic reactions that sense substrate availability to derive ATP to meet cellular needs. Therefore, the current method details the process of isolating primary, murine bone marrow stromal cells (BMSCs) and monitoring their bioenergetic status using the Real-time cell metabolic flux analyzer at various stages in osteoblast differentiation. Importantly, these data have demonstrated that the metabolic profile changes dramatically throughout osteoblast differentiation. Thus, using this physiologically relevant cell type is required to fully appreciate how a cell's bioenergetic status can regulate the overall function.

Real-time cell metabolic flux assay measures the oxygen consumption rate and extracellular acidification rate, which corresponds to mitochondrial and glycolytic adenosine triphosphate production, using pH and oxygen sensors. The manuscript explains a method to understand the energy status of osteoblasts and the characterization and interpretation of the cellular bioenergetic status.

Verwendung eines Echtzeit-Zellstoffwechselflussanalysators zur Überwachung der Bioenergetik des Osteoblast

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, ...

Real-Time Analysis of Bioenergetics in Primary Human Retinal Pigment Epithelial Cells Using High-Resolution Respirometry

Metabolic dysfunction of retinal pigment epithelial cells (RPE) is a key pathogenic driver of retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) and proliferative vitreoretinopathy (PVR). Since RPE are highly metabolically-active cells, alterations in their metabolic status reflect changes in their health and function. High-resolution respirometry allows for real-time kinetic analysis of the two major bioenergetic pathways, glycolysis and mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS), through quantification of the extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR), respectively. The following is an optimized protocol for conducting high-resolution respirometry on primary human retinal pigment epithelial cells (H-RPE). This protocol provides a detailed description of the steps involved in producing bioenergetic profiles of RPE to define their basal and maximal OXPHOS and glycolytic capacities. Exposing H-RPE to different drug injections targeting the mitochondrial and glycolytic machinery results in defined bioenergetic profiles, from which key metabolic parameters can be calculated. This protocol highlights the enhanced response of BAM15 as an uncoupling agent compared to carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) to induce the maximal respiration capacity in RPE. This protocol can be utilized to study the bioenergetic status of RPE under different disease conditions and test the efficacy of novel drugs in restoring the basal metabolic status of RPE.

The metabolic status of human retinal pigment epithelial cells (H-RPE) reflects their health and function. Presented here is an optimized protocol for examining the real-time metabolic flux of H-RPE using high-resolution respirometry.

Echtzeitanalyse der Bioenergetik in primären humanen retinalen Pigmentepithelzellen mittels hochauflösender Respirometrie

Metabolic dysfunction of retinal pigment epithelial cells (RPE) is a key pathogenic driver of retinal diseases such as age-related macular degeneration ...

Use of Minimally Invasive Methods to Assess Fuel Utilization and Circadian Rhythms in Older Adults

Aging is associated with multiple physiological changes that contribute synergistically and independently to physical disability and the risk of chronic disease. Although the etiology of age-related physical disability is complex and multifactorial, the decline in mitochondrial function appears to coincide with the progression of functional decline in many older adults. The reason why there is a decrease in mitochondrial function with aging remains elusive, but emerging science indicates that both fuel metabolism and circadian rhythms can influence mitochondrial function.
Recent studies have established that circadian rhythms become disturbed with aging, and that disrupted circadian rhythms have pathological consequences that impact mitochondrial function and overlap with many age-associated chronic diseases. Current quantitative methods for direct assessment of mitochondrial function are invasive and typically require a muscle biopsy, which can pose difficulties with participant recruitment and study adherence, given the perceived levels of potential pain and risk. Thus, an innovative and relatively noninvasive protocol to assess changes in mitochondrial function at the cellular level and circadian patterns in older adults was adapted. Specifically, a real-time metabolic flux analyzer is used to assess the mitochondrial bioenergetic function of white blood cells under differential substrate availability.
The expression of circadian clock genes in white blood cells to cross-correlate with the mitochondrial bioenergetics and circadian rhythm outcomes are also analyzed. It is believed that these innovative methodological approaches will aid future clinical trials by providing minimally invasive methods for studying mitochondrial substrate preference and circadian rhythms in older adults.

A novel and minimally invasive protocol is presented to evaluate the synergistic impact of fuel utilization and circadian rhythms on aging individuals, utilizing peripheral blood mononuclear cells.

Aging is associated with multiple physiological changes that contribute synergistically and independently to physical disability and the risk of chronic ...

Extracellular Flux Assay: A Method for Measuring Metabolic Profile of Cells

Source: Hlozkova K. et al. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/t/58426">Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This protocol provides a biochemical approach for measuring extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR) of primary leukemic cells with extracellular flux assay. The assessment of the metabolic profile of these cells helps to characterize their demands, leading to personalized therapy.

Extrazellulärer Flux-Assay: Eine Methode zur Messung des metabolischen Profils von Zellen

Source: Hlozkova K. et al. Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells. J. Vis. Exp. (2018).
This protocol provides a biochemical ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Krebsforschung

Leukemia

In vitro techniques & assays

Caco-2 Cell Bioassay: An In Vitro Method for Measuring Iron Bioavailability in Complex Food Sources

Source: Glahn, R. P. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/63859">The Caco-2 Cell Bioassay for Measurement of Food Iron Bioavailability.</a> J. Vis. Exp. (2022)
This video demonstrates an in vitro technique to assess iron bioavailability in complex food sources. The technique combines the simulation of human digestion along with iron uptake by differentiated Caco-2 cells. Intracellular ferritin formation acts as a marker for cellular iron uptake.

Caco-2 Cell Bioassay: Eine In-vitro-Methode zur Messung der Bioverfügbarkeit von Eisen in komplexen Nahrungsquellen

Source: Glahn, R. P. The Caco-2 Cell Bioassay for Measurement of Food Iron Bioavailability. J. Vis. Exp. (2022)
This video demonstrates an in vitro ...