Ich danke Jeannie T. Lee für die Betreuung dieses Projekts, als ich im Lee-Labor war, und Tyler Broering für die Bearbeitung des Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch den Basil O'Connor Starter Scholar Award der March of Dimes Foundation und den NIH Grant GM098605 unterstützt.

1.3D Slide-Vorbereitung
<ol><li>Bereiten Sie die folgenden Reagenzien vor:<ol>
<li>CSK Puffer: 100 mM NaCl, 300 mM Saccharose, 10 mM PIPES, 3 mM MgCl2. PH auf 6,8 mit 1 M NaOH einstellen. Bewahren Sie den CSK-Puffer bei 4 °C auf.</li>
		<li>CSK-Puffer mit 0,5% Triton X-100: Fügen Sie 200 l Triton X-100 bis 40 ml CSK-Puffer hinzu. Mischen Sie die Lösung mit Magnetrührer, bis Triton X-100 vollständig aufgelöst ist. Bewahren Sie den CSK-Puffer mit 0,5% Triton X-100 bei 4 °C auf.</li>
		<li>4% Paraformaldehyd (PFA)-PBS, pH 7,4: 4 g PFA in ca. 70-80 ml Wasser auflösen. Um den Auflöseprozess zu beschleunigen, fügen Sie ca. 20 l 4 N NAOH hinzu und halten Sie die Lösung in einem Wasserbad bei 60 °C, bis sich die PFA vollständig aufgelöst hat und die Lösung transparent ist. Dieser Vorgang dauert ca. 1 Std. Nachdem PFA vollständig aufgelöst hat, 10 ml 10x PBS hinzufügen. Stellen Sie das Endvolumen mit Wasser auf 100 ml ein und kühlen Sie die Lösung auf Raumtemperatur (25 °C) ab. Verwenden Sie für jedes neue Experiment eine frisch vorbereitete Lösung. Hinweis: Erhalten Sie eine institutionelle Genehmigung für alle Tierarbeiten und halten Sie sich an die einschlägigen Tierpflegerichtlinien.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Euthanisieren männliche Mäuse. Mit Zangen und Schere, verbrauchen Sie die Hoden von der Maus. Legen Sie die Hoden in PBS (oder RPMI 1640) auf. Führen Sie nach der Entfernung von Hoden schnell die folgenden Schritte 1.3-1.4 aus, um den Abbau der RNA zu verhindern.</li>
	<li>Rupture die Hoden auf einer kleinen Petrischale und entfernen Sie die Tunika albuginea. Entwirren Sie die seminiferous tubulies in PBS auf Eis mit Zangen.</li>
	<li>Mit Zangen mehrere Tubuli (mehrere Tubules ca. 5-10 mm lang) in einen Brunnen einer 4-Well-Schale mit 500 ml CSK-Puffer + 0,5% Triton X-100 auf Eis übertragen und 6 min brüten. Eine Überexposition gegenüber dem CSK-Puffer kann zu einer Unterbrechung der Zellen führen.</li>
	<li>Mit Zangen, übertragen Sie alle Tubuli auf einen Brunnen einer 4-Well-Schale mit 4% PFA-PBS-Lösung. Dieser Schritt kann ohne Stereomikroskop vorgeformt, aber optional verwendet werden. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren. Gleichzeitig beginnen Sie mit der Vorbereitung von 12 Zytospinkammern während der Inkubationszeiten.</li>
	<li>Mit Zangen, übertragen Sie alle Tubuli auf einen Brunnen einer 4-Well-Schale, die PBS enthält. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Auf der Rückseite einer Glasrutsche alle Tubuli in 30 l PBS übertragen (die Oberseite der Rutsche sollte aufgrund kationischer Ladung vermieden werden). Mit den Spitzen von zwei Zangen, reißen Sie die Tubuli in Stücke. Schneiden Sie die Tubuli in horizontaler Richtung, indem Sie Tubules zwischen den Spitzen zweier Zangen schneiden und die Zangen horizontal ziehen. Fahren Sie mit diesem Schritt für ca. 10-20 Sek. fort.</li>
	<li>Mischen Sie die Suspension durch Pipettieren mit einer P20 Pipette.</li>
	<li>Die Suspension in ein Mikrozentrifugenrohr geben, mit PBS auf ca. 1,3 ml verdünnen. Tragen Sie 100 l Suspension auf jede der 12 Zytospinkammern auf (insgesamt 1,2 ml). In diesem Schritt muss die Konzentration der Zellen nicht bestimmt werden.</li>
	<li>Cytospin die Proben bei 2.000 U/min für 10 min bei Raumtemperatur. Nach dem Zytospinnen, trockene Dias auf Laborbank für ein paar Minuten bei Raumtemperatur. Nachdem die Rutschen für einige Minuten vollständig trocknen durften, gehen Sie zum nächsten Schritt.</li>
	<li>Waschen Sie die Dias mit einem Coplin-Glas, das PBS enthält, 5 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Dias in ein Coplin-Glas mit 70% Ethanol übertragen und mindestens 2 min vor Beginn der RNA FISH warten. Die Rutschen sind für einige Wochen in 70% Ethanol bei 4 °C stabil. Zur Langzeitlagerung dehydrieren Sie Dias mit serieller Behandlung mit 80% und 100% Ethanol in Coplin-Gläsern für je 2 min und lufttrocken die Dias vollständig dehydrieren. Bei -80 °C in einer Schiebebox aufbewahren.</li>
</ol>2. Cot-1 DNA Probe Vorbereitung durch Zufällige Primierung
<ol><li>Bereiten Sie die folgenden Reagenzien vor:<ol>
<li>Hybridisierungspuffer: Mischen Sie die verfahrenen Komponenten, um 900 ml Hybridisierungspuffer zu erstellen; diese Lösung wird verwendet, um Sonden zu lagern. Dieser Hybridisierungspufferbestand ermöglicht die Zugabe von 10% Volumen der RNase-Inhibitorlösung (Ribonucleosid Vanadyl Complex) vor der Hybridisierung.<table><tbody>
<tr>
<td>Komponente</td>
					<td>Menge (l)</td>
					<td>Endgültige Konzentration</td>
				</tr>
<tr>
<td>Formamid</td>
					<td>500</td>
					<td>50% (v/v)</td>
				</tr>
<tr>
<td>50% Dextran</td>
					<td>200</td>
					<td>10% (mit/v)</td>
				</tr>
<tr>
<td>20x SSC</td>
					<td>100</td>
					<td>2x</td>
				</tr>
<tr>
<td>1% BSA</td>
					<td>100</td>
					<td>0.1%</td>
				</tr>
</tbody></table>Vor der Hybridisierung 1/10 Vol von 200 mM Ribonucleoside Vanadyl Complex oder Wasser in den Hybridisierungspufferstock geben, um der endgültigen Konzentration zu entsprechen. Bei -20 °C ist diese Mischung seit mehr als einem Jahr stabil.</li>
		<li>20x SSC: 88,2 g Natriumcitrat und 175,3 g NaCl in ca. 800 ml Wasser auflösen. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,0 mit ein paar Tropfen von 1 M HCl ein. Fügen Sie Wasser hinzu, um die endige Lautstärke auf 1 L einzustellen. Sterilisieren durch Autoklavieren. Nach der Zubereitung kann 20x SSC bei Raumtemperatur gelagert werden.</li>
		<li>50% (w/v) Dextran: Wasser rühren und langsam 50 g Dextransulfat hinzufügen. Halten Sie das Rühren über Nacht bei Raumtemperatur. Fügen Sie Wasser hinzu, um das Endvolumen auf 100 ml einzustellen. Bei Raumtemperatur aufbewahren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fügen Sie die unten aufgeführten Bestandteile zu einer PCR-Röhre hinzu. Mit einer PCR-Maschine die Lösung 5 min bei 95 °C mischen und inkubieren.<table><tbody>
<tr>
<td>Komponente</td>
				<td align="center">Menge pro Reaktion (l)</td>
				<td align="center">Finale</td>
			</tr>
<tr>
<td>Kinderbett-1 DNA: 1 mg/ml</td>
				<td align="center">1</td>
				<td align="center">1 g</td>
			</tr>
<tr>
<td>Random 9mer Primer (aus Kit)</td>
				<td align="center">10</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
<tr>
<td>Wasser</td>
				<td align="center">27</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
</tbody></table>
</li>
	<li>Zentrifugieren Sie kurz und legen Sie auf Eis.</li>
	<li>Fügen Sie die folgenden Komponenten hinzu. Mit einer PCR-Maschine 30 min bei 37 °C mischen und inkubieren. (Einzelheiten zum verwendeten Kit finden Sie in der Tabelle der Reagenzien und Ausrüstungen).<table><tbody>
<tr>
<td>Komponente</td>
				<td align="center">Menge pro Reaktion (l)</td>
				<td align="center">Endgültige Konzentration</td>
			</tr>
<tr>
<td>Mischung aus Schritt 2.2</td>
				<td align="center">38</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
<tr>
<td>5x Nukleotidpuffer (vom Kit)</td>
				<td align="center">9.2</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
<tr>
<td>Cy3-dUTP (1 mM)</td>
				<td align="center">0.8</td>
				<td align="center">16 M</td>
			</tr>
<tr>
<td>Klenow (ab Kit)</td>
				<td align="center">2</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
</tbody></table>
</li>
	<li>Fügen Sie 2 l Stop-Puffer (vom Kit) hinzu, um die Reaktion abzubrechen.</li>
	<li>Reinigen Sie die gestoppte Reaktion mit Mikrospinsäulen.</li>
	<li>Fügen Sie der gereinigten Fraktion 50 g Hering-Sperma-DNA (50-fache Überschuss an Schablonen-Cot-1-DNA) hinzu.</li>
	<li>Messen Sie das Gesamtvolumen mit einer Pipette. 0,7x Volumen von 100% Ethanol und 0,1x Volumen von 3 M Natriumacetat (pH 5,2), gut mischen und Zentrifuge für 15 min bei maximaler Geschwindigkeit (17.000 x g) mit einer Mikrozentrifuge bei 4 °C mischen.</li>
	<li>Entfernen Sie die Flüssigkeit, und fügen Sie 200 l 70% Ethanol, gut mischen und Zentrifuge für 5 min bei maximaler Geschwindigkeit bei 4 °C.</li>
	<li>Entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit. Trocknen Sie den Niederschlag für 10-30 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Lösen Sie das Pellet in 20 l Hybridisierungspuffer. Da das Pellet oft schwer aufzulösen ist, Pipette wiederholt. Alternativ kann ein Wirbelmischer auch verwendet werden, um das Pellet effizient aufzulösen. Sonden können bis zum Gebrauch bei -20 °C aufbewahrt werden.</li>
</ol>3. Kinderbett-1 RNA FISH
<ol><li>Fügen Sie die unten aufgeführten Komponenten zu einer PCR-Röhre hinzu. Mit einer PCR-Maschine 10 min bei 80 °C inkubieren, gefolgt von einem Vorglühen von ca. 10-30 min bei 42 °C. Bei 42 °C bis zur Hybridisierung aufbewahren. Ribonucleoside Vanadyl Complex ist optional; es kann durch Wasser ersetzt werden.<table><tbody>
<tr>
<td>Komponente</td>
				<td align="center">Menge pro Reaktion (l)</td>
				<td align="center">Finale</td>
			</tr>
<tr>
<td>Cot-1 DNA-Sonde (50 ng/l)</td>
				<td align="center">2</td>
				<td align="center">100 ng</td>
			</tr>
<tr>
<td>Ribonukleosid Vanadyl Komplex (200 mM)</td>
				<td align="center">2</td>
				<td align="center">20 mM</td>
			</tr>
<tr>
<td>Hybridisierungspuffer</td>
				<td align="center">hinzugefügt zu 20</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
</tbody></table>
</li>
	<li>Dehydrieren gleitet in einem Coplin-Glas mit 80% Ethanol für 2 min, gefolgt von einem Coplin-Glas mit 100% Ethanol für 2 min. Trockenrutschen komplett auf der Laborbank bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Eine Spitzenboxkammer (gefüllt mit 2-3 cm Wasser) in einem 42 °C Inkubator im Voraus vorheizen. Legen Sie die Rutsche auf die Spitzenboxkammer. Kurz zentrifugieren Sie die vorannealed Sonden und Pipette direkt auf die dehydrierten Dias. Vermeiden Sie Blasen zu machen. Bedecken Sie die Rutsche vorsichtig mit einem Deckelschlupf.</li>
	<li>Hybridisieren Sie für 6 Stunden bis über Nacht (14-15 Std.) bei 42 °C.</li>
	<li>Bereiten Sie Waschlösungen in Coplin-Gläsern vor (zwei Gläser mit 2x SSC und 50% Formamid und zwei Gläser mit 2x SSC). Bei 42 °C 30 min im Wasserbad vorheizen.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Rasierklinge, um den Deckelschlupf vom Rand des Schlittens zu entfernen. Vermeiden Sie Kratzproben. Schlitten in einem Coplin-Glas mit 2x SSC und 50% Formamid für 5 min bei 45 °C waschen. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.</li>
	<li>Schlitten in einem Coplin-Glas mit 2x SSC für 5 min bei 45 °C waschen. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.</li>
	<li>Fügen Sie den Dias 20 l DAPI-Montagemedien hinzu und decken Sie sie mit einem Deckbedeckungsbeleg ab. Drücken Sie das Abdeckungsglas vorsichtig, um zusätzliche Montagemedien zu entfernen. Blot zusätzliche Montagemedien mit Reinigungsgewebe. Die Dias sind für die Mikroskopie-Evaluierung bereit.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+drying-down+technique+for+the+spreading+of+mammalian+meiocytes+from+the+male+and+female+germline.">A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline.</a> Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).</li><li>Namekawa, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postmeiotic+sex+chromatin+in+the+male+germline+of+mice.">Postmeiotic sex chromatin in the male germline of mice.</a> Curr Biol. 16, 660-667 (2006).</li><li>Namekawa, S. H., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+nascent+RNA,+single-copy+DNA+and+protein+localization+by+immunoFISH+in+mouse+germ+cells+and+preimplantation+embryos.">Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos.</a> Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).</li><li>Mahadevaiah, S. K., Costa, Y., Turner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+RNA+FISH+to+study+gene+expression+during+mammalian+meiosis.">Using RNA FISH to study gene expression during mammalian meiosis.</a> Methods in molecular biology. 558, 433-444 (2009).</li><li>Hall, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ectopic+human+XIST+gene+can+induce+chromosome+inactivation+in+postdifferentiation+human+HT-1080+cells.">An ectopic human XIST gene can induce chromosome inactivation in postdifferentiation human HT-1080 cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 8677-8682 (2002).</li><li>Huynh, K. D., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+of+a+pre-inactivated+paternal+X+chromosome+in+early+mouse+embryos.">Inheritance of a pre-inactivated paternal X chromosome in early mouse embryos.</a> Nature. 426, 857-862 (2003).</li><li>Namekawa, S. H., VandeBerg, J. L., McCarrey, J. R., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+chromosome+silencing+in+the+marsupial+male+germ+line.">Sex chromosome silencing in the marsupial male germ line.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9730-9735 (2007).</li><li>Namekawa, S. H., Payer, B., Huynh, K. D., Jaenisch, R., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+imprinted+X+inactivation:+repeat+versus+genic+silencing+in+the+mouse.">Two-step imprinted X inactivation: repeat versus genic silencing in the mouse.</a> Mol Cell Biol. 30, 3187-3205 (2010).</li><li>Ichijima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MDC1+directs+chromosome-wide+silencing+of+the+sex+chromosomes+in+male+germ+cells.">MDC1 directs chromosome-wide silencing of the sex chromosomes in male germ cells.</a> Genes Dev. 25, 959-971 (2011).</li><li>Sin, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNF8+regulates+active+epigenetic+modifications+and+escape+gene+activation+from+inactive+sex+chromosomes+in+post-meiotic+spermatids.">RNF8 regulates active epigenetic modifications and escape gene activation from inactive sex chromosomes in post-meiotic spermatids.</a> Genes Dev. 26, 2737-2748 (2012).</li></ol>

Der Autor hat nichts zu verraten.

Bei der 3D-Folienvorbereitung geht der Permeabilisierungsschritt dem Fixierungsschritt voraus. Diese Schritte werden direkt an seminiferen Tubuli durchgeführt, wodurch die dreidimensionale Chromatinstruktur erhalten bleibt. Eine alternative Möglichkeit zur Erhaltung der Chromatinstruktur für RNA/DNA FISH besteht darin, den Permeabilisationsschritt und den Fixierungsschritt gleichzeitig durchzuführen. Diese alternative Technik wurde in Beuteltierkeimzellen und in Mauspräimplantationsembryonen7,8durchgefüh...

In Hoden unterscheiden sich Keimzellen von diploider Spermatogonie durch Meiose zu reifem, haploiden Spermatozoen. Dabei wird die Kernchromatinstruktur von Keimzellen kontinuierlich und dynamisch umgestaltet. Oberflächenbreiten werden häufig für die zytologische Untersuchung einzelner spermatogener Zellen verwendet. Eine vorherrschende Methode der Oberflächenausbreitung verwendet hypotonische Behandlung, durch die einzelne spermatogene Zellen verteilt und abgeflacht werden1. Diese Bedingungen sind optimal für die detaillierte Analyse meiotischer Chromosomen. Chromosomale Merkmale wie synaptische Status und Rekombinationsschwerpunkte sind mit dieser Methode leicht zu beobachten. Die hypotonische Behandlung stört jedoch die subnukleare Chromatinarchitektur, so dass diese Technik nicht für die strukturelle Analyse von Kernen geeignet ist. Daher wurde eine verbesserte Methode entwickelt, um die dreidimensionale Chromatinstruktur von Hodenkeimzellen zu erhalten. Diese Methode wurde als dreidimensionale (3D) Folienmethode bezeichnet (Abbildung 1). Die 3D-Diamethode hat den Nachweis der entstehenden RNA-Lokalisierung in Kernen ermöglicht, da sie ursprünglich optimiert wurde, um Genexpression und Chromatinzustände während der Differenzierung von Hokulären Keimzellen durch RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)2,3zu untersuchen. Diese 3D-Methode ist auch auf die Kombination von Immunfluoreszenz, DNA und RNA FISH anwendbar. Zusätzlich hat diese Methode bei der Entdeckung von postmetiotischem Sexchromatin (PMSC) unterstützt, einem stillen Fach der Geschlechtschromosomen, die in postmetiotischen Spermaatiden gefunden werden2.
Die 3D-Folienmethode wurde ursprünglich durch die Kombination von zwei wesentlichen Schritten der Gleitvorbereitung optimiert, die häufig für die Kernfärbung verwendet werden: der Befestigungsschritt zur Fixierung von Kernmaterialien und der Permeabilisierungsschritt zur Entfernung von zytoplasmatischen Materialien, um die Zugänglichkeit von Färbereagenzien wie Antikörpern und FISH-Sonden zu verbessern. Wie bereits in einer anderen Publikation3beschrieben, wurde festgestellt, dass der Permeabilisierungsschritt dem Fixierungsschritt vorausgehen muss, um optimale Ergebnisse mit niedrigem zytoplasmatischen Hintergrund zu erzielen. Bei dieser 3D-Diamethode werden der Permeabilisierungsschritt und der nachfolgende Fixierungsschritt direkt an seminiferen Tubuli durchgeführt und es folgt die mechanische Dissoziation von Keimzellen mit Zangen vor dem Zytospinnen auf Dias. Eine alternative Methode für RNA FISH von spermatogenen Zellen wurde in einem anderen Labor entwickelt4. Bei dieser Methode muss der Permeabilisierungsschritt im Einklang mit der 3D-Methode dem Fixierungsschritt vorausgehen, um optimale Ergebnisse von RNA FISH zu erhalten.
Das folgende Protokoll beschreibt die 3D-Diamethode und liefert ein Beispiel für eine mögliche Anwendung, Cot-1 RNA FISH zum Nachweis von kernimimten RNAs. Cot-1 DNA besteht aus sich wiederholenden Elementen im Genom. Hierbei wird eine Cot-1-DNA-Sonde zu einem Intron und UTR der entstehenden Transkripte hybridisiert, wodurch die transkriptionsaktiven Regionen im Kern5,6erkannt werden. 3D-Dias sind vielseitig und können auf eine Kombination von Immunfluoreszenz-, DNA- und RNA-FISH-Techniken angewendet werden, um eine detaillierte Untersuchung der räumlichen Beziehungen zwischen Chromatinarchitektur zu erhalten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="562">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Cot-1 DNA&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">18440-016</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stratagene Prime-It Fluor Fluorescence Labeling Kit</td>
			<td style="width:147px;">Agilent</td>
			<td align="right" style="width:119px;">
			300380
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Herring sperm DNA Solution</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td>15634-017</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol, 200 proof (absolute)</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td align="right">111000200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2889</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Formamide deionized</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB00600-00500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium citrate tribasic dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C8532</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:147px;">Lifeblood Medical</td>
			<td style="width:119px;">77110-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp.</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D6001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A10491-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S0389</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6757</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M0250</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T8787</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">76240</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">221465</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4417</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI</td>
			<td style="width:147px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H1200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ribonucleoside-vanadyl complex</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">S1402S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Illustra MicroSpin G-50 Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">27-5330-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:119px;">5424</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Forceps</td>
			<td style="width:147px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">300-050</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:147px;">Bioexpress</td>
			<td style="width:119px;">C-3262-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Cytospin 3</td>
			<td style="width:147px;">Shandon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Coplin jar</td>
			<td style="width:147px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-815</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superfrost /Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-well dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-566-301</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover glass&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-544-G</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:297px;">Air incubator</td>
			<td style="width:147px;">Revolutionary Science</td>
			<td style="width:119px;">RS-IF-203</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

slide preparation method to preserve three-dimensional chromatin architecture of testicular germ cells

Bei der Differenzierung der Hokulären Keimzellen ändert sich die Struktur des Kernchromatins dynamisch. Im Folgenden wird ein Verfahren beschrieben, mit dem die dreidimensionale Chromatinanordnung von Hodenkeimzellen bei Mäusen erhalten werden soll; Diese Methode wurde als dreidimensionale (3D) Folienmethode bezeichnet. Bei dieser Methode werden Hodentubuli direkt mit einem Permeabilisierungsschritt behandelt, der zytoplasmatisches Material entfernt, gefolgt von einem Fixierungsschritt, der Kernmaterialien fixiert. Tubules werden dann dissoziiert, die Zellsuspension ist zytospun, und Zellen haften an Dias. Diese Methode verbessert die Empfindlichkeit gegenüber dem Nachweis subnuklearer Strukturen und ist für die Immunfluoreszenz, DNA und RNA-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (FISH) und die Kombination dieser Nachweismethoden anwendbar. Als Beispiel für eine mögliche Anwendung der 3D-Diamethode wird gezeigt, dass ein Cot-1-RNA-FISH entstehende RNAs erkennt. Die 3D-Diamethode wird die detaillierte Untersuchung räumlicher Zusammenhänge zwischen Chromatinstruktur, DNA und RNA während der Differenzierung von Hodenkeimzellen erleichtern.

Abbildung 2zeigt ein repräsentatives Ergebnis einer 3D-Folie . In diesem Experiment wurde Cot-1 RNA FISH durchgeführt, um eine aufkommende Transkription zusammen mit Derimmunostainierung mit Anti-CBX1- und H2AX-Antikörpern zu erkennen. Um RNA FISH und Immunostaining zu kombinieren, wurde zunächst eine Immunfärbung durchgeführt, gefolgt von RNA FISH, wie in3beschrieben. CBX1 ist ein Heterochromatin-Protein, das pericentromer Heterochromatin und stille Geschlechtschromosomen in der Meiose,...

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Slide Preparation Method to Preserve Three-dimensional Chromatin Architecture of Testicular Germ Cells

Das Material beschreibt hier ein Verfahren, das entwickelt wurde, um die dreidimensionale Chromatinstruktur von Hodenkeimzellen zu erhalten. Dies wurde als dreidimensionale (3D) Folienmethode bezeichnet. Diese Methode verbessert die Empfindlichkeit für den Nachweis subnuklearer Strukturen und ist für die Immunfluoreszenz, DNA und RNA-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (FISH) anwendbar.

Folienvorbereitungsmethode zur Erhaltung der dreidimensionalen Chromatinarchitektur von Hodenkeimzellen

During testicular germ cell differentiation, the structure of nuclear chromatin dynamically changes. The following describes a method designed to preserve ...

slide-preparation-method-to-preserve-three-dimensional-chromatin

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

7.3K Aufrufe.  Cincinnati Children's Hospital Medical Center. Das Material beschreibt hier ein Verfahren, das entwickelt wurde, um die dreidimensionale Chromatinstruktur von Hodenkeimzellen zu erhalten. Dies wurde als dreidimensionale (3D) Folienmethode bezeichnet. Diese Methode verbessert die Empfindlichkeit für den Nachweis subnuklearer Strukturen und ist für die Immunfluoreszenz, DNA und RNA-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (FISH) anwendbar.

Serie: Slide Preparation Method to Preserve Three-dimensional Chromatin Architecture of Testicular Germ Cells

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell cultivation. These technologies offer a wide spectrum of advantages not only for manufacturing but also for different applications. The size and shape of formed cell clusters can be influenced by the exact and reproducible architecture of the microfabricated scaffold and, therefore, the diffusion path length of nutrients and gases can be controlled.1 This is unquestionably a useful tool to prevent apoptosis and necrosis of cells due to an insufficient nutrient and gas supply or removal of cellular metabolites.
Our polymer chip, called CellChip, has the outer dimensions of 2 x 2 cm with a central microstructured area. This area is subdivided into an array of up to 1156 microcontainers with a typical dimension of 300 m edge length for the cubic design (cp- or cf-chip) or of 300 m diameter and depth for the round design (r-chip).2
So far, hot embossing or micro injection moulding (in combination with subsequent laborious machining of the parts) was used for the fabrication of the microstructured chips. Basically, micro injection moulding is one of the only polymer based replication techniques that, up to now, is capable for mass production of polymer microstructures.3 However, both techniques have certain unwanted limitations due to the processing of a viscous polymer melt with the generation of very thin walls or integrated through holes. In case of the CellChip, thin bottom layers are necessary to perforate the polymer and provide small pores of defined size to supply cells with culture medium e.g. by microfluidic perfusion of the containers.
In order to overcome these limitations and to reduce the manufacturing costs we have developed a new microtechnical approach on the basis of a down-scaled thermoforming process. For the manufacturing of highly porous and thin walled polymer chips, we use a combination of heavy ion irradiation, microthermoforming and track etching. In this so called "SMART" process (Substrate Modification And Replication by Thermoforming) thin polymer films are irradiated with energetic heavy projectiles of several hundred MeV introducing so-called "latent tracks" Subsequently, the film in a rubber elastic state is formed into three dimensional parts without modifying or annealing the tracks. After the forming process, selective chemical etching finally converts the tracks into cylindrical pores of adjustable diameter.

We present two processes for the microfabrication of porous polymer chips for three-dimensional cell cultivation. The first one is hot embossing combined with a solvent vapour welding process. The second one uses a recently developed microthermoforming process combined with ion track technology leading to a significant simplification of manufacture.

Microfabrication der Chip-Größe Gerüste für die dreidimensionale Kultivierung der Zellen

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Forschung

Biologie

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

Chromatin Immunopräzipitation von humanen embryonalen Stammzellen

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

Hallo-C: eine Methode, um die dreidimensionale Architektur des Genoms Study.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work has been done using classical two-dimensional cell culture models, which allow for easy cell manipulation. It has become clear that intracellular signaling pathways are affected by extracellular forces, including dimensionality and cell surface tension3-4. Multiple approaches have been taken to develop three-dimensional models that more accurately represent biologic tissue architecture3. While these models incorporate multi-dimensionality and architectural stresses, study of the consequent effects on cells is less facile than in two-dimensional tissue culture due to the limitations of the models and the difficulty in extracting cells for subsequent analysis.
The important role of the microenvironment around tumors in tumorigenesis and tumor behavior is becoming increasingly recognized4. Tumor stroma is composed of multiple cell types and extracellular molecules. During tumor development there are bidirectional signals between tumor cells and stromal cells5. Although some factors participating in tumor-stroma co-evolution have been identified, there is still a need to develop simple techniques to systematically identify and study the full array of these signals6. Fibroblasts are the most abundant cell type in normal or tumor-associated stromal tissues, and contribute to deposition and maintenance of basement membrane and paracrine growth factors7.
Many groups have used three dimensional culture systems to study the role of fibroblasts on various cellular functions, including tumor response to therapies, recruitment of immune cells, signaling molecules, proliferation, apoptosis, angiogenesis, and invasion8-15. We have optimized a simple method for assessing the effects of mammary fibroblasts on mammary epithelial cells using a commercially available extracellular matrix model to create three-dimensional cultures of mixed cell populations (co-cultures)16-22. With continued co-culture the cells form spheroids with the fibroblasts clustering in the interior and the epithelial cells largely on the exterior of the spheroids and forming multi-cellular projections into the matrix. Manipulation of the fibroblasts that leads to altered epithelial cell invasiveness can be readily quantified by changes in numbers and length of epithelial projections23. Furthermore, we have devised a method for isolating epithelial cells out of three-dimensional co-culture that facilitates analysis of the effects of fibroblast exposure on epithelial behavior. We have found that the effects of co-culture persist for weeks after epithelial cell isolation, permitting ample time to perform multiple assays. This method is adaptable to cells of varying malignant potential and requires no specialized equipment. This technique allows for rapid evaluation of in vitro cell models under multiple conditions, and the corresponding results can be compared to in vivo animal tissue models as well as human tissue samples.

A simple method is described for analyzing effects of tissue fibroblasts on associated epithelial cells. The combination of this method and three-dimensional tissue culture can facilitate analysis of cells after isolation from 3D. The technique is applicable to cells of varying malignant potential, allowing systematic study of effects of tumor-associated stroma on tumor cells.

Isolierung von Brustepithelzellen aus dreidimensionalen Mixed-Zelle Spheroid Co-Kultur

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline cells. This heterogeneity is an important drawback concerning the study of the bases of mammalian spermatogenesis, as pure or enriched cell populations in certain stages of sperm development are needed for most molecular analyses1.
 Various strategies such as Staput2,3, centrifugal elutriation1, and flow cytometry (FC)4,5 have been employed to obtain enriched or purified testicular cell populations in order to enable differential gene expression studies. 
It is required that cells are in suspension for most enrichment/ purification approaches. Ideally, the cell suspension will be representative of the original tissue, have a high proportion of viable cells and few multinucleates - which tend to form because of the syncytial nature of the seminiferous epithelium6,7 - and lack cell clumps1 . Previous reports had evidenced that testicular cell suspensions prepared by an exclusively mechanical method clumped more easily than trypsinized ones1 . On the other hand, enzymatic treatments with RNAses and/or disaggregating enzymes like trypsin and collagenase lead to specific macromolecules degradation, which is undesirable for certain downstream applications. The ideal process should be as short as possible and involve minimal manipulation, so as to achieve a good preservation of macromolecules of interest such as mRNAs. Current protocols for the preparation of cell suspensions from solid tissues are usually time-consuming, highly operator-dependent, and may selectively damage certain cell types1,8 . 
	The protocol presented here combines the advantages of a highly reproducible and extremely brief mechanical disaggregation with the absence of enzymatic treatment, leading to good quality cell suspensions that can be used for flow cytometric analysis and sorting4, and ulterior gene expression studies9 .

A novel protocol for the mechanical preparation of testicular cell suspensions from rodent material, avoiding enzymes and detergents, is described. The method is very simple, fast, reproducible, and renders good quality cell suspensions, which are suitable for flow sorting and RNA extraction.

Einfache und effiziente Technik zur Herstellung von Hodenkrebs Zellsuspensionen

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

Eine effiziente Methode zur quantitativen, Einzel-Zell-Analyse von Chromatin Modifikation und Reaktor Architektur in Whole-Mount-Samenanlagen in<em&gt; Arabidopsis</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

Isolierung von spezifischen genomischen Regionen und Identifizierung von assoziierten Moleküle durch enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

FRET-Imaging im dreidimensionalen Hydrogelen

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine system, but the complex structural relationships and three-dimensional (3D) vasculature architectures of the ovary are not well described. In order to visualize the 3D connections and architecture of blood vessels in the intact ovary, the first important step is to make the ovary optically clear. In order to avoid tissue shrinkage, we used the hydrogel fixation-based passive CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/ Immunostaining/In situ-hybridization-compatible Tissue Hydrogel) protocol method to clear an intact ovary. Immunostaining, advanced multiphoton confocal microscopy, and 3D image-reconstructions were then used for the visualization of ovarian vessels and follicular capillaries. Using this approach, we showed a significant positive correlation (P &#60;0.01) between the length of the follicular capillaries and volume of the follicular wall.

Here we present an adaptation of the passive CLARITY and 3D reconstruction method for visualization of the ovarian vasculature and follicular capillaries in intact mouse ovaries.

Dreidimensionale Rekonstruktion der vaskulären Architektur des Eierstocks Passive Klarheit geclearte Maus

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

Adipo-Clear: Ein Gewebe Clearing-Methode für die dreidimensionale Darstellung von Fettgewebe

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...