Wir danken Tzlil Rozenblat, Alexandra Bello und Karl Spuhler für technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von der Vassar College Undergraduate Research Summer Institute (URSI), Lucy Maynard Salmon Research Fund und der NASA-Auszeichnung # NX09AU90A, National Science Foundation Center for Research Excellence in Science and Technology (NSF-CREST) ​​award # 0630388 und NSF unterstützt award # 1058385.

Ein. C. elegans Vorbereitung für Video Analysis <ol><li> Bewegen 10-20 gravid adulte Nematoden an die frische NGM-Agar gefüllte Petrischalen mit einem dünnen, flachen Platindraht Wahl. Die Petrischalen mit der NGM-Agar gefüllt enthalten einen kleinen kreisförmigen Fleck von E. coli (ein Wachstum begrenzte Belastung, OP50, die besten Ergebnisse) für die Nematoden zu essen. Lassen Sie die Nematoden, um Eier für 3-5 Stunden zu legen und entfernen Sie dann die Erwachsenen, wodurch eine kleine, entwicklungspolitisch-synchronisierte Kultur 50-150 Nematoden. Lassen Sie die Nematoden zu frühen Erwachsenenalter durch Inkubation der Petrischalen bei 20 ° C für 4-5 Tage wachsen. Diese Kultur Methoden basieren auf etablierten Verfahren (Stiernagle 2006). 5 </li><li> Am Tag der Videoanalyse, spülen eine Platte von jungen Erwachsenen Nematoden mit 1 ml deionisiertes, destilliertes Wasser, so sammeln 50-150 Würmer aus dem synchronisiert Kultur. Eine Pufferlösung wie M9 oder PBS können ebenfalls verwendet werden. Verwenden Sie eine Mikrozentrifuge die w Spinorms dem Boden des Röhrchens, oder es ihnen ermöglichen, durch Schwerkraft für etwa 15 min absetzen. Entfernen Sie den Großteil des Wassers aus der Tube und ersetzen Sie es mit 1 ml entionisiertem, destilliertem Wasser, um eventuell anhaftende Bakterien aus der Nematoden zu waschen. </li><li> Übertragen Nematoden in Wasser oder Puffer auf eine Quarzküvette mit einer Mikropipette. Es ist wichtig, mit einer geringen Anzahl arbeiten, etwa 5-10 Nematoden insgesamt auf einmal oder sogar weniger, so dass ein Fadenwurm zu einer Zeit ist, die wahrscheinlich vom Laser beleuchtet werden. Wenn die Anzahl von Nematoden auf den Kulturplatten zu groß ist, verdünnt den Würmern in Wasser oder Puffer, bis eine gewünschte Dichte erreicht ist. Es ist auch möglich, einzelne Nematoden zu einem Tropfen Wasser oder Puffer auf einer frischen Agarplatte holen, um sie zu waschen und zu übertragen einzelnen Würmer in die Küvette. In unserer Studie haben wir 1 mm, 2 mm und 5 mm Küvette Größen, die Auswirkungen von physischen Beschränkungen auf Schwimmen Verhalten zu untersuchen. </li></ol> 2. Optischer Aufbau für die Video Analysis <ol><li> Führen Sie ein Setup wie in Abbildung 1 gezeigt, unter Verwendung eines 543 nm (grün) Helium-Neon (HeNe)-Laser, zwei Front-Oberfläche Aluminium Spiegel, einen Küvettenhalter, eine Leinwand, und eine High-Speed-Kamera (Casio High Speed ​​Exilim) Lage der Dreharbeiten bei ~ 240 fps. Die beiden Spiegel verwendet werden, um den Laserstrahl durch die Küvette zu lenken. Unterschiedliche Größen der Küvetten können verwendet werden, abhängig von der Art der Untersuchung sein. Als Beispiel verwendeten wir Küvetten, die 5 mm dick sein, um die Wirkungen von räumlichen Zwängen auf Schwimmen Frequenzen zu erhalten. Der Laserstrahl muss den Anforderungen für Oversampling;. Dh der Organismus nicht mehr als ein Drittel des Laserstrahls zu behindern. Für C. elegans, sollte der Laserstrahl etwa 2 mm im Durchmesser sein, wenn es mit einem Nematoden interagiert. Der Laserstrahl sollte nicht größer als 5 mm im Durchmesser, da das Beugungsmuster wird schwierig zu lokalisieren. Der Abstand von der beugenden Organismus auf dem Bildschirm sollte viel größer alsder Organismus selbst. </li><li> Ort Parafilm über die Oberseite der Küvette und invertieren Sie die Nematoden in die Wassersäule mischen. Setzen Sie die Küvette in einem Küvettenhalter so dass Würmer sind zunächst in der Nähe der Spitze der Küvette. Verwendung der Spiegel, Lenken des Laserstrahls durch die Mitte der Küvette. Weil die Nematoden dichter als Wasser sind, wird sie langsam zu dem Boden der Küvette fallen, während zur gleichen Zeit schwimmen innerhalb der Wassersäule. </li><li> Auf dem Projektionsschirm, Farbe der Fleck entsprechend dem übertragenen Laserstrahls schwarz zu reduzieren Streuung als der Sendestrahl trifft den Projektionsschirm (Abbildung 2). Alternativ setzen eine Öffnung in dem Projektionsschirm, damit der Sendestrahl durch das Sieb passieren. Eliminierung oder Reduzierung Streuung von der Sendestrahl hält den CCD-Arrays der Kamera von sättigenden aufgrund der Sendestrahl. </li><li> Um ein Maß für die Größe des Beugungsmusters erfassen, eine Linie vonetwa 5 cm auf dem Projektionsbildschirm neben der übertragenen Laserstrahlflecks ohne Störung des gebeugten Lichts Bildes. </li><li> Starten Sie die Aufnahme mit der Kamera während der Raum leuchtet auf, so dass die 5 cm Linie auf dem gleichen Material wie die Beugungsbilder ist. Schalten Sie das Raumlicht aus. Rekord Beugungsbilder auf dem Bildschirm mit der Kamera wie Würmer durch den Laserstrahl passieren. </li></ol> 3. Video Data Preparation <ol><li> Installieren Sie Video-Analyse-Programm (Logger Pro: <a href="http://www.vernier.com/products/software/lp/" target="_blank">http://www.vernier.com/products/software/lp/</a> ) auf dem Computer. Importieren Sie das Video in Video-Analyse-Programm </li><li> Stellen Sie den Ursprung mit dem übertragenen Laserpunkt zusammenfallen. Stellen Sie die Waage mit dem 5 cm Linie auf die Projektionsfläche. </li><li> Verfolgen der Winkelverschiebung des Beugungsbildes durch jeden Nematoden mit Hilfe der Video-Analyse-Software ausgebildet (Figur 3) </li><li> Um die Angulation findenr Verschiebung, indem sie die arctan (y / x), Kopieren und Einfügen von Daten in eine Tabellenkalkulation (Excel) und fügen Sie 180 Grad oder π für alle negativen Winkeln, um eine kontinuierliche Kurve (Figure. 4) zu produzieren. </li></ol> 4. Real Time Data Acquisition für Instant Beobachtung Schwimmen Frequenzen <ol><li> Mit dem gleichen Setup wie bei der Video-Analyse, legen Sie eine Photodiode (DET10A von Thorlabs) mit einer kleinen Fläche (~ 1 mm 2) aus der Mitte in dem Beugungsmuster direkt vor der Projektionsfläche. </li><li> Schließen Sie die Photodiode zur digitalen Oszilloskop (PicoScope von Pico Technology hergestellt), die an den Computer über USB-Anschluss verbindet. Beachten Sie die Prügel Muster auf dem Computer-Bildschirm. </li><li> Speichern erworbenen Datensätze im ASCII-oder Text-Format. </li></ol> 5. Data Analysis <ol><li> Importieren Sie die erfassten Daten mit Hilfe von Video-oder die Photodiode in einen Daten-Analyse-Programm in der Lage passende Wellenformen mit Chi-Quadrat-Minimierung. Das Programm dient hier Origin ( <a href="http://www.originlab.com/" target="_blank">http://www.originlab.com/</a> ). Montieren einer Sinuskurve, Bildfehler-Frequenz (4 und 5) zu bestimmen. </li><li> Durchschnittliche Schwimmen Frequenzen aus verschiedenen Proben und bestimmen Varianz. Für diese Studie wurden statistisch analysiert mittels eines Single-Faktor ANOVA, gefolgt von der Bonferroni multiple Vergleiche Tests beobachtet. Ein p-Wert von &lt;0,05 wurde als statistisch signifikant. </li></ol> 6. Modell Beugungsmuster mit Mathematica als Beispiel Hinweis: Beugungsmuster können modelliert mit vielen verschiedenen Rechenwerkzeuge werden. Dieses Verfahren wird für verschiedene Computational Tools wie MatLab, Excel, Origin usw. unterscheiden <ol><li> Image erstellen: Nehmen Sie Bilder von Nematoden auf einem Objektträger mit einem herkömmlichen Mikroskop. </li><li> Binarisieren Bild: Importieren des Wurms image &#39;Worm&#39; into Mathematica, indem Sie das Bild in Mathematica. Wandeln Sie das Bild in ein Schwarz-Weiß-Bild (Binärisierungsverfahren). Dies kann mit der &#39;Binarisieren&#39; Befehl in Mathematica erreicht werden: BlackandWhiteImage = Binarisieren [Worm]. Das Bild kann dann als eine Schwarz-Weiß-Bild angezeigt werden. Alternativ können Sie auch den &quot;EdgeDetect &#39;Befehl, um eine BlackandWhiteImage erstellen: EdgeDetect [Worm, 6.0,0.035], wobei die beiden hinteren Ziffern steuern die Grobheit der entstehenden Kanten. </li><li> Wandelt Bilder in eine Matrix aus Nullen und Einsen: Dies kann mit dem &quot;ImageData &#39;Befehl in Mathematica erreicht werden: Matrix = ImageData [BlackandWhiteImage]. </li><li> Fourier-Transformations-Matrix: Verwenden Sie die &#39;Fourier-Befehl in Mathematica eine Fourier-Transformation der Matrix unter Verwendung der angegebenen FourierParameters: FTransform = Fourier [Matrix, FourierParameters -&gt; {0, -2}]. </li><li> Platz Elastizitätsmodul der Matrix zu erhalten die Beugung Matrix und verbessert den Bildkontrast: Square die absoluteWert der Matrix und das resultierende Bild anzuzeigen, welches das Beugungsmuster entsprechend dem Originalbild ist. Auch die &#39;Log&#39; Funktion, um den Kontrast des Bildes zu skalieren: ImageContrast = Image [Log [1 + (Abs [FTransform]) ^ 2] / 0,5]. </li><li> Resize Bild für einfache Betrachtung: Crop die zentrale Beugungsmuster und die Größe wie gewünscht: ImageResize [ImageContrast [y, 100], 500]. </li><li> Vergleichen Sie die modellierten Beugungsmuster mit Beugungsmuster von frei schwimmende Würmer erhalten. (Abbildung 6) </li></ol>

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	<li>Korta, J., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mahadevan, L., Samuel, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensation+and+mechanical+load+modulate+the+locomotory+gait+of+swimming+C.+elegans.">Mechanosensation and mechanical load modulate the locomotory gait of swimming C. elegans.</a> J. Exp. Biol. 210, (2007).</li><li>James, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A student's guide to Fourier transforms with applications in physics and engineering. , (1995).</li><li>Pierce-Shimomura, J. T., Chen, B. L., Mun, J. J., Ho, R., Sarkis, R., McIntire, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+crawling+and+swimming+locomotory+patterns+in+C.+elegans.">Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 20982-20987 (2008).</li><li>Li, W., Feng, Z., Sternbert, P. W., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C.+elegans+stretch+receptor+neuron+revealed+by+a+mechanosensitive+TRP+channel+homologue.">A C. elegans stretch receptor neuron revealed by a mechanosensitive TRP channel homologue.</a> Nature. 440, 684-687 (2006).</li><li>Stiernagle, T., ed, W. o. r. m. B. o. o. k. ,. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Eells, R., Lueckheide, M., Magnes, J., Susman, K., Rozenblat, T., Kakhurel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Diffraction+Analysis+and+the+Transformation+of+C.+elegans.">Dynamic Diffraction Analysis and the Transformation of C. elegans.</a> , (2011).</li><li>Magnes, J., Raley-Susman, K. M., Melikechi, N., Sampson, A., Eells, R., Bello, A., Lueckheide, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Freely+Swimming+C.+elegans+using+Laser+Diffraction.">Analysis of Freely Swimming C. elegans using Laser Diffraction.</a> O. J. Biphys. , (2012).</li><li>Magnes, J., Raley-Susman, K. M., Sampson, A., Eells, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locomotive+Analysis+of+C.+Elegans+through+Diffraction,+Control+number:+348+Session:+JTuA+-+Joint+FiO/LS+Poster+Session+I+Pres.+number:+JTuA39.">Locomotive Analysis of C. Elegans through Diffraction, Control number: 348 Session: JTuA - Joint FiO/LS Poster Session I Pres. number: JTuA39.</a> , (2010).</li><li>Kim, N., Dempsey, C. M., Kuan, C. J., Zoval, J., O'Rourke, E., Ruvkun, G., Madou, M. J., Sze, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gravity+fource+transduced+by+the+MEC-4/MEC-10+DEG/EnaC+channel+modulates+DAF-16/FoxO+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Gravity fource transduced by the MEC-4/MEC-10 DEG/EnaC channel modulates DAF-16/FoxO activity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 177, 835-845 (2007).</li><li>Park, S., Hwang, H., Nam, S. -. W., Martinez, F., Austin, R. H., Ryu, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Caenorhabditis+elegans+locomotion+in+a+structured+microfluidic+environment.">Enhanced Caenorhabditis elegans locomotion in a structured microfluidic environment.</a> PLOS One. 3, e2550 (2008).</li><li>Keller, H. E., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Objective+Lenses+for+Confocal+Microscopy.">Objective Lenses for Confocal Microscopy.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 145-161 (2006).</li><li>Martin, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> TECHNICAL OPTICS. II, (1950).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir haben einen neuartigen Ansatz zur Echtzeit-Messung von Bewegung und einfachen motorischen Verhaltensweisen in mikroskopischen Organismen wie Nematoden, die nicht erfordert den Einsatz von Mikroskopen entwickelt. 8 Dieser methodologische Ansatz könnte auch für das Studium zahlreiche mikroskopische Organismen wie Protisten genutzt werden. Diese Methode wird nur durch die Wellenlänge des verwendeten Lichts begrenzt. Der Organismus sollte nicht kleiner sein als die Wellenlänge des Lichts. Zusätzlich zu den Kosteneinsparungen und Portabilität der Geräte benötigt wird, ist ein wesentlicher Vorteil dieses Ansatzes die Fähigkeit, Verhalten in Echtzeit und in drei Dimensionen zu messen, ohne die engen Grenzen von Bildebenen unter dem Mikroskop. Es ist auch möglich mit dieser Technik Einflüsse der Gravitation oder zahlreiche andere Bedingungen auf Verhalten, das nicht studiert mit Mikroskop-basierten Ansätzen werden können zu prüfen. 9 So können wir ein besseres Verständnis der Mikroorganismen natürlichen Bewegungsapparates beha zu erreichenviors aus der Enge Objektträger Tröpfchen oder spezialisierte mikrofluidischen Kammern (Park et al, 2008) befreit. 10 Das Fehlen von Informationen in einer Phase Beugungsmuster nicht zum direkten Abrufen des Bildes entsprechend der beugenden Objekts da das Fernfeld-Beugungsmuster proportional zum Quadrat des Absolutwerts der Fouriertransformation ist erlauben. Wir werden daher Berechnen Beugungsmuster von Schnecke Bilder, so daß sie mit den Beugungsstrukturen der frei schwimmende Nematoden (Abbildung 6) zugeordnet werden kann. Dieses Verfahren hat für wirklich frei schwimmende C ergab elegans und kann zu jeder mikroskopischen Arten aufgebracht werden, dass Manöver in einem optisch transparenten Umgebung wie Wasser oder viele verschiedene ionische Lösungen. Konventionelle Mikroskope erlauben nur Studien mit einer fokalen Tiefe in der Größenordnung von Mikrometern. 11 Dies ist aufgrund der begrenztenSchärfentiefe beim Fokussieren Licht: <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/4412/4412eq1.jpg" /> wo die f-Zahl N hat eine wechselseitige Beziehung mit dem Kreis der Verwirrung (c), so dass ein kurzer Brennweite mit einer großen c verbunden ist. 12,13 Während diese Beugung Methode ist sicherlich kein Ersatz für herkömmliche Mikroskopie ist es in der Lage quantitative Ergebnisse schnell, so dass Arten können sogar in Echtzeit bei niedrigen Kosten manipuliert werden liefern. Die Beugungsmuster kann mit jedem Laserpointer erhältlich. Die Beugungsmuster können zu einem reduzierten zeitlichen Auflösung mit einer normalen Digitalkamera gefilmt werden. Während der Benutzer möglicherweise nicht über ein Mikroskop oder eine Fotodiode ohne weiteres verfügbar sind, können wesentliche Teile dieses Experiments wie das Messen und Auswerten Thrashing Frequenzen Beugungsmuster zu extrem niedrigen Kosten durchgeführt werden.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> 543 nm HeNe Laser </td><td> Melles Griot </td><td> LGX1 </td><td> Jeder Laser im sichtbaren Bereich bei weniger als 5 mW verwendet werden. </td></tr><tr><td> 2 Front Surface Aluminum Spiegel </td><td> Thorlabs </td><td> PF10-03-F01 </td><td></td></tr><tr><td> High Speed ​​Exilim Kamera </td><td> Casio </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Quarzküvette </td><td> Starna Cells </td><td> 21/G/5 </td><td></td></tr><tr><td> LoggerPro (Software) </td><td> Vernier </td><td></td><td> <a href="http://www.vernier.com/products/software/lp/" target="_blank">http://www.vernier.com/products/software/lp/</a> </td></tr><tr><td> Mathematica 8 </td><td> Wolfram </td><td></td><td&gt; <a href="http://www.wolfram.com/" target="_blank">http://www.wolfram.com/</a> </td></tr></tbody></table>

quantitative locomotion study of freely swimming micro-organisms using laser diffraction

Böden und Gewässer mikroskopisch kleinen Organismen leben und verhalten sich in einem komplexen dreidimensionalen Umgebung. Die meisten Studien über mikroskopischen Organismus Verhalten, im Gegensatz, durchgeführt wurden, mit Mikroskop-basierte Ansätze, die die Bewegung und das Verhalten zu einem schmalen, fast zweidimensionalen Bildfeld zu begrenzen. 1 Wir präsentieren einen neuartigen analytischen Ansatz, die Echtzeit-Analyse der bietet frei schwimmende C. elegans in einer Küvette ohne Abhängigkeit von Mikroskop-basierten Geräten. Dieser Ansatz umfasst die Verfolgung der zeitlichen Periodizität Beugungsmuster durch Richten von Laserlicht durch die Küvette erzeugt. Wir messen Schwingungsfrequenzen für frei schwimmen Nematoden. Die Analyse der Fernfeld-Beugungsmuster zeigt Hinweise auf die Wellenformen der Nematoden. Beugungsordnung ist der Prozess der Biegung um Licht einem Objekt. In diesem Fall Licht gebeugt durch die Organismen. Die Lichtwellen interferieren und können ad bildeniffraction Muster. Ein Fernfeld-oder Fraunhofer, Beugungsmuster gebildet wird, wenn der Bildschirm-to-Objektabstand ist viel größer als der beugenden Objekts. In diesem Fall kann das Beugungsmuster berechnet (Model) werden unter Verwendung einer Fourier-Transformation. 2 C. elegans sind frei lebende Boden lebende Nematoden, die in drei Dimensionen zu navigieren. Sie bewegen sich beide auf einer festen Matrix wie Boden oder Agar in einer sinusförmigen Bewegungsapparates Muster genannt kriechen und in einer Flüssigkeit in einem anderen Muster als Schwimmen. 3 Die Rollen gespielt von sensorischen Informationen mechanosensorischen, chemosensorischen und thermosensory Zellen, die plastischen Veränderungen regieren Bewegungsapparates vorgesehen Muster und schaltet in den Mustern sind erst am Anfang geklärt werden. 4 Wir einen optischen Ansatz zu beschreiben, messen Nematoden Fortbewegung in drei Dimensionen, die nicht erfordert ein Mikroskop und wird es uns ermöglichen zu beginnen, um die Komplexität von Nematoden Fortbewegung unter verschiedenen co erkundennditions.

<html> Als Beispiel untersuchten wir C. elegans in einer Quarzküvette 1 cm breit, 5 mm dicke und 4 cm hoch Küvette. Abtasten eines einzigen Wurm mit Video-Analyse, ist die durchschnittliche Schwimmen Frequenz von Video-Analyse in einem 5 mm dicken Küvette erhalten etwa 2,5 Hz (Abbildung 4). Ebenso Abtasten eines einzigen Wurm mit dem Echtzeit-Datenerfassung Methode erhalten wir einen Swimming Frequenz von etwa 2,7 Hz (Abbildung 5), mit dem digitalen Oszilloskop (PicoScope). Dieser Vorgang kann für viele Würmer wiederholt werden. Eine detaillierte Studie der frei schwimmende Würmer ergab einen durchschnittlichen Schwimmen Frequenz von 2,37 Hz in einem 5 mm Küvette. 6 Wie erwartet, ist das Schwimmen höheren Frequenz als bei einer kriechenden Schnecke (~ 0,8 Hz). 3 Mit dieser Beugung Methode, die durchschnittliche Schwimmen Frequenzen eines C. elegans, die auf einen Objektträger eingeschlossen ist, wurde festgestellt, dass die zuvor publizierte Wert von 2 Hz übereinstimmen. 1,7 ve_content &quot;&gt; folgenden Prozeduren 3.) und dann 6.) erlaubt für die Modellierung des Schwimmens Beugungsmuster mit Hilfe von Schnecken Bilder mit einem herkömmlichen Mikroskop erhalten. Die modellierten Beugungsmuster verwendet werden, um ein Bad Zyklus der C. elegans simulieren ( Abbildung 6). Ein erfolgreiches Modell besteht aus physikalisch Machbaren aufeinander schwimmen Mustern passend zu den Swimming-Frequenzen. Die Schnecke sollte in der gleichen Form am Ende des baden-Zyklus sein, wie es am Anfang des baden-Zyklus war. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig1.jpg" /> Abbildung 1. Ein grüner HeNe-Laser wurde verwendet, um eine dynamische Beugungsmuster mit Live-C erstellen elegans. Dieses Beugungsmuster wurde bei 240 fps gefilmt. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig2.jpg" /> Abbildung 2. Dra<html> Flügel ein schwarzer Punkt erhöht die Absorption des transmittierten Strahls. Sättigung der Kamera durch Streulicht reduziert wird und das Beugungsmuster sichtbar wird. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig3.jpg" /> Abbildung 3. Screen shot der Video-Analyse-Software (Logger Pro) mit einem Wurm Beugungsmuster, das wird verfolgt wird. <a href="http://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/4412/4412fig3large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig4.jpg" /> Abbildung 4. Video-Daten entsprechend dem Schwimm-Zyklus eines Nematoden in einem 5 mm Küvette. Die Kurvenanpassung zeigt einen Swimming Frequenz von ~ 2,5 Hz. &quot;/&gt; Abbildung 5. Echtzeitdaten entsprechend dem Schwimm-Zyklus eines Nematoden in einem 5 mm Küvette. Die Kurvenanpassung zeigt einen Swimming Frequenz von ~ 2,7 Hz. <img alt="Abbildung 6" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig6.jpg" /> Abbildung 6. Die obere Zeile repräsentiert die tatsächliche Beugungsmuster ist und mit den modellierten Beugungsmuster in der unteren Reihe abgestimmt. Die modellierten Beugungsmuster wurden mit Würmern auf einem Objektträger (mittlere Reihe).

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Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction

Mikroskopische Organismen wie die frei schwimmenden Nematoden<em&gt; C. elegans</em&gt; Leben und verhalten sich in einem komplexen dreidimensionalen Umgebung. Wir berichten über einen neuartigen Ansatz, der Analyse bietet<em&gt; C. elegans</em&gt; Mit Beugungsmuster. Dieser Ansatz umfasst die Verfolgung der zeitlichen Periodizität Beugungsmuster durch Richten von Laserlicht durch eine Küvette erzeugt.

Quantitative Locomotion Study of Frei Schwimmen Mikroorganismen mittels Laserbeugung

Soil and aquatic microscopic organisms live and behave in a complex three-dimensional environment. Most studies of microscopic organism behavior, in ...

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Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated micro-plates. Under these conditions, cells spread and divide in all directions resulting in an inherent variability in cell shape, morphology and behavior. The high cell-to-cell variance of the overall population impedes the success of HCA, especially for drug development. The ability of micropatterns to normalize the shape and internal polarity of every individual cell provides a tremendous opportunity for solving this critical bottleneck 1-2.
To facilitate access and use of the micropatterning technology, CYTOO has developed a range of ready to use micropatterns, available in coverslip and microwell formats. In this video article, we provide detailed protocols of all the procedures from cell seeding on CYTOOchip micropatterns, drug treatment, fixation and staining to automated acquisition, automated image processing and final data analysis. With this example, we illustrate how micropatterns can facilitate cell-based assays. Alterations of the cell cytoskeleton are difficult to quantify in cells cultured on homogenous substrates, but culturing cells on micropatterns results in a reproducible organization of the actin meshwork due to systematic positioning of the cell adhesion contacts in every cell. Such normalization of the intracellular architecture allows quantification of even small effects on the actin cytoskeleton as demonstrated in these set of protocols using blebbistatin, an inhibitor of the actin-myosin interaction.

Adhesive micropatterns that normalize cellular architecture can be used to increase sensitivity in the detection of drug effects, improve reproducibility and simplify automated image acquisition and analysis. Such technology will benefit drug/siRNA screening assays, performed on conventional cell culture supports and consequently suffering from excessive cell-to-cell variability.

Verbesserte Visualisierung und quantitative Analyse von Arzneimittelwirkungen mit mikrostrukturierten Cells

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated ...

Forschung

Biotechnik

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Laser axotomy followed by time-lapse microscopy is a sensitive assay for axon regeneration phenotypes in C. elegans1. The main difficulty of this assay is the perceived cost ($25-100K) and technical expertise required for implementing a laser ablation system2,3. However, solid-state pulse lasers of modest costs (&lt;$10K) can provide robust performance for laser ablation in transparent preparations where target axons are "close" to the tissue surface. Construction and alignment of a system can be accomplished in a day. The optical path provided by light from the focused condenser to the ablation laser provides a convenient alignment guide. An intermediate module with all optics removed can be dedicated to the ablation laser and assures that no optical elements need be moved during a laser ablation session. A dichroic in the intermediate module allows simultaneous imaging and laser ablation. Centering the laser beam to the outgoing beam from the focused microscope condenser lens guides the initial alignment of the system. A variety of lenses are used to condition and expand the laser beam to fill the back aperture of the chosen objective lens. Final alignment and testing is performed with a front surface mirrored glass slide target. Laser power is adjusted to give a minimum size ablation spot (&lt;1um). The ablation spot is centered with fine adjustments of the last kinematically mounted mirror to cross hairs fixed in the imaging window. Laser power for axotomy will be approximately 10X higher than needed for the minimum ablation spot on the target slide (this may vary with the target you use). Worms can be immobilized for laser axotomy and time-lapse imaging by mounting on agarose pads (or in microfluidic chambers4). Agarose pads are easily made with 10% agarose in balanced saline melted in a microwave. A drop of molten agarose is placed on a glass slide and flattened with another glass slide into a pad approximately 200 um thick (a single layer of time tape on adjacent slides is used as a spacer). A "Sharpie" cap is used to cut out a uniformed diameter circular pad of 13mm. Anesthetic (1ul Muscimol 20mM) and Microspheres (Chris Fang-Yen personal communication) (1ul 2.65% Polystyrene 0.1 um in water) are added to the center of the pad followed by 3-5 worms oriented so they are lying on their left sides. A glass coverslip is applied and then Vaseline is used to seal the coverslip and prevent evaporation of the sample.

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Laser axotomy followed by time-lapse imaging is a sensitive way to assay the effects of mutations in C. elegans on axon regeneration. A high quality, but inexpensive, laser ablation system can be easily added to most microscopes. Time lapse imaging over 15 hours requires careful immobilization of the worm.

Der Aufbau eines Low-Budget-Laser Axotomie System, um Axon Regeneration in Study C. elegans</em

Laser axotomy followed by time-lapse microscopy is a sensitive assay for axon regeneration phenotypes in C. elegans1.  The main difficulty of this assay ...

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and pathways as well as its ease of cultivation. Several C. elegans disease models have been reported, including neurodegenerative disorders such as Parkinson's disease (PD), which involves the degeneration of dopaminergic (DA) neurons 1. Both transgenes and neurotoxic chemicals have been used to induce DA neurodegeneration and consequent movement defects in worms, allowing for investigations into the basis of neurodegeneration and screens for neuroprotective genes and compounds 2,3.
Screens in lower eukaryotes like C. elegans provide an efficient and economical means to identify compounds and genes affecting neuronal signaling. Conventional screens are typically performed manually and scored by visual inspection; consequently, they are time-consuming and prone to human errors. Additionally, most focus on cellular level analysis while ignoring locomotion, which is an especially important parameter for movement disorders.
We have developed a novel microfluidic screening system (Figure 1) that controls and quantifies C. elegans' locomotion using electric field stimuli inside microchannels. We have shown that a Direct Current (DC) field can robustly induce on-demand locomotion towards the cathode ("electrotaxis") 4. Reversing the field's polarity causes the worm to quickly reverse its direction as well. We have also shown that defects in dopaminergic and other sensory neurons alter the swimming response 5. Therefore, abnormalities in neuronal signaling can be determined using locomotion as a read-out. The movement response can be accurately quantified using a range of parameters such as swimming speed, body bending frequency and reversal time.
Our work has revealed that the electrotactic response varies with age. Specifically, young adults respond to a lower range of electric fields and move faster compared to larvae 4. These findings led us to design a new microfluidic device to passively sort worms by age and phenotype 6.
We have also tested the response of worms to pulsed DC and Alternating Current (AC) electric fields. Pulsed DC fields of various duty cycles effectively generated electrotaxis in both C. elegans and its cousin C. briggsae 7. In another experiment, symmetrical AC fields with frequencies ranging from 1 Hz to 3 KHz immobilized worms inside the channel 8.
Implementation of the electric field in a microfluidic environment enables rapid and automated execution of the electrotaxis assay. This approach promises to facilitate high-throughput genetic and chemical screens for factors affecting neuronal function and viability.

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

A semi-automated micro-electro-fluidic method to induce on-demand locomotion in Caenorhabditis elegans is described. This method is based on the neurophysiologic phenomenon of worms responding to mild electric fields (&#x201C;electrotaxis&#x201D;) inside microfluidic channels. Microfluidic electrotaxis serves as a rapid, sensitive, low-cost, and scalable technique to screen for factors affecting neuronal health.

Mikrofluidik-basierten electrotaxis für On-Demand-Quantitative Analyse von<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; &#39;Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse and Parkinson&#39;s disease. Acute activation of G&#945;i/o-linked receptors inhibits AC activity, whereas persistent activation of these receptors results in heterologous sensitization of AC and increased levels of intracellular cAMP. Previous studies have demonstrated that this enhancement of AC responsiveness is observed both in vitro and in vivo following the chronic activation of several types of G&#945;i/o-linked receptors including D2 dopamine and &#956; opioid receptors. Although heterologous sensitization of AC was first reported four decades ago, the mechanism(s) that underlie this phenomenon remain largely unknown. The lack of mechanistic data presumably reflects the complexity involved with this adaptive response, suggesting that nonbiased approaches could aid in identifying the molecular pathways involved in heterologous sensitization of AC. Previous studies have implicated kinase and Gb&#947; signaling as overlapping components that regulate the heterologous sensitization of AC. To identify unique and additional overlapping targets associated with sensitization of AC, the development and validation of a scalable cAMP sensitization assay is required for greater throughput. Previous approaches to study sensitization are generally cumbersome involving continuous cell culture maintenance as well as a complex methodology for measuring cAMP accumulation that involves multiple wash steps. Thus, the development of a robust cell-based assay that can be used for high throughput screening (HTS) in a 384&#160;well format would facilitate future studies. Using two D2 dopamine receptor cellular models (i.e.&#160;CHO-D2L and HEK-AC6/D2L), we have converted our 48-well sensitization assay (&#62;20 steps 4-5 days) to a five-step, single day assay in 384-well format. This new format is amenable to small molecule screening, and we demonstrate that this assay design can also be readily used for reverse transfection of siRNA in anticipation of targeted siRNA library screening.

Persistent activation of inhibitory G protein-coupled receptors results in sensitization of adenylyl cyclase signaling. To identify the essential molecular pathways, nonbiased approaches are necessary; however, this strategy requires the development of a scalable cell-based cAMP sensitization assay. Herein, we describe a sensitization assay for small molecule and siRNA screening.

Drug-induzierte Sensibilisierung der Adenylatzyklase: Assay Straffung und Miniaturisierung für Small Molecule-und siRNA-Screening-Anwendungen

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

Menschliches Knorpelgewebe Herstellung unter Verwendung von dreidimensionalen Inkjet-Drucktechnologie

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane (PDMS) Co-axial Flow Focus Device

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper presents a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device capable of generating water/oil/water double emulsions using a coaxial flow focusing geometry that can be fabricated entirely using soft lithography. Similar to emulsion devices using glass capillaries, double emulsions can be formed in channels with uniform wettability and with dimensions much smaller than the channel sizes. Three dimensional flow focusing geometry is achieved by casting a pair of PDMS slabs using two layer soft lithography, then mating the slabs together in a clamshell configuration. Complementary locking features molded into the PDMS slabs enable the accurate registration of features on each of the slab surfaces. Device testing demonstrates formation of double emulsions from 14 &#181;m to 50 &#181;m in diameter while using large channels that are robust against fouling and clogging.

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane PDMS Co-axial Flow Focus Device

Microfluidic double emulsions generation typically involves devices with patterned wettability or custom-fabricated glass components. Here we describe the fabrication and testing of an all polydimethylsiloxane (PDMS) double emulsion generator that does not require surface treatment or complicated fabrication processes, and is capable of producing double emulsions down to 14 &#181;m.

Doppelemulsion Erstellung Mit einem Polydimethylsiloxan (PDMS) Co-Axial Flow Fokus Geräte-

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper ...

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that MicroCT provides quantitative high-resolution three-dimensional (3D) anatomical data non-destructively and longitudinally. Most importantly, with the development of a novel preclinical iodinated contrast agent called eXIA160, functional and metabolic assessment of the heart became possible. However, prior to the advent of commercial MicroCT scanners equipped with X-ray flat-panel detector technology and easy-to-use cardio-respiratory gating, preclinical studies of cardiovascular disease (CVD) in small animals required a MicroCT technologist with advanced skills, and thus were impractical for widespread implementation. The goal of this work is to provide a practical guide to the use of the high-speed Quantum FX MicroCT system for comprehensive determination of myocardial global and regional function along with assessment of myocardial perfusion, metabolism and viability in healthy mice and in a cardiac ischemia mouse model induced by permanent occlusion of the left anterior descending coronary artery (LAD).

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

This method outlines the use of Quantum Micro-Computed Tomography (MicroCT) to assess cardiac morphology, function, perfusion, metabolism and viability with iodinated contrast agent in mice with experimentally-induced myocardial ischemia. The technique can be applied for non-destructive high-throughput longitudinal in vivo imaging of various animal models of human heart disease.

In Vivo quantitative Bewertung der myokardialen Struktur, Funktion, Perfusion und Lebensfähigkeit Mit Herz Micro-Computertomographie

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

Mehrfarbenfluoreszenzdetektion für Droplet Mikrofluidik Verwendung von Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

An Efficient and Reproducible Protocol for Distraction Osteogenesis in a Rat Model Leading to a Functional Regenerated Femur

This protocol describes the use of a newly developed external fixator for distraction osteogenesis in a rat femoral model. Distraction osteogenesis (DO) is a surgical technique leading to bone regeneration after an osteotomy. The osteotomized extremities are moved away from each other by gradual distraction to reach the desired elongation. This procedure is widely used in humans for lower and upper limb lengthening, treatment after a bone nonunion, or the regeneration of a bone defect following surgery for bone tumor excision, as well as in maxillofacial reconstruction. Only a few studies clearly demonstrate the efficiency of their protocol in obtaining a functional regenerated bone, i.e., bone that will support physiological weight-bearing without fracture after removal of the external fixator. Moreover, protocols for DO vary and reproducibility is limited by lack of information, making comparison between studies difficult. The aim of this study was to develop a reproducible protocol comprising an appropriate external fixator design for rat limb lengthening, with a detailed surgical technique that permits physiological weight-bearing by the animal after removal of the external fixator.

This study describes a reproducible and detailed protocol using a newly developed external fixator for distraction osteogenesis (DO) in a femoral rat model which permits physiological weight-bearing by the animal after removal of the external fixator.

Eine effiziente und reproduzierbare Protokoll für Ablenkung Osteogenesis in einem Rattenmodell führt zu einer funktionalen regenerierten Femur

This protocol describes the use of a newly developed external fixator for distraction osteogenesis in a rat femoral model. Distraction osteogenesis (DO) ...

Dual Raster-Scanning Photoacoustic Small-Animal Imager for Vascular Visualization

Imaging of vascular networks on small animals has played an important role in basic biomedical research. Photoacoustic imaging technology has great potential for application in the imageology of small animals. The wide-field photoacoustic imaging of small animals can provide images with high spatiotemporal resolution, deep penetration, and multiple contrasts. Also, the real-time photoacoustic imaging system is desirable to observe the hemodynamic activities of small-animal vasculature, which can be used to research the dynamic monitoring of small-animal physiological features. Here, a dual-raster-scanning photoacoustic imager is presented, featuring a switchable double-mode imaging function. The wide-field imaging is driven by a two-dimensional motorized translation stage, while the real-time imaging is realized with galvanometers. By setting different parameters and imaging modes, in vivo visualization of small-animal vascular network can be performed. The real-time imaging can be used to observe pulse change and blood flow change of drug-induced, etc. The wide-field imaging can be used to track the growth change of tumor vasculature. These are easy to be adopted in various areas of basic biomedicine research.

A dual raster-scanning photoacoustic imager was designed, which integrated wide-field imaging and real-time imaging.

Dual Raster-Scanning Photoakustischer Kleintier-Imager für Vaskuläre Visualisierung

Imaging of vascular networks on small animals has played an important role in basic biomedical research. Photoacoustic imaging technology has great ...

Quantitative Locomotion Study of Frei Schwimmen Mikroorganismen mittels Laserbeugung

Zusammenfassung

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