Wir sind dankbar, S. Taylor für die Bereitstellung der pLPCX-Histone H2-GFP-Plasmid. Wir danken R. Mertelsmann für die kontinuierliche Unterstützung. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft unterstützt.

Ein. Seeding der U2OS-basierte Cyclin B-SNAP Reporter Cells (Clone 11 Cells 6) auf Mikroskop Chamber Slides <ol><li> Trypsinieren subkonfluenten SNAP Reporter Zellen, die erlaubt, asynchron wachsen in log-Phase für mindestens 48 h wurden. </li><li> Arbeiten mit 8 gut Mikroskop Kammern (konstante Verteilung der Zellen). </li></ol> Zum Beimpfen von Zellen auf 8-Well-Mikroskop-Kammern mit einer konstanten Verteilung über die gesamte Fläche des Mikroskops Kammer Zentrifuge 10.000 Zellen und Resuspendieren in 350 ul Phenolrot-freiem normalem Wachstumsmedium (ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum, Penicillin / Streptomycin und Natriumpyruvat). Übertragen Zellsuspension zum Mikroskop Kammer (Abbildung 2). Arbeiten mit 8 gut Mikroskop Kammern (maximale Zelldichte in der Mitte). Zum Beimpfen von Zellen in einer höheren Dichte im Zentrum des Mikroskops chambäh, laden Sie die Kammer mit 300 ul Phenolrot-freiem normalem Wachstumsmedium. Hinzufügen 5.000 Zellen vorsichtig auf die Mitte des Mikroskops Kammer (Abbildung 2). Arbeiten mit 96 auch spezielle Optik Platten (konstante Verteilung der Zellen). Zum Beimpfen von Zellen auf 96-Well-Platten bei einer konstanten Verteilung über die gesamte Oberfläche des Bohrlochs, zentrifugieren 5.000 Zellen und Resuspendieren in 300 ul Phenolrot-freiem normalen Wachstumsmedium. Übertragen der Zellsuspension auf eine 96-Well-Platte. Abhängig von der Gesamtzahl der Zellen enthaltende Bohrungen Bedarf die Zellzahl und das Gesamtvolumen des Suspensionsmediums (Abbildung 2). Arbeiten mit 96 auch spezielle Optik Platten (maximale Zelldichte in der Mitte). Für die Aussaat von Zellen auf 96-Well-Platten, vorsichtig 1.500 Zellen in 15 ul Phenolrot-freiem normalem Wachstumsmedium in einem small Tropfen auf die Mitte jeder Vertiefung zur Beschränkung Zellwachstum zu erreichen, um die Mitte der Wanne (Abbildung 2). <ol start="3"><li> Lassen ausgesäten Zellen für mindestens 18 Stunden unter Standardbedingungen Zellkultur Bedingungen (37 ° C, 100% Luftfeuchtigkeit, 5% CO 2) zu wachsen. </li></ol> 2. Die Färbung der Reporter Zellen mit SNAP Substrate <ol><li> 30 Minuten vor dem Beginn des Färbeverfahrens ermöglichen Aliquots von Phenolrot-frei normalen Wachstumsmedium zum Aufwärmen auf 37 ° C. </li><li> Für die einfache Handhabung des SNAP Substrat (in unserem Fall TMR Star) aufzulösen TMR Star in DMSO, um eine Konzentration in der Stammlösung von 400 uM, die bei -20 ° C gelagert werden erhalten </li><li> Vor dem Färben, verdünnte 0,5 ul TMR-Sterne-Stammlösung in 200 ul Phenolrot-freiem normalem Wachstumsmedium (37 ° C), um eine endgültige Kennzeichnung Konzentration von 1 uM erhalten. </li><li> Entfernen normalem Wachstumsmedium von den asynchron wachsenden Zellen und Inkubation in lAbeling Medium für 25 min unter Standard-Kulturbedingungen. </li><li> Entfernen Etikettieren Medium und Waschen Zellen viermal mit Phenolrot-freiem normalem Wachstumsmedium (37 ° C). Inkubieren Zellen in 300 ul Phenolrot-freiem normalem Wachstumsmedium (37 ° C) für 30 min. Vor dem Transport zu dem Mikroskop ersetzen das Medium mit frischem Phenolrot-freiem normalem Wachstumsmedium (37 ° C), um restliche ungebundenen SNAP Substrat zu entfernen. </li><li> Transport-Zellen mit dem Mikroskop in einem Styropor-Box auf einem vorgewärmten (37 ° C) Heizblock gegen Temperaturschwankungen zu minimieren. </li></ol> 3. Messung der Fluoreszenzintensität <ol><li> Zwei Stunden vor der Analyse einstellen Lufttemperatur der Klimakammer bei 37 ° C in trockenem Modus, um das gesamte Mikroskop mit all seinen Komponenten auf die gewünschte Temperatur zu bringen. Vorheizen, bevor Sie die Luftfeuchtigkeit ist wichtig, Kondensation und anschließende Beschädigung des Mikroskops zu vermeiden. </li><li> Passen Luftfeuchtigkeit to 60% und CO 2 bis 5% vor dem Beginn der Analyse. </li><li> Starten Sie den Scan ^ R Acquisition Software und definieren Standard-Einstellungen (siehe Tabelle 1). </li><li> Werden die Stellen der Vertiefungen analysiert werden. </li><li> Definieren Sie die At (Übernahme Zykluszeit) und die absolute Zahl der Erwerbs-Zyklen. </li><li> Wenn die Analyse einer größeren Anzahl von Brunnen gewünscht wird, wählen Sie Hardware Autofokus, sonst ist es ausreichend, um Software-Autofokus-alone verwenden. </li><li> Starten Sie die Aufnahme und Überwachung in den ersten beiden Erfassungszyklen. Das Mikroskop ist am Histon H2-GFP-Signal zu konzentrieren, mit anschließender Übernahme eines ersten Bildes in diesem Kanal, bevor der Filter gewechselt wird und der entsprechende TMR Stern Bild aufgenommen wird (Abbildung 3). Dies wird dann für alle Positionen innerhalb einer Vertiefung und für jede der Mulden zu untersuchenden wiederholt, vor der Wiederholung erneut den nächsten Zyklus. </li></ol> 4. Analyse der proteolytischen Profile usingen Scan ^ R <ol><li> Starten Sie den Scan ^ R-Analyse-Software und analysieren die Bilder mit den Zellkernen, wie visualisiert Histon H2-GFP, als Haupt-Objekt definiert, mit einer Schwelle von Signalintensität und einer Wasserscheide-Algorithmus, um die Trennung benachbarter Zellen unterstützen basiert. Ein Unterobjekt, bestehend aus einem Kern mit Zytoplasma sollte TMRstar Analyse erstellt werden. (Wichtige Eigenschaften des Hauptobjekts sind X und Y-Positionen, Zeit und maximalen und mittleren Intensitäten der GFP für die Haupt-Objekt und die gesamte Intensität Bereich für die TMRstar Unterobjekt unterteilt.) Diese Analyse kann einige Stunden wegen großer Datenmengen Mengen. </li><li> Ändern Sie den Modus zu verfolgen, um die subobject mittlere TMR-Sterne Fluoreszenzintensität über die Zeit (Zelle Spuren), zugeordnet zu den analysierten wichtigsten Objekte (Abbildung 4) zu visualisieren. Die Anzahl der zu untersuchenden Zellen lassen sich nach Gating auf diesen Messungen Laufzeit von mindestens 140 Zyklen und mit einer hohen maximalen Lichtstärke von H2-GFP verengt werden. Suchenbei größeren Anzahlen von Zellen ermöglicht eine erste repräsentative und objektive Sicht (Abbildung 4). </li><li> Wählen Sie eine Zelle Spur von Interesse Histon H2-GFP-und TMR-Sterne-Fluoreszenz gleichzeitig an der einzelnen Zelle (5A) zu visualisieren. </li><li> Mit der rechten Maustaste auf eine Zelle von Interesse und erzeugen eine ausführbare Bildergalerie zur Illustration von Histon H2-GFP und Cyclin B-SNAP TMR Star für jeden einzelnen Zeitpunkt. </li><li> Wechseln Sie in der Bevölkerung Modus des Scan ^ R Analysesoftware und Tor in der Region, wo die Zelle von Interesse auf der X vs Y dot plot (5B) vertreten ist. </li><li> Tragen Sie einen neuen Punkt Plot-Fenster auf die gated Region und visualisieren meine TMR-Sterne Fluoreszenzintensität über die Zeit (Abbildung 5C). </li><li> Exportieren von Daten (Zeit und Fluoreszenz-Intensität), um Microsoft Excel zur weiteren Berechnung. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Feigeure 5D und 5E zeigen Cyclin B Kinetik, durch einen Stern TMR Fluoreszenzintensität Kurve dargestellt, mit einer Zelle, die durch einen regelmäßigen verläuft Mitose ohne Anzeichen einer chromosomalen Fehlausrichtung (5E). Nach der Verdichtung des Cytoplasmas nach Kernhülle Aufteilung (NEBD, wie durch den roten Dreieck gekennzeichnet) zeigt TMR-Sterne Fluoreszenzintensität einen abrupten Anstieg bis die isomorph Fenster (heller Bereich in der Abbildung) ist erreicht, wenn die Zelle in Prometaphase 6. Fluoreszenzintensität bleibt auf einem stabilen Niveau, solange die Zelle durchläuft und Prophase Metaphase und dann beginnt schnell einmal fallen alle Chromosomen eines stabilen Metaphaseplatte festgelegt (Figur 5D und 5E). Dieser Rückgang voraus Trennung der Chromosomen während der Anaphase (blauer Punkt auf der Kurve). Im späten Mitose das Chromatin beginnt decondense (blaue Balken) und die Zelle nimmt Interphase Morphologie während die Fluoreszenzintensität Kurve nähert sich einPlateau, das niedriger als das Plateau vor der Mitose (5D und 5E) ist. <table border="1"><tbody><tr><td> Autofokus-Einstellungen </td><td> Histone H2-GFP (Hauptobjekt Akquisition Einstellungen) </td><td> Cyclin B-SNAP mit TMR Stern markiert (Erwerb Einstellungen) </td><td> Erfassungszykluszeit Wiederholungen </td></tr><tr><td> Grob Autofokus + / -39 um 24 Layers Feine Autofokus + / -5,4 Um 14 Layers </td><td> GFP Filter gesetzt: Belichtungszeit: 100 ms Lichtstärke: 25% </td><td> TRITC Filter gesetzt: Belichtungszeit: 150 ms Lichtstärke: 33,3% </td><td> 2 bis 5 min. </td></tr><tr><td> GFP Filter gesetzt: Belichtungszeit: 12 ms Lichtstärke: 12,5% </td><td></td><td></td><td> Bis zu 48 h an fortgesetzte Analyse (begrenzt durch reduzierte Luftfeuchte von 60%) </td></tr></tbody&gt; </table> Tabelle 1. Standardeinstellungen für Analysen von Cyclin B Proteolyse verwendet. Histone H2-GFP wurde als Referenz verwendet, um die Struktur Fokusebene zur Messung von Cyclin B-SNAP Fluoreszenzintensität definieren. Lichtintensitäten während der Fokussierung Verfahrens sind niedriger als bei der Bildaufnahme Einstellungen gegenüber kumulativen Phototoxizität zu vermeiden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung der Messung von Cyclin B Proteolyse durch Expression eines chimären Cyclin B Derivates Abbaueigenschaften ähnlich dem endogenen Protein. Der Rückgang der Fluoreszenzintensität nach Pulse-Chase-Markierung ist ein Maß für APC / C-Aktivität. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig2.jpg" /> Abbildung 2. Analyse von Zellen auf 8 gut Dias oder 96-Well-Platten. Regelmäßige Verteilung derZellen in der Oberfläche des Bohrlochs durch Resuspension in einem Endvolumen von 300 ul erreicht und wird empfohlen, wenn nur ein einzelner oder weniger Positionen für eine Analyse manuell definiert werden. Anreicherung von Zellen im mittleren Bereich wird durch Zugabe von Zellen zu dem Zentrum der vorgefüllten oder leeren Vertiefungen erreicht. Diese Technik wird im Falle einer automatisierten Bildaufnahme in verschiedenen Vertiefungen empfohlen. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig3.jpg" /> Abbildung 3. Ablauf der Datenerfassung. A) Nachweis von Histon-H2-GFP ist für Fokusebene Definition und Überwachung von chromosomalen Ausrichtung während der Mitose verwendet. B) Fluoreszenzintensität des TMR Stern Fluoreszenzintensität ist ein Maß für den absoluten Betrag der Pulse-Chase-markierten Cyclin B-SNAP. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig4.jpg" /> Abbildung 4. Vertreter Scan ^ R Analysis Software-basierte Darstellung der mittleren TMR SternFluoreszenzintensitäten (insgesamt TMRstar Intensität geteilt durch Fläche) über die Zeit. Auswahl einer repräsentativen Zelle Spur (blau). Die entsprechenden Bilder (siehe rechts) ermöglichen die gleichzeitige Darstellung von Histon H2-GFP (grün) und Cyclin B-SNAP (rot). <a href="http://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/4239/4239fig4large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig5.jpg" /> Abbildung 5. A + B) Beispiel für Gating von Punkten, die eine Zelle von Interesse auf der XY-Punkt-Diagramm. C) Visualisierung der mittleren TMRstar Fluoreszenzintensität (insgesamt TMRstar Intensität geteilt durch Fläche) im Laufe der Zeit mit der Dot-Plot. D + E) Vertreter Fluoreszenzintensität Kurve von Cyclin B-SNAP mit isomorph Fenster (brigher Feld auf dem Diagramm) zwischen NEBD (Kernhülle Aufteilung) und Chromatindekondensation (blauer Balken) als in Microsoft Excel erzeugt. Anaphase durch t angedeutetEr blauen Punkt auf der Kurve. <a href="http://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/4239/4239fig5large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . Movie 1. <a href="http://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/4239/4239movie1.avi" target="_blank">Klicken Sie hier, um zusätzliche Film anzusehen</a> .

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	<li>Musacchio, A., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle-assembly+checkpoint+in+space+and+time.">The spindle-assembly checkpoint in space and time.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 379-393 (2007).</li><li>Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregating+sister+genomes:+the+molecular+biology+of+chromosome+separation.">Segregating sister genomes: the molecular biology of chromosome separation.</a> Science. 297, 559-565 (2002).</li><li>Cahill, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+mitotic+checkpoint+genes+in+human+cancers.">Mutations of mitotic checkpoint genes in human cancers.</a> Nature. 392, 300-303 (1998).</li><li>Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+instabilities+in+human+cancers.">Genetic instabilities in human cancers.</a> Nature. 396, 643-649 (1998).</li><li>Fletcher, D. A., Mullins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+mechanics+and+the+cytoskeleton.">Cell mechanics and the cytoskeleton.</a> Nature. 463, 485-4892 (2010).</li><li>Schnerch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+APC/C+activity+in+the+presence+of+chromosomal+misalignment+in+unperturbed+cell+populations.">Monitoring APC/C activity in the presence of chromosomal misalignment in unperturbed cell populations.</a> Cell Cycle. 11, (2012).</li><li>Keppler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo.">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nat. Biotechnol. 21, 86-869 (2003).</li><li>Jansen, L. E., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+centromeric+chromatin+requires+exit+from+mitosis.">Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis.</a> J. Cell. Biol. 176, 795-805 (2007).</li><li>Malureanu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc20+hypomorphic+mice+fail+to+counteract+de+novo+synthesis+of+cyclin+B1+in+mitosis.">Cdc20 hypomorphic mice fail to counteract de novo synthesis of cyclin B1 in mitosis.</a> J. Cell Biol. 191, 313-329 (2010).</li><li>Mena, A. L., Lam, E. W., Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+spindle-assembly+checkpoint+response+requires+de+novo+transcription+and+translation+of+cyclin+B1.">Sustained spindle-assembly checkpoint response requires de novo transcription and translation of cyclin B1.</a> PLoS One. 5, (2010).</li><li>Wolthuis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc20+and+Cks+direct+the+spindle+checkpoint-independent+destruction+of+cyclin.">Cdc20 and Cks direct the spindle checkpoint-independent destruction of cyclin.</a> A. Mol. Cell. 30, 290-302 (2008).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir stellen Ihnen hier eine Live-Cell-Imaging-basierten Ansatz erleichtert die gleichzeitige Überwachung von Cyclin B Proteolyse und Chromosom Ausrichtung. Dieser Ansatz ermöglicht die Untersuchung der mitotischen Kontrolle in ungestörten Zellpopulationen an der einzelnen Zelle. Cyclin B Abbaukurven erleichtern direkten Einblick in die Aktivität des APC / C und damit indirekt geben den Status des SAC 6. Dieser Ansatz, obwohl gegründet basierend auf dem Scan ^ R-Software, kann...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Produkts </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Reporter-Zelllinie </td><td> generiert in-house wie beschrieben 6 </td><td> Klon 11 Reporterzellen (U2OS basierenden Cyclin B-SNAP exprimierende Zellen) </td><td></td></tr><tr><td> Retrovirale Cyclin B-SNAP Expressionsvektor </td><td> generiert in-house wie beschrieben 6 </td><td> pLNCX2-Cyclin B mut5-SNAP </td><td></td></tr><tr><td> Phenolrot-freiem DMEM </td><td> Gibco </td><td> 21063-029 </td><td> Supplementierung mit FCS, Natriumpyruvat, Penicillin / Streptomycin-mycin erforderlich </td></tr><tr><td> SNAP-Cell TMR-Star </td><td> New England Biolabs </td><td> S9105S </td><td> Stammlösung 400 uM in DMSO </td></tr><tr><td> Besondere Opstics Plate, 96 well </td><td> Costar </td&gt; <td> 3720 </td><td></td></tr><tr><td> μ-Slide 8 gut, ibiTreat </td><td> Ibidi </td><td> 80826 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskopie-Einheit </td><td> Olymp </td><td> IX-81 inverse Mikroskop mit Klimakammer </td><td></td></tr><tr><td> Ziel </td><td> Olymp </td><td> UPLSAPO 20x-Objektiv (NA 0,75) </td><td></td></tr><tr><td> Acquisition Software </td><td> Olymp </td><td> Scan ^ R Acquisition Software (v.2.2.09) </td><td></td></tr><tr><td> Analyse-Software </td><td> Olymp </td><td> Scan ^ R Analysis Software (v.1.2.0.6) </td><td></td></tr></tbody></table>

studying proteolysis of cyclin b at the single cell level in whole cell populations

Gleichmäßige Verteilung der Chromosomen auf die beiden Tochterzellen bei der Zellteilung ist eine Voraussetzung für die Gewährleistung der genetischen Stabilität 1. Ungenauigkeiten bei der Trennung der Chromosomen sind ein Markenzeichen der Bösartigkeit und mit fortschreitender Erkrankung 2-4. Die Spindelanordnung Prüfpunkt (SAC) eine mitotische Überwachungsmechanismus zurückhält, die Zellen in der Metaphase bis jeder einzelnen Chromosom eine stabile Befestigung an der bipolaren mitotischen Spindel 1 hergestellt wurde. Der SAC übt seine Funktion durch Interferenz mit der aktivierenden APC / C-Untereinheit Cdc20 Proteolyse des Securin und Cyclin B und damit Trennung der Chromosomen und mitotische Ausfahrt blockieren. Bei unsachgemäßer Befestigung von Chromosomen verhindert Silencing SAC-Signalisierung und führt fort Hemmung der APC / C Cdc20, bis das Problem behoben ist auf Chromosom missegregation, Aneuploidie und bösartigen Neubildungen 1 zu vermeiden. Die meisten Studien, die die i adressiertnfluence unsachgemäßer chromosomale Befestigung an APC / C-abhängige Proteolyse nutzte der Spindel Störungen mit Depolymerisation oder Mikrotubuli-stabilisierende Medikamente mit chromosomalen Bindung an Mikrotubuli stören. Da Störungen Mikrotubuli Kinetik des Transports und Lokalisierung der kritischen Regulatoren beeinflussen können, tragen diese Verfahren ein Risiko der Induktion künstliche Effekte 5. Um zu untersuchen, wie die SAC mit APC / C-abhängige Proteolyse von Cyclin B stört während der Mitose in ungestörten Zellpopulationen, haben wir ein Histon H2-GFP-basiertes System, das erlaubt die gleichzeitige Überwachung von Metaphase Ausrichtung der mitotischen Chromosomen und Proteolyse von Cyclin B 6 . Einen proteolytischen Profile darstellen, erzeugten wir eine chimäre Cyclin B Reportermolekül mit einem C-terminalen SNAP-Einheit 6 (Abbildung 1). In einem Self-Labelling Reaktion ist der SNAP-Einheit in der Lage, kovalente Bindungen mit bildenAlkylguanin-Trägern (SNAP Substrat) 7,8 (Abbildung 1). SNAP Substratmolekülen sind leicht verfügbar und führen ein breites Spektrum verschiedener Fluorochrome. Chimäres Cyclin B-SNAP-Moleküle geworden markierten bei Zugabe des Membran-permeablen Substrat SNAP zum Wachstumsmedium 7 (Abbildung 1). Nach der Markierungsreaktion sinkt die Cyclin B-SNAP Fluoreszenzintensität in einem Puls-Chase-Reaktion-artig und Fluoreszenzintensitäten reflektieren Ebenen von Cyclin B Abbau 6 (Abbildung 1). Unserem System erleichtert die Überwachung der mitotischen APC / C-abhängige Proteolyse in einer großen Anzahl von Zellen (oder mehrere Zellpopulationen) parallel. Dabei kann das System ein wertvolles Werkzeug, um Agenten / kleine Moleküle, die in der Lage, mit proteolytischer Aktivität in der Metaphase stören den Übergang Anaphase zu identifizieren sein. Darüber hinaus hat die Synthese von Cyclin B während der Mitose kurzem als wichtiges mechanis vorgeschlagen wordenm bei der Förderung eines mitotischen Block in Mäusen und Menschen, indem sie Cyclin B Expression stabiler 9,10, aktiviert dieses System uns Cyclin B Proteolyse als ein Element eines ausgewogenen Gleichgewichts 6 analysieren.

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Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Metaphase zur Anaphase Übergang durch Anaphase-promoting complex (APC / C)-abhängige Ubiquitinierung und anschließende Zerstörung von Cyclin B. Hier haben wir ein System, das Pulse-Chase-Kennzeichnung nach, ermöglicht die Überwachung Cyclin B Proteolyse im gesamten Zellpopulationen und wird ausgelöst, erleichtert den Nachweis von Störungen durch den mitotischen Checkpoint.

Studieren Proteolyse von Cyclin B an der Single Cell Level in Whole Cell Populationen

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

10.4K Aufrufe.  University Medical Center Freiburg. Metaphase zur Anaphase Übergang durch Anaphase-promoting complex (APC / C)-abhängige Ubiquitinierung und anschließende Zerstörung von Cyclin B. Hier haben wir ein System, das Pulse-Chase-Kennzeichnung nach, ermöglicht die Überwachung Cyclin B Proteolyse im gesamten Zellpopulationen und wird ausgelöst, erleichtert den Nachweis von Störungen durch den mitotischen Checkpoint.

Serie: Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those populations. Single-cell gene expression measurements can help assess the role of noise in gene expression, identify correlations in the expression of pairs of genes, and reveal subpopulations of cells that respond differently to a stimulus. Here, we describe a procedure to measure the expression of up to 96 genes in single mammalian cells isolated from a population growing in tissue culture. Cells are sorted into lysis buffer by fluorescence-activated cell sorting (FACS), and the mRNA species of interest are reverse-transcribed and amplified. Gene expression is then measured using a microfluidic real-time PCR machine, which performs up to 96 qPCR assays on up to 96 samples at a time. We also describe the generation and use of PCR amplicon standards to enable the estimation of the absolute number of each transcript. Compared with other methods of measuring gene expression in single cells, this approach allows for the quantification of more distinct transcripts than RNA FISH at a lower cost than RNA-Seq.

We describe a method to sort single mammalian cells and to quantify the expression of up to 96 target genes of interest in each cell. This method includes the use of internal qPCR standards to enable the estimation of absolute transcript counts.

Einzellige Genexpressionsprofile mittels FACS und qPCR mit internen Standards

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Forschung

Genetik

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; however, the number of identified targets for Cdk1, particularly in human cells is still low. The identification of Cdk1-specific phosphorylation sites is important, as they provide mechanistic insights into how Cdk1 controls the cell cycle. Cell cycle regulation is critical for faithful chromosome segregation, and defects in this complicated process lead to chromosomal aberrations and cancer.
Here, we describe an in vitro kinase assay that is used to identify Cdk1-specific phosphorylation sites. In this assay, a purified protein is phosphorylated in vitro by commercially available human Cdk1/cyclin B. Successful phosphorylation is confirmed by SDS-PAGE, and phosphorylation sites are subsequently identified by mass spectrometry. We also describe purification protocols that yield highly pure and homogeneous protein preparations suitable for the kinase assay, and a binding assay for the functional verification of the identified phosphorylation sites, which probes the interaction between a classical nuclear localization signal (cNLS) and its nuclear transport receptor karyopherin &#945;. To aid with experimental design, we review approaches for the prediction of Cdk1-specific phosphorylation sites from protein sequences. Together these protocols present a very powerful approach that yields Cdk1-specific phosphorylation sites and enables mechanistic studies into how Cdk1 controls the cell cycle. Since this method relies on purified proteins, it can be applied to any model organism and yields reliable results, especially when combined with cell functional studies.

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is activated in the G2 phase of the cell cycle and regulates many cellular pathways. Here, we present a protocol for an in vitro kinase assay with Cdk1, which allows the identification of Cdk1-specific phosphorylation sites for establishing cellular targets of this important kinase.

Identifizierung von Cyclin-abhängige Kinase 1 spezifische Phosphorylierung Websites durch eine In-vitro- Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Biochemie

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts prepared from Xenopus laevis eggs have been powerful in dissecting biochemical networks underlying the cell-cycle progression, their ensemble average measurement typically leads to a damped oscillation, despite each individual oscillator being sustained. This is due to the difficulty of perfect synchronization among individual oscillators in noisy biological systems. To retrieve the single-cell dynamics of the oscillator, we developed a droplet-based artificial cell system that can reconstitute mitotic cycles in cell-like compartments encapsulating cycling cytoplasmic extracts of Xenopus laevis eggs. These simple cytoplasmic-only cells exhibit sustained oscillations for over 30 cycles. To build more complicated cells with nuclei, we added demembranated sperm chromatin to trigger nuclei self-assembly in the system. We observed a periodic progression of chromosome condensation/decondensation and nuclei envelop breakdown/reformation, like in real cells. This indicates that the mitotic oscillator functions faithfully to drive multiple downstream mitotic events. We simultaneously tracked the dynamics of the mitotic oscillator and downstream processes in individual droplets using multi-channel time-lapse fluorescence microscopy. The artificial cell-cycle system provides a high-throughput framework for quantitative manipulation and analysis of mitotic oscillations with single-cell resolution, which likely provides important insights into the regulatory machinery and functions of the clock.

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

We present a method for the generation of in vitro self-sustained mitotic oscillations at the single-cell level by encapsulating egg extracts of Xenopus laevis in water-in-oil microemulsions.

Rekonstitution des Zellzyklus Schwingungen in Mikroemulsionen zellfreie Xenopus Ei Extrakte

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used approaches to determine protein half-life are either limited to population averages from lysed cells or require the use of protein synthesis inhibitors. This protocol describes a method to measure protein half-lives in single living adherent cells, using SNAP-tag fusion proteins in combination with fluorescence time-lapse microscopy. Any protein of interest fused to a SNAP-tag can be covalently bound by a fluorescent, cell permeable dye that is coupled to a benzylguanine derivative, and the decay of the labeled protein population can be monitored after washout of the residual dye. Subsequent cell tracking and quantification of the integrated fluorescence intensity over time results in an exponential decay curve for each tracked cell, allowing for determining protein degradation rates in single cells by curve fitting. This method provides an estimate for the heterogeneity of half-lives in a population of cultured cells, which cannot easily be assessed by other methods. The approach presented here is applicable to any type of cultured adherent cells expressing a protein of interest fused to a SNAP-tag. Here we use mouse embryonic stem (ES) cells grown on E-cadherin-coated cell culture plates to illustrate how single cell degradation rates of proteins with a broad range of half-lives can be determined.

This protocol describes a method to determine protein half-lives in single living adherent cells, using pulse labeling and fluorescence time-lapse imaging of SNAP-tag fusion proteins.

Einzellige Quantifizierung der Protein-Abbauraten von Time-Lapse Fluoreszenzmikroskopie in adhärente Zellkultur

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used ...

Entwicklungsbiologie

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

Bestellen Einzelzellen und Einzel Embryos in 3D Confinement: Ein neues Gerät für High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Biotechnik

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such probes typically consist of variants of CFP and YFP, intervened by a phosphorylatable sequence and a phospho-binding domain. Upon phosphorylation, the probe changes conformation, which results in a change of the distance or orientation between CFP and YFP, leading to a change in FRET efficiency (Fig 1). Several probes have been published during the last decade, monitoring the activity balance of multiple kinases and phosphatases, including reporters of PKA2, PKB3, PKC4, PKD5, ERK6, JNK7, Cdk18, Aurora B9 and Plk19. Given the modular design, additional probes are likely to emerge in the near future10. 
Progression through the cell cycle is affected by stress signaling pathways 11. Notably, the cell cycle is regulated differently during unperturbed growth compared to when cells are recovering from stress12.Time-lapse imaging of cells through the cell cycle therefore requires particular caution. This becomes a problem particularly when employing ratiometric imaging, since two images with a high signal to noise ratio are required to correctly interpret the results. Ratiometric FRET imaging of cell cycle dependent changes in kinase and phosphatase activities has predominately been restricted to sub-sections of the cell cycle8,9,13,14.
Here, we discuss a method to monitor FRET-based probes using ratiometric imaging throughout the human cell cycle. The method relies on equipment that is available to many researchers in life sciences and does not require expert knowledge of microscopy or image processing.

FRET-based reporters are increasingly used to monitor kinase and phosphatase activities in live cells. Here we describe a method on how to use FRET-based reporters to assess cell cycle-dependent changes in target phosphorylation.

Überwachung Kinase und Phosphatase-Aktivitäten durch den Zellzyklus durch Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

Biologie

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Analyse des Zellzyklus Position in Säugerzellen

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating cells. Cell cycle division is an integral part of growth and reproduction and deregulation of key cell cycle components have been implicated in the precipitating events of carcinogenesis 1,2. Molecular agents in anti-cancer therapies frequently target biological pathways responsible for the regulation and coordination of cell cycle division 3. Although cell cycle kinetics tend to vary according to cell type, the distribution of cells amongst the four stages of the cell cycle is rather consistent within a particular cell line due to the consistent pattern of mitogen and growth factor expression. Genotoxic events and other cellular stressors can result in a temporary block of cell cycle progression, resulting in arrest or a temporary pause in a particular cell cycle phase to allow for instigation of the appropriate response mechanism. 
The ability to experimentally observe the behavior of a cell population with reference to their cell cycle progression stage is an important advance in cell biology. Common procedures such as mitotic shake off, differential centrifugation or flow cytometry-based sorting are used to isolate cells at specific stages of the cell cycle 4-6. These fractionated, cell cycle phase-enriched populations are then subjected to experimental treatments. Yield, purity and viability of the separated fractions can often be compromised using these physical separation methods. As well, the time lapse between separation of the cell populations and the start of experimental treatment, whereby the fractionated cells can progress from the selected cell cycle stage, can pose significant challenges in the successful implementation and interpretation of these experiments.
Other approaches to study cell cycle stages include the use of chemicals to synchronize cells. Treatment of cells with chemical inhibitors of key metabolic processes for each cell cycle stage are useful in blocking the progression of the cell cycle to the next stage. For example, the ribonucleotide reductase inhibitor hydroxyurea halts cells at the G1/S juncture by limiting the supply of deoxynucleotides, the building blocks of DNA. Other notable chemicals include treatment with aphidicolin, a polymerase alpha inhibitor for G1 arrest, treatment with colchicine and nocodazole, both of which interfere with mitotic spindle formation to halt cells in M phase and finally, treatment with the DNA chain terminator 5-fluorodeoxyridine to initiate S phase arrest 7-9. Treatment with these chemicals is an effective means of synchronizing an entire population of cells at a particular phase. With removal of the chemical, cells rejoin the cell cycle in unison. Treatment of the test agent following release from the cell cycle blocking chemical ensures that the drug response elicited is from a uniform, cell cycle stage-specific population. However, since many of the chemical synchronizers are known genotoxic compounds, teasing apart the participation of various response pathways (to the synchronizers vs. the test agents) is challenging. 
Here we describe a metabolic labeling method for following a subpopulation of actively cycling cells through their progression from the DNA replication phase, through to the division and separation of their daughter cells. Coupled with flow cytometry quantification, this protocol enables for measurement of kinetic progression of the cell cycle in the absence of either mechanically- or chemically- induced cellular stresses commonly associated with other cell cycle synchronization methodologies 10. In the following sections we will discuss the methodology, as well as some of its applications in biomedical research.

Tracking subtle changes in the progression and kinetics of cell cycle stages can be accomplished by use of a combination of metabolic labeling of nucleic acids with BrdU and total genomic DNA staining via Propidium Iodide. This method avoids the need of chemical synchronization of cycling cells, thereby preventing the introduction of non-specific DNA damage, which in turn affects cell cycle progression.

Mess-Zellzyklus-Progression Kinetics mit Metabolische Markierung und Durchflusszytometrie

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The nuclear-encoded proteins are transported into mitochondria guided by their mitochondria targeting sequences (MTS); however, a majority of mitochondrial localized proteins lack an identifiable MTS. Nevertheless, the fact that MTS can instruct proteins to go into the mitochondria provides a valuable tool for studying mitochondrial functions of normally nuclear and/or cytoplasmic proteins. We have recently identified the cell cycle kinase CyclinB1/Cdk1 complex in the mitochondria. To specifically study the mitochondrial functions of this complex, mitochondrial overexpression and knock-down of this complex without interfering with its nuclear or cytoplasmic functions were essential. By tagging CyclinB1/Cdk1 with MTS, we were able to achieve mitochondrial overexpression of this complex to study its mitochondrial targets as well as functions. Via tagging dominant-negative Cdk1 with MTS, inhibition of Cdk1 activity was accomplished particularly in the mitochondria. Potential mitochondrial targets of CyclinB1/Cdk1 complex were identified using a gel-based proteomics approach. Unlike traditional 2D gel analysis, we employed 2-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE) technology followed by phosphoprotein staining to fluorescently label differentially phosphorylated proteins in mitochondrial Cdk1 expressing cells. Identification of phosphoprotein spots that were altered in wild type versus dominant negative Cdk1 bearing mitochondria revealed the identity of mitochondrial targets of Cdk1. Finally, to determine the effect of CyclinB1/Cdk1 mitochondrial localization in cell cycle progression, a cell proliferation assay using a synthetic thymidine analogue EdU (5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine) was used to monitor the cells as they go through the cell cycle and replicate their DNA. Altogether, we demonstrated a variety of approaches available to study mitochondrial localization and activity of a cell cycle kinase. These are advanced, yet easy to follow methods that will be beneficial to many cell biology researchers.

Here, we outline how to study mitochondrial localization of a (cell cycle) kinase, and how to determine its sub-mitochondrial location as well as potential mitochondrial substrates/targets. Forced expression of proteins into the mitochondria provides a useful tool for studying the functional consequences of mitochondrial localization of a protein of interest.

Experimentelle Ansätze zur Untersuchung Mitochondriale Lokalisation und Funktion eines Kernzellzyklus-Kinase, Cdk1

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The ...

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein synthesis and protein degradation. Many assays reporting on protein abundance (e.g., single-time point western blotting, flow cytometry, fluorescence microscopy, or growth-based reporter assays) do not allow discrimination of the relative effects of translation and proteolysis on protein levels. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to specifically analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast). In this procedure, yeast cells are incubated in the presence of the translational inhibitor cycloheximide. Aliquots of cells are collected immediately after and at specific time points following addition of cycloheximide. Cells are lysed, and the lysates are separated by polyacrylamide gel electrophoresis for western blot analysis of protein abundance at each time point. The cycloheximide chase procedure permits visualization of the degradation kinetics of the steady state population of a variety of cellular proteins. The procedure may be used to investigate the genetic requirements for and environmental influences on protein degradation.

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).