Matthew O&#39;Sullivan und Fei Zhou sind Empfänger von Australian National Health and Medical Research Council Postgraduate Medical Research Stipendien.

Die sorgfältige Abwägung muss Primer und Sonde Design gegeben werden. Alle verfügbaren Sequenzen der Ziele von Interesse aus Datenbanken wie GenBank sollten genutzt werden, um konservierte Bereiche, die geeignete Ziele sind zu identifizieren. Wo eine große Anzahl von Zielen zu werden in einem einzigen Assay MPCR verstärkt, sollte jedes amplifizierte Sequenz, die ähnlich lang sein und sollte nicht mehr als 300 Basenpaare, um Wettbewerbsverzerrungen zu vermeiden. Eine alternative Anwendung der Methode ist es, eine längere Ziel mit Primern gegen konservierte Regionen zu verstärken und auf mehrere Sonden zu verwenden, um Sequenzvariation innerhalb des Amplikons zu identifizieren. In diesem Fall kann die amplifizierte PCR-Produkt länger sein. Primer Glühtemperaturen sollten alle ähnlich sein, mit PCR-Bedingungen angepasst. Primer, die starke sekundäre Struktur oder Primer-Dimer-Form sollte vermieden werden. Die Sigma Aldrich DNA-Rechner ( <a href="http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp">http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp</a> ) können verwendet werden, um zuverlässig vorhersagen diese Funktionen sein. DNA-Sonden sollten so gestaltet sein müssen Glühtemperaturen nahe 60 ° C werden Zur Maximierung der Spezifität, können zwei Sonden für jedes Ziel von Interesse in der Assay, einer Hybridisierung an den vorderen DNA-Strang neben dem Reverse-Primer-Bindungsstelle, und die andere auf der Rückseite Strang neben dem Forward-Primer-Bindungsstelle enthalten sein. In diesem Fall müssen sowohl vorwärts und Rückwärts-Primer werden Biotin-modifizierte. Wenn nur eine Sonde pro amplifizierte Target verwendet wird, dann nur ein Primer benötigt werden Biotin modifiziert. Bei der Gestaltung von Primer und Sonden für die MPCR / RLB-Assay ist es dringend empfohlen, in silico-Methoden verwenden, um PCR-Produkte und Sondenhybridisierung vorherzusagen, mit der in-vitro-Ergebnisse korrelieren. Idealerweise geschieht dies durch Isolate, für die das gesamte Genom-Sequenz ist verfügbar. Software wie FastPCR (abrufbar unter http://primerdigital.com/fastpcr.html) kann für diesen Zweck verwendet werden. Schwache oder fehlende Sondensignal vorhersagen, wo in silico-Analyse zeigt Basenpaar Mismatches was zu niedrigen Sonde Glühtemperaturen werden. DNA-Extraktion Techniken werden je nach den Proben getestet, und PCR-Bedingungen wird davon abhängen, Primer-Design. Leser werden auf Veröffentlichungen zu einzelnen Assays für weitere Informationen über DNA-Extraktion und PCR Reagenzien und Bedingungen 1-19 bezeichnet. Jeder Test wird mit geeigneten Kontrollen ausführen, um mindestens eine positive und eine negative Probe-Signal für jede Sonde auf der Membran, sowie eine DNA-freien Kontrolle. Darüber hinaus ist es vorteilhaft, eine Sonde an der Spitze der Membran, die voraussichtlich für alle Proben (zB: eine Art oder Gattung spezifische Sonde im Falle eines Mikro-Organismus) positiv ist, enthalten. Dies dient als positive Kontrolle Sonde, sondern erlaubt auch eine leichte Orientierung der Ergebnisse. 1. Vorbereitung der Membrane <ol><li> Bereiten Sie die folgenden Lösungen: <ul><li> 100ml 0,5 M NaHCO3 (pH 8,4) </li><li> 100 ml 0,5 M NaHCO 3 </li><li> 20 ml 16% EDAC </li><li> 250 ml 0,1 M NaOH </li><li> 250 ml 2xSSPE </li><li> 250 ml 2xSSPE/0.1% SDS - im Wasserbad bei 60 ° C </li><li> 250 ml 20 mM EDTA. </li></ul></li><li> Pre-Ofen auf 60 ° C. </li><li> Reinigen Sie die Immunetics Miniblotter mit 70% Ethanol. </li><li> Verdünnen Sie die Oligonukleotid-Sonden in 0,5 M NaHCO 3, um eine endgültige Konzentration von 2 pmol / ul und einem Volumen von 200 ul. </li><li> Schneiden Sie ein BiodyneC Nylonmembran zu 15x15 cm. Mit einem Bleistift und Lineal, Regel aus einer 0,5 cm Platz zwischen oberen Membran und schreiben Details hier. </li><li> Seal Membran in Plastikbeutel mit 20 ml frisch zubereitete 16% EDAC Lösung und Rock bei Raumtemperatur für 10 Minuten. </li><li> Wash-Membran in VE-Wasser für 30 Sekunden. </li><li> Legen Membran in miniblotter mit Kanälen laufen durch die Membran (parallel zur Bleistift-Linie). Put Stützkissen in ein und schließen Sie Löschblatt. Aspirieren Flüssigkeit aus den Kanälen. </li><li> Füllen Sie den Spuren 1 und 45 mit 150 ul 0,5 M NaHCO 3. Verwenden Sie 150 ul jeder Sonde Lösung Bahnen 2-44 in Folge zu füllen, wobei darauf geachtet, um Luftblasen zu vermeiden. Wenn eine Luftblase in den Kanal angezeigt wird, halten Sie die Pipette in Ort, rasch absaugen die Lösung, damit die Luftblase an die Spitze der Pipette float, dann wiederholen. Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 Minuten. </li><li> Absaugen Sonde Lösungen, entfernen Membran und waschen in 250 ml 0,1 M NaOH bei Raumtemperatur für 9 Minuten. </li><li> Wash-Membran in 250 ml 2xSSPE für 30 Sekunden. </li><li> Wash-Membran in 250 ml vorgewärmten 2xSSPE/0.1% SDS im Ofen bei 60 ° C für 5 Minuten. </li><li> Wenn nicht für die Hybridisierung verwendet werden sofort waschen Membran in 240 ml 20 mM EDTA bei Raumtemperatur für 20 Minuten (Reservierung restlichen 10ml), dann Dichtungsmembran in Plastiktüte mit den restlichen 10 ml 20 mM EDTA und Lagerunge im Kühlschrank bei 4 ° C. </li><li> Wash miniblotter mit Pyroneg Spülmittel und Bürste. Spülen und trocknen lassen. </li></ol> 2. Hybridisierung und Detektion <ol><li> Bereiten Sie die folgenden Lösungen: <ul><li> 250 ml 2xSSPE/0.1% SDS - Store im Wasserbad bei 60 ° C. </li><li> 500 ml 2xSSPE/0.5% SDS - Store im Wasserbad bei 60 ° C </li><li> 500 ml 2xSSPE/0.5% SDS - Store im Ofen bei 42 ° C </li><li> 500 ml 2xSSPE - halten bei Raumtemperatur </li><li> 500 ml 1% SDS - Store im Wasserbad bei 60 ° C zunächst (für Schritt 3) </li><li> 250 ml 20 mM EDTA - bei Raumtemperatur lagern (für Schritt 3). </li></ul></li><li> Biegen Sie an einem Ofen bei 60 ° C und einem Ofen auf 42 ° C. Bringen Sie Wasser in einem großen Becherglas auf einer Heizplatte kochen. </li><li> Saubere Immunetics Miniblotter mit 70% Ethanol. </li><li> Aliquot von 10 ml 2xSSPE/0.1% SDS in einen kleinen Behälter. Fügen Sie 20 ul jedes PCR-Produkt zu 150 ul 2xSSPE/0.1% SDS in nummerierten Röhrchen. </li><li> Boil PCR-Produkte für 10 min bei 100 ° C mit Styropor Inhaber. Legen Sie auf dem Eis sofort für mindestens 5 Minuten. </li><li> Wash-Membran in den restlichen 240 ml 2xSSPE/0.1% SDS in 60 ° C im Ofen für 5 Minuten. </li><li> Legen Membran in miniblotter mit Polster. Orientieren so Kanälen verlaufen vertikal (senkrecht zur Bleistift-Linie). </li><li> Saug überschüssige Flüssigkeit aus miniblotter Kanäle. </li><li> Die restlichen 150 pl 2xSSPE/0.1% SDS, um erste und letzte Kanäle. Add gekocht PCR-Produkte, um die verbleibenden Kanäle (2-44) in der Reihenfolge, wobei darauf geachtet, um Luftblasen zu vermeiden. </li><li> Legen Sie miniblotter flach in 60 ° C im Ofen für 1 Stunde, damit Hybridisierung stattfinden. </li><li> Absaugen von Flüssigkeit aus jedem Kanal entfernen Membran aus miniblotter. </li><li> Zweimal waschen in vorgewärmte 250 ml 2xSSPE/0.5% SDS in 60 ° C im Ofen für 10 Minuten. </li><li> Befeuchten Nylon Trennung Mesh mit 2xSSPE/0.5% SDS bei 42 ° C und es verwenden, um Roll-up-Membran. </li><li> Legen aufgerollt Membran in Tuchwelle und entfalten, um sicherzustellen, Membran liegt an der inneren Oberfläche. Add 3 ul Streptavidin-Peroxidase-Konjugat (Roche Applied Science) zu 15 ml 2xSSPE/0.5% SDS bei 42 ° C und Tuchwelle hinzuzufügen. Schraubverschluss fest zu und inkubieren in Rollen Ofen bei 42 ° C für 60 Minuten. Stellen Sie sicher, Richtung rollen ist so, dass Membran nicht anziehen. Überprüfen Sie regelmäßig auf Dichtheit prüfen. </li><li> Wash miniblotter in Pyroneg Reinigungsmittel und Wasser, spülen und trocknen lassen. </li><li> Entfernen Membran aus Tuchwelle. Zweimal waschen in übrigen 2xSSPE/0.5% SDS bei 42 ° C für 10 Minuten. </li><li> Zweimal waschen in 2xSSPE bei Raumtemperatur für 5 min. </li><li> Schalten Sie Backofen bis zu 80 ° C und Ort 500ml 1% SDS in Ofen zur Vorwärmung. </li><li> Make up 15 ml Amersham ECL Detection-Lösung (7,5 ml Lösung A und 7,5 ml Lösung B). Discard 2xSSPE und fügen Detection-Lösung. Rock-sanft mit der Hand für 2 Minuten gewährleistet eine vollständige Abdeckung der Membran mit Lösung. Entsorgen chemilumineszente Lösung. </li><li> Schneiden Sie zwei Blätter aus Kunststoff Transparenz, um die Exposition Patrone passt. Legen Membran zwischen den beiden Platten aufnehmen und in Exposition Patrone. </li><li> Gehen Sie zur Dunkelkammer. Unter rotem Licht, fügen ECL Detektion Film Patrone und setzen für 5 Minuten. Dog-ear unteren rechten Ecke des Films nach der Entfernung um die richtige Ausrichtung zu ermöglichen, wenn Anzeige. </li><li> Develop-Film mit automatisierten Entwickler oder chemischen Bädern nach Anweisungen des Herstellers. </li><li> Wiederholen Sie die Belichtung mit längeren oder kürzeren Belichtungszeiten, falls erforderlich. </li></ol> 3. Regeneration der Membran <ol><li> Wash-Membran in 250 ml 1% SDS bei 80 ° C für 30 Minuten zweimal. </li><li> Wash-Membran in 240 ml 20 mM EDTA bei Raumtemperatur für 15 Minuten. </li><li> Seal Membran in Plastikbeutel mit 10 ml 20 mM EDTA und in den Kühlschrank bei 4 ° C für zukünftige Wiederverwendung. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: Die Ergebnisse sind am besten, indem man die Folie über eine aufgedruckte Raster, sonst Scannen des Bildes und den Import in Software wie BioNumerics (Applied Maths, Sint-Martens-Latem, Belgien) angesehen. Jede Sonde Ergebnis sollte mit Verweis auf positive und negative Kontrolle Sonden interpretiert werden. Die Ergebnisse sind am besten als negativ, schwach positiv oder benotet. Positive Ergebnisse sind, wo das Signal so stark wie oder stärker als die positive Kontrolle Sonde. Negative Ergebnisse sind, wo das Signal fehlt oder gleich der negativen Kontrolle (im Falle der Hintergrund-Signal). Schwache Ergebnisse sind, wo das Signal schwächer als die positive Kontrolle Sonde, aber stärker als die negative Kontrolle ist. Schwache Ergebnisse können die Folge von Punktmutationen, die zu schwach Sondenbindung oder durch nicht-spezifische Signale von Primer-Dimer-Bildung werden. Die Verwendung von zwei Sonden pro Target von Interesse können zur Verbesserung der Spezifität, wo ein einzelnes schwaches Ergebnis sicher als nicht-spezifisches Signal interpretiert werden kann. Falls Zweifel bestehen, kann eine einzige komplexe PCR-Reaktion mit Gel-basierte Erkennung und Sequenzierung von jedem Verstärker durchgeführt werdenlified Produkt zu ermitteln, ob das Ergebnis ist wirklich positiv. Ein repräsentatives Ergebnis ist in Abbildung 2 dargestellt. <img src="/files/ftp_upload/2781/2781fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Die MPCR / RLB Prinzipien (P1) Step 1.9. Amine modifizierten Sonden sind kovalent an eine Nylonmembran gebunden. (P2) Step 2,10. Biotin modifizierten PCR-Produkte werden an die Sonden hybridisiert. (P3) Schritt 2.14. Streptavidin, mit Peroxidase markiert, ist mit der Membran inkubiert und bindet an Biotin. (P4) Steps 2,19-2,21. Peroxidase katalysiert eine Reaktion in der ECL Nachweisreagenzien, die Licht auf die lichtempfindlichen Film ausgesetzt ist. Die Membran wird dann für die Wiederverwendung gewaschen. <img src="/files/ftp_upload/2781/2781fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Representative MPCR / RLB führen. Proben 1 bis 6 stehen für positive Kontrollen - zwischen ihnen gibt es wenigstens eine positive Probe-Signal für jeden der 43 Sonden. Jeder Zielsequenz (A bis U) ist mit zwei verschiedenen Sonden, um die Spezifität zu maximieren erkannt. Sonden A1 und A2 vertreten artspezifischen Sonden, die voraussichtlich für jede Probe positiv und helfen bei der Orientierung des Films sind. Probe A1 ist an der Unterseite der Membran wiederholt. Die Proben 7 und 8 sind negative Kontrollen. Beachten Sie, dass Probes Q1, Q2, T1 und T2-Signal in den negativen Kontrollen haben, was darauf hinweist wahrscheinlich unspezifische Bindung von Primer oder Primer-Dimer-Produkt. Re-Design der Sonden oder Primer erforderlich wäre. Probes C1, D1 und F1 zeigen Streifenbildung durch die Membran wahrscheinlich auf einige nicht-spezifische Aufnahme der Streptavidin-Peroxidase-Konjugat oder Chemilumineszenzsubstrat, dies ist jedoch leicht von echten positive Probe-Signale aus. Probes D1 und D2 haben relativ schwaches Signal im Vergleich zu anderen Sonden, kann dies zu größeren Amplifikate führt zu weniger effiziente Amplifikation. Probe J2 ist negativ mehrere Proben (1, 3, 4, 6, 39), wo Sonde J1 ist positiv. Das wahrscheinlichste ist eine Mutation in der J2-Bindungsstelle für diese Beispiele.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die MPCR / RLB-Methode ermöglicht die gleichzeitige Erfassung einer großen Anzahl von PCR-Produkte. Aufgrund der hohen Empfindlichkeit der Chemilumineszenz-Sonde-basierte Erkennung kann ein einzelner Multiplex-PCR-Reaktion mit einer großen Anzahl von Primerpaare verwendet, um die DNA-Template zu verstärken. Wenn keine Sonde Signale mit einer oder mehreren Proben, die Durchführung Gelelektrophorese mit den verbliebenen PCR-Produkt erhalten werden können unterscheiden, ob das Problem mit PCR-Amplifikation oder Sondenhybridisierung ist. Wo alle Sonde Signale auf der Membran schwach oder nicht vorhanden sind, aber Gelelektrophorese zeigt die erfolgreiche PCR-Amplifikation unter anderem die Möglichkeiten Probleme mit Kennzeichnung der Membran, fehlerhafte Regeneration der Membran nach vorheriger Verwendung, fehlerhafte Temperaturen während der Hybridisierung oder Streptavidin Inkubation oder defekte Streptavidin- Peroxidase-Konjugat oder Nachweisreagenz. Wenn Kontrollproben zeigen, dass die einzelnen Sonden können zu falsch negativen Signale, Einzel-PCR mit Gel-basierte Erkennung und anschließende Sequenzierung durchgeführt werden können, um die Amplifikation von PCR-Produkt zu überprüfen und für Sequenzvariation an der Sonde Bindungsstelle zu suchen. Schwache oder fehlende Sondensignal kann auf große Amplikon size: wenn möglich alle Amplikons sollten, die ähnlich lang und weniger als 300 bp sein. Secondary DNS-Strukturen von Amplikons können auch zu schlechten Sondenbindung und kann Re-Design der Primer erfordern. Individuelle Primer oder Sonden-Konzentrationen kann auch variiert werden, um die Signalstärke zu optimieren. Falsch positive Signale aufgrund Sonde Bindung von nonamplified Primer oder Primer-Dimer-Produkt kann durch Ausführen einzelner PCR mit Gel-basierte Erkennung und anschließende Sequenzierung untersucht werden. Wenn dies geschieht, der Sonden Redesign kann erforderlich sein können. Punktmutationen in Sonde Bindungsstellen kann schwach oder nicht vorhanden Signalen führen. Zulassen von zwei Sonden für jedes amplifizierte Produkt macht dies leicht zu erkennen. Diese Eigenschaft kann bei sorgfältiger Primer und Sonde Design zu kleinen Sequenzvariationen in Ziel-DNA zu erkennen genutzt werden. Kurzum, während es viele Methoden der Produkt-Erkennung folgenden Multiplex-PCR-Reaktionen zur Verfügung stehen, hat MPCR / RLB den Vorteil, dass High-Throughput-und kostengünstig mit geringem Setup-Kosten. Die Flexibilität der Methode erlaubt den Einsatz in einer Vielzahl von Anwendungen.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagens </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> 5 &#39;Amin C6 modifiziertes Oligonukleotid-Sonden </td><td> Sigma-Aldrich </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S-8875 </td><td> 0,5 M Lösung aus bis zu pH 8,4 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5881 </td><td> 0,1 M Lösung </td></tr><tr><td> 20xSSPE Puffer </td><td> Amresco </td><td> 0810-4L </td><td></td></tr><tr><td> Natriumdodecylsulfat (SDS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L-4390 </td><td> Make up 10% Stammlösung, nicht Autoklaven, sollten für 1 Woche maximal vor Gebrauch aufbewahrt werden </td></tr><tr><td> Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E9884 </td><td> Make up 0,5 M Lösung auf pH 8,0 eingestellt und Autoklaven </td></tr><tr><td> N-(3-Dimethylaminopropyl)-N &#39;-ethylcarbodiimidhydrochlorid (EDAC) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E7750 </td><td> Make up von 20 ml 16% ige Lösung unmittelbar vor Gebrauch mit 3,2 g EDAC und 18 ml Millipore-Wasser </td></tr><tr><td> BiodyneC 0,45 um Nylonmembran 20x20 cm </td><td> Pall Life Sciences </td><td> 74480C </td><td></td></tr><tr><td> Deionisiertes, gereinigtes Wasser </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Flüssige Waschmittel Pyroneg </td><td> Johnson Diversey </td><td> HH12291 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidin-Peroxidase-Konjugat </td><td> Roche </td><td> 11 089 153 001 </td><td></td></tr><tr><td> Amersham ECL Nachweisreagenzien </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN2105 </td><td></td></tr><tr><td> Amersham ECL Nachweisreagenzien </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN2105 </td><td></td></tr><tr><td> OHP Transparency Film </td><td> Corporate Express </td><td> EXP 504 OHP </td><td></td></tr><tr><td> Amersham ECL Hyperfilm Hochleistungs-Chemilumineszenz Film 18x24 cm </td><td> GE Healthcare </td><td> 28906837 </td><td></td></tr><tr><td> Eis </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Consumables in der MPCR / RLB-Assay verwendet. <table border="1"><tbody><tr><th> Ausstattung </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Hybaid Shake&#39;n&#39;Stack Backöfen (2) rollen Flasche und Nylon Mesh Trennung </td><td> Thermo Scientific </td><td> HBSNSRS220 </td><td> Methode kann mit einem einzigen Ofen, solange gibt es Möglichkeit für die Aufrechterhaltung der Lösungen bei 42 ° C und 60 ° C vor dem Einsatz </td></tr><tr><td> Die Bauchtänzerin Wippschüttler </td><td> Stovall Life Science </td><td> Euro BDbo </td><td></td></tr><tr><td> Miniblotter </td><td> Immunetics </td><td> Mn100-45 </td><td></td></tr><tr><td> Wasserbad </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sog </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Herdplatte </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Exposure Patrone </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z36 ,009-0 </td><td></td></tr><tr><td> Röntgenfilm-Entwickler </td><td></td><td></td><td> Außerdem können Entwickler, Fixierer und Wasser in Schalen in einem abgedunkelten Raum statt automatisierterEntwickler. Lumino-Imager können auch anstelle von Xray Film verwendet werden </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Ausrüstung für die MPCR / RLB-Test erforderlich.

multiplex pcr and reverse line blot hybridization assay (mpcr/rlb)

Multiplex PCR / Reverse Line-Blot-Hybridisierung Assay erlaubt den Nachweis von bis zu 43 molekularen Ziele in 43 Proben mit einer Multiplex-PCR-Reaktion durch Sondenhybridisierung auf eine Nylon-Membran, die wieder verwendbar ist, gefolgt. Die Sonden sind 5 &#39;Amin modifiziert, um die Fixierung der Membran zu ermöglichen. Primer sind 5 &#39;Biotin modifiziert denen der Nachweis der hybridisierten PCR-Produkte unter Verwendung von Streptavidin-Peroxidase und einem Chemilumineszenz-Substrat über lichtempfindliche Folie ermöglicht. Mit niedrigen Aufbau und die Kosten für Verbrauchsmaterialien, ist diese Technik kostengünstig (ca. US $ 2 pro Probe), einen hohen Durchsatz (mehrere Membranen können gleichzeitig verarbeitet werden) und hat eine kurze Turnaround-Zeit (ca. 10 Stunden). Die Technik kann in eine Reihe von Möglichkeiten genutzt werden. Mehrere Sonden können zur Folge Variation innerhalb einer einzigen amplifizierten Produkts erkannt werden, oder mehrere Produkte gleichzeitig verstärkt werden, mit einem (oder mehreren) Sonden für die anschließende Detektion verwendet. Eine Kombination der beiden Ansätze können auch innerhalb eines einzigen Assay verwendet werden. Die Fähigkeit, mehrere Sonden für ein einzelnes Ziel-Sequenz enthalten ist der Test sehr spezifisch. Veröffentlichte Anwendungen von MPCR / RLB umfassen die Detektion von Antibiotika-Resistenzgene 1,2, Typisierung von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus 3-5 und Salmonella sp 6, molekulare Serotypisierung von Streptococcus pneumoniae 7,8, Streptococcus agalactiae 9 und Enteroviren 10,11, Identifikation von Mycobacterium sp 12, Erkennung von genitalen 13-15 und Atemwege 16 und 17 anderen Krankheitserregern und Detektion und Identifizierung von Mollicutes 18. Das bedeutet jedoch, die Vielseitigkeit der Technik der Anwendungen sind nahezu unbegrenzt und nicht auf molekulare Analyse von Mikro-Organismen beschränkt. Die fünf Schritte in MPCR / RLB sind a) Primer und Probe-Design, b) DNA-Extraktion und PCR-Amplifikation c) Herstellung der Membran, d) Hybridisierung und Detektion, und e) Regeneration der Membran.

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Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay mPCR/RLB

Eine preiswerte, einen hohen Durchsatz-Verfahren für die simultane Detektion von bis zu 43 molekulare Ziele beschrieben. Anwendungen der MPCR / RLB gehören mikrobielle Typisierung und Erkennung von mehreren Erregern aus klinischen Proben.

Multiplex PCR und Reverse-Line-Blot-Hybridisierung Assay (MPCR / RLB)

Multiplex PCR/Reverse Line Blot Hybridization assay allows the detection of up to 43 molecular targets in 43 samples using one multiplex PCR reaction ...

multiplex-pcr-and-reverse-line-blot-hybridization-assay-mpcrrlb

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay (mPCR/RLB)

43.4K Aufrufe.  University of Sydney. Eine preiswerte, einen hohen Durchsatz-Verfahren für die simultane Detektion von bis zu 43 molekulare Ziele beschrieben. Anwendungen der MPCR / RLB gehören mikrobielle Typisierung und Erkennung von mehreren Erregern aus klinischen Proben.

Serie: Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay mPCR/RLB

Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated to a microbiota dominated by a number of bacterial species, including Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, and others1-3. This condition is associated with a range of negative health outcomes, including HIV acquisition4, and it can be difficult to manage clinically5. Furthermore, diagnosis of BV has relied on the use of Gram stains of vaginal swab smears that are scored on various numerical criteria6,7. While this diagnostic is simple, inexpensive, and well suited to resource-limited settings, it can suffer from problems related to subjective interpretations and it does not give a detailed profile of the composition of the vaginal microbiota8. Recent deep sequencing efforts have revealed a rich, diverse vaginal microbiota with clear differences between samples taken from individuals that are diagnosed with BV compared to those individuals that are considered normal9,10, which has resulted in the identification of a number of potential targets for molecular diagnosis of BV11,12. These studies have provided a wealth of useful information, but deep sequencing is not yet practical as a diagnostic method in a clinical setting. We have recently described a method for rapidly profiling the vaginal microbiota in a multiplex format using oligonucleotide-coupled fluorescent beads with detection on a Luminex platform13. This method, like current Gram stain-based methods, is rapid and simple but adds the additional advantage of exploiting molecular knowledge arising from sequencing studies in probe design. This method therefore provides a way to profile the major microorganisms that are present in a vaginal swab that can be used to diagnose BV with high specificity and sensitivity compared to Gram stain while providing additional information on species presence and abundance in a semi-quantitative and rapid manner. This multiplex method is expandable well beyond the range of current quantitative PCR assays for particular organisms, which is currently limited to 5 or 6 different assays in a single sample14. Importantly, the method is not limited to the detection of bacteria in vaginal swabs and can be easily adapted to rapidly profile nearly any microbial community of interest. For example, we have recently begun to apply this methodology to the development of diagnostic tools for use in wastewater treatment plants.

We describe a multiplex method for the detection of microorganisms within a sample using oligonucleotide-coupled fluorescent beads. Amplicon from all organisms within a sample is hybridized to a panel of probe-coupled beads. A Luminex or Bio-Plex instrument is used to query each bead for bead type and hybridization signal.

Multiplex Nachweis von Bakterien in komplexen Clinical and Environmental Proben mit Oligonukleotid-gekoppelten Fluoreszenz-Mikrosphären

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Multiplexed Isothermal Amplification Based Diagnostic Platform to Detect Zika, Chikungunya, and Dengue 1

Zika, dengue, and chikungunya viruses are transmitted by mosquitoes, causing diseases with similar patient symptoms. However, they have different downstream patient-to-patient transmission potentials, and require very different patient treatments. Thus, recent Zika outbreaks make it urgent to develop tools that rapidly discriminate these viruses in patients and trapped mosquitoes, to select the correct patient treatment, and to understand and manage their epidemiology in real time.
Unfortunately, current diagnostic tests, including those receiving 2016 emergency use authorizations and fast-track status, detect viral RNA by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), which requires instrumentation, trained users, and considerable sample preparation. Thus, they must be sent to &#34;approved&#34; reference laboratories, requiring time. Indeed, in August 2016, the Center for Disease Control (CDC) was asking pregnant women who had been bitten by a mosquito and developed a Zika-indicating rash to wait an unacceptable 2 to 4 weeks before learning whether they were infected. We very much need tests that can be done on site, with few resources, and by trained but not necessarily licensed personnel.
This video demonstrates an assay that meets these specifications, working with urine or serum (for patients) or crushed mosquito carcasses (for environmental surveillance), all without much sample preparation. Mosquito carcasses are captured on paper carrying quaternary ammonium groups (Q-paper) followed by ammonia treatment to manage biohazards. These are then directly, without RNA isolation, put into assay tubes containing freeze-dried reagents that need no chain of refrigeration. A modified form of reverse transcription loop-mediated isothermal amplification with target-specific fluorescently tagged displaceable probes produces readout, in 30 min, as a three-color fluorescence signal. This is visualized with a handheld, battery-powered device with an orange filter. Forward contamination is prevented with sealed tubes, and the use of thermolabile uracil DNA glycosylase (UDG) in the presence of dUTP in the amplification mixture.

Current multiplexed diagnostics to detect Zika, chikungunya, and dengue viruses require complex sample preparation and expensive instrumentation, and are difficult to use in low resource environments. We show a diagnostic that uses isothermal amplification with target-specific strand displaceable probes to detect and differentiate these viruses with high sensitivity and specificity.

Gemultiplexten isothermen Verstärkung basiert Diagnoseplattform zu erkennen, Zika, Chikungunya und Dengue-Fieber 1

Zika, dengue, and chikungunya viruses are transmitted by mosquitoes, causing diseases with similar patient symptoms. However, they have different ...

Biochemie

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation into thousands of nano-sized water-in-oil individual reactions. Recently, ddPCR has become one of the most accurate and sensitive tools for circulating tumor DNA (ctDNA) detection. One of the major limitations of the standard ddPCR technique is the restricted number of mutations that can be screened per reaction, as specific hydrolysis probes recognizing each possible allelic version are required. An alternative methodology, the drop-off ddPCR, increases throughput, since it requires only a single pair of probes to detect and quantify potentially all genetic alterations in the targeted region. Drop-off ddPCR displays comparable sensitivity to conventional ddPCR assays with the advantage of detecting a greater number of mutations in a single reaction. It is cost-effective, conserves precious sample material, and can also be used as a discovery tool when mutations are not known a priori.

Here, we present a protocol to accurately quantify multiple genetic alterations of a target region in a single reaction using drop-off ddPCR and a unique pair of hydrolysis probes.

Einzelne Tropfen digitale Polymerase-Kettenreaktion für umfassende und gleichzeitigen Nachweis von Mutationen im Hotspot-Regionen

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Genetik

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently needed in disease diagnosis, microbial monitoring, genetically modified organism (GMO) detection, and forensic analysis. We have previously described the platform called CALM (Capillary Array-based Loop-mediated isothermal amplification for Multiplex visual detection of nucleic acids). Herein, we describe improved fabrication and performance processes for this platform. Here, we apply a small, ready-to-use cassette assembled by capillary array for multiplex visual detection of nucleic acids. The capillary array is pre-treated into a hydrophobic and hydrophilic pattern before fixing loop-mediated isothermal amplification (LAMP) primer sets in capillaries. After assembly of the loading adaptor, LAMP reaction mixture is loaded and isolated into each capillary, due to capillary force by a single pipetting step. The LAMP reactions are performed in parallel in the capillaries. The results are visually read out by illumination with a hand-held UV flashlight. Using this platform, we demonstrate monitoring of 8 frequently appearing elements and genes in GMO samples with high specificity and sensitivity. In summary, the platform described herein is intended to facilitate the detection of multiple nucleic acids. We believe it will be widely applicable in fields where high-throughput nucleic acid analysis is required.

This protocol describes the fabrication of a small, ready-to-use cassette that can be applied for visual detection of multiple nucleic acids in a single, test that is easy to operate. In this approach, a capillary array was used for multiplex and highly efficient detection of GMO targets.

Visuelle Erkennung von mehreren Nukleinsäuren in einem Kapillar Array

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

Biotechnik

Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers easy identification and characterization of these cell types, prerequisites to study their specific functions. This article describes the multiplex single cell reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) protocol, which allows, after patch-clamp recording in slices, to detect simultaneously the expression of tens of genes in a single cell. This simple method can be implemented with morphological characterization and is widely applicable to determine the phenotypic traits of various cell types and their particular cellular environment, such as in the vicinity of blood vessels. The principle of this protocol is to record a cell with the patch-clamp technique, to harvest and reverse transcribe its cytoplasmic content, and to detect qualitatively the expression of a predefined set of genes by multiplex PCR. It requires a careful design of PCR primers and intracellular patch-clamp solution compatible with RT-PCR. To ensure a selective and reliable transcript detection, this technique also requires appropriate controls from cytoplasm harvesting to amplification steps. Although precautions discussed here must be strictly followed, virtually any electrophysiological laboratory can use the multiplex single cell RT-PCR technique.

This protocol describes the critical steps and precautions required to perform single cell multiplex reverse transcription polymerase chain reaction after patch-clamp. This technique is a simple and effective method to analyze the expression profile of a predetermined set of genes from a single cell characterized by patch-clamp recordings.

Einzelne Zelle Multiplex reversen Transkription Polymerase-Kettenreaktion nach Patch-clamp

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers ...

Neurowissenschaften

Multiplex-Immunoassay für Borrelien-spezifisches IgG und IgM im Serum

Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test

To monitor the progression of infectious diseases, it is useful to assess immunoreactivity against various antigenic determinants, and measure different antibody isotypes because they appear at different stages of the host immune response. With Lyme borreliosis, the pathogenic agent can be one of the multiple members of the Borrelia species. Therefore, correct sample classification requires evaluating the immunoreactivity against different antigens of different Borrelia species. Additionally, anti-pathogen IgG and IgM responses can have different elicitation time courses during disease progression. Here we demonstrate the development of a two-reporter multiplex immunoassay that has utility in identifying Borrelia-specific immune response in human serum samples by simultaneously evaluating both IgG and IgM immunoreactivity against different bacterial antigens in the same reaction well. This dual-reporter approach retains the analytical performance of single-reporter methods while conserving time and resources and reducing sample size requirements. This assay allows essentially double the serological information to be generated from a blood sample in half the time.

Autor im Rampenlicht: Erweiterung des Anwendungsbereichs von Multiplex-Immunoassays für die Lyme-Borreliose-Diagnostik und die Erregerforschung 

A three-channel dual-reporter fluorescence flow analysis system was used to develop a bead-based multiplex immunoassay that simultaneously evaluates serum samples for IgG and IgM elicited against multiple antigens of different Borrelia species that cause Lyme borreliosis in Europe and North America.

Gleichzeitiger Nachweis verschiedener Antikörperklassen in einem serologischen Multiplex-Test

To monitor the progression of infectious diseases, it is useful to assess immunoreactivity against various antigenic determinants, and measure different ...

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to quantify DNA sample concentration using a standard curve. In this manuscript, a detailed protocol for developing and implementing a real-time quantitative recombinase polymerase amplification assay (qRPA assay) is provided. Using HIV-1 DNA quantification as an example, the assembly of real-time RPA reactions, the design of an internal positive control (IPC) sequence, and co-amplification of the IPC and target of interest are all described. Instructions and data processing scripts for the construction of a standard curve using data from multiple experiments are provided, which may be used to predict the concentration of unknown samples or assess the performance of the assay. Finally, an alternative method for collecting real-time fluorescence data with a microscope and a stage heater as a step towards developing a point-of-care qRPA assay is described. The protocol and scripts provided may be used for the development of a qRPA assay for any DNA target of interest.

Provided is a protocol for developing a real-time recombinase polymerase amplification assay to quantify initial concentration of DNA samples using either a thermal cycler or a microscope and stage heater. Also described is the development of an internal positive control. Scripts are provided for processing raw real-time fluorescence data.

Entwicklung eines Quantitative Rekombinase Polymerase Amplification Assay mit einem internen positiven Kontrolle

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...

Biologie

Single-Cell Multiplexed Fluorescence Imaging to Visualize Viral Nucleic Acids and Proteins and Monitor HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virus, and Influenza Infection

Capturing the dynamic replication and assembly processes of viruses has been hindered by the lack of robust in situ hybridization (ISH) technologies that enable sensitive and simultaneous labeling of viral nucleic acid and protein. Conventional DNA fluorescence in situ hybridization (FISH) methods are often not compatible with immunostaining. We have therefore developed an imaging approach, MICDDRP (multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA and protein), which enables simultaneous single-cell visualization of DNA, RNA, and protein. Compared to conventional DNA FISH, MICDDRP utilizes branched DNA (bDNA) ISH technology, which dramatically improves oligonucleotide probe sensitivity and detection. Small modifications of MICDDRP enable imaging of viral proteins concomitantly with nucleic acids (RNA or DNA) of different strandedness. We have applied these protocols to study the life cycles of multiple viral pathogens, including human immunodeficiency virus (HIV)-1, human T-lymphotropic virus (HTLV)-1, hepatitis B virus (HBV), hepatitis C virus (HCV), Zika virus (ZKV), and influenza A virus (IAV). We demonstrated that we can efficiently label viral nucleic acids and proteins across a diverse range of viruses. These studies can provide us with improved mechanistic understanding of multiple viral systems, and in addition, serve as a template for application of multiplexed fluorescence imaging of DNA, RNA, and protein across a broad spectrum of cellular systems.

Presented here is a protocol for a fluorescence imaging approach, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA, and protein (MICDDRP), a method capable of simultaneous fluorescence single-cell visualization of viral protein and nucleic acids of different type and strandedness. This approach can be applied to a diverse range of systems.

Einzelzell-Multiplex-Fluoreszenzbildgebung zur Visualisierung viraler Nukleinsäuren und Proteine und zur Überwachung von HIV-, HTLV-, HBV-, HCV-, Zika-Virus- und Influenza-Infektionen

Capturing the dynamic replication and assembly processes of viruses has been hindered by the lack of robust in situ hybridization (ISH) technologies that ...

Multiplex PCR und Reverse-Line-Blot-Hybridisierung Assay (MPCR / RLB)

Zusammenfassung

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Multiplex Nachweis von Bakterien in komplexen Clinical and Environmental Proben mit Oligonukleotid-gekoppelten Fluoreszenz-Mikrosphären

Gemultiplexten isothermen Verstärkung basiert Diagnoseplattform zu erkennen, Zika, Chikungunya und Dengue-Fieber 1

Einzelne Tropfen digitale Polymerase-Kettenreaktion für umfassende und gleichzeitigen Nachweis von Mutationen im Hotspot-Regionen

Visuelle Erkennung von mehreren Nukleinsäuren in einem Kapillar Array

Einzelne Zelle Multiplex reversen Transkription Polymerase-Kettenreaktion nach Patch-clamp

Gleichzeitiger Nachweis verschiedener Antikörperklassen in einem serologischen Multiplex-Test

Gleichzeitiger Nachweis verschiedener Antikörperklassen in einem serologischen Multiplex-Test

Gleichzeitiger Nachweis verschiedener Antikörperklassen in einem serologischen Multiplex-Test

Entwicklung eines Quantitative Rekombinase Polymerase Amplification Assay mit einem internen positiven Kontrolle

Einzelzell-Multiplex-Fluoreszenzbildgebung zur Visualisierung viraler Nukleinsäuren und Proteine und zur Überwachung von HIV-, HTLV-, HBV-, HCV-, Zika-Virus- und Influenza-Infektionen