Gefördert durch die NIH (NS-18205).

1. Zubereitung von Fisch für gepaarte Recordings <ol><li> Vor Beginn des Verfahrens vorzubereiten fünf Lösungen, darunter: Bath Solution, Badlösung mit Tricaine (MS222), Bad-Lösung mit Formamid, Neuron Internal Solution und Muscle Internal Solution. </li><li> Anschließend sammeln einen einzigen Larven Zebrafisch im Alter von 72 bis 96 Stunden und in Badlösung mit Tricaine. Innerhalb einer Minute Einwirkzeit des Anästhetikums, die Fische nicht auf Berührung reagieren. </li><li> Den Fisch auf einer Plastikschale und mit einem Stereomikroskop, mit einem Doppel-Rasierklinge zu enthaupten. </li><li> Übertragen Sie die Fische, um ein Glas Aufnahme Kammer mit Sylgard beschichtet und mit Badlösung. Befestigen Sie an jedem Ende durch Einsetzen elektrolytisch geschärften Wolfram Stifte durch die Chorda. </li><li> Erstellen Sie einen Hautlappen am rostralen Ende des Fisches mit einer Nadel, die eine ausreichend Grip für ein Paar feine Pinzette zur Verfügung stellt. Entfernen Sie die darüber liegende Haut durch Greifen es in der Nähe des rostralen Stift mit einer feinen Pinzette. Peel langsam in die kaudale Richtung die Haut abziehen. </li><li> Behandeln Sie den Fisch mit 3 ml Badlösung mit Formamid für 3-5 Minuten, um Muskelkontraktionen, die mit Aufnahmen stören könnte, zu blockieren. Wash 5 mal mit normalen Bad Solution. Nehmen Sie Teil der oberflächlichen Muskulatur über 5 bis 6 Segmente, indem Sie vorsichtig die Verschrottung mit der Seite eines Wolframstift. </li><li> Übertragen Sie die Fische zu einem aufrechten Mikroskop in einen Faraday-Käfig, um elektrische Störungen zu schützen. Das Mikroskop ist mit einer festen Bühne ausgestattet, großer Arbeitsabstand 40x und Zoom von .5 bis 4x. Das Mikroskop befindet sich auf einem motorisierten XY-Übersetzung Bühne montiert, um die Vorbereitung zwischen Nerv und Muskel unter hoher Leistung zu bewegen. Der Einsatz von Differential-Interferenz-Kontrast-Optik trägt dazu bei, die Neuronen zu visualisieren. </li><li> Unter 0,5 x-Zoom, verwenden Sie eine weite Bohrung 15-Mikrometer-Pipette darüberliegenden Muskel entfernen und setzen das Rückenmark. Negativer Druck wird durch eine 3 cc Einwegspritze und Muskelzellen angewendet werden entfernt eins nach dem anderen. Dieses Verfahren ist für 5 bis 6 dorsalen Segmente der Skelettmuskulatur wiederholt. Das gleiche weite Bohrung Pipette wird verwendet, um auch entfernen, die beiden oberen Schichten der ventralen Muskulatur zum Ziel schnell Skelettmuskulatur zu erhalten. </li><li> Damit ist die Vorbereitung für gepaarte Aufnahmen und das Mikroskop Zoom ist auf ca. 1,6 erhöht. </li></ol> 2. Gepaart Recordings von CaP Motor-Neuron-und Target Muskelzellen <ol><li> Das gereinigte Segmente werden gescannt, um die CaP Neuronen zu finden. Jeder Hemi-Segment des Rückenmarks enthält einen großen, 10 Mikron Durchmesser, CaP Motor-Neuron. Diese Tropfenform Soma ist oberflächlich unter der spinalen Dura in der Nähe des kaudalen Endes der segmentalen Grenze entfernt. Ein CaP Neuron ist für die Aufnahme ausgewählt und das ventrale Zielmuskel in den angrenzenden kaudalen Segment gescannt wird, um die Integrität zu überprüfen. </li><li> Zwei aufgesetzte Elektroden sind für die Aufnahme, einen für das Neuron und eine zweite für den Muskelaufbau positioniert. Die obere Elektrode hat eine flache Kegel für das Eindringen der harten spinalen Dura und Bahnöffnung von etwa 2 Mikrometer. Die untere Elektrode hat eine steilere Kegel für geringen Widerstand Voltage-Clamp-Aufzeichnung der Skelettmuskulatur </li><li> Position des Neurons Elektrode in einem Winkel von etwa 30 Grad auf der spinalen Dura einzudringen, etwa ein halbes Segment rostral um den ausgewählten CaP Neurons. Schieben Sie die Elektrode mit einem axialen Manipulator, während eine sanfte kontinuierliche positive Druck von etwa 60 Millimeter Quecksilber. Da die Elektrode bricht durch die Dura, kann die Kappe Neuron durch die Perfusion von der Elektrode verschoben werden, erfordern eine Neujustierung des Fokus. </li><li> Wenn die Elektrode berührt die CaP Neuron soma Überdruck freigesetzt und führt in der Regel sofortige Bildung eines Gigaohm Dichtung. Doch in einigen Fällen, wo eine Abdichtung versagt zu bilden, wird es notwendig, einen sanften Unterdruck anwenden. Nach Siegel Bildung ist das Elektrodenpotential angepasst, um-80mV und Anwendung von Unterdruck Brüche der Zellmembran. Die GAP-Neuron ist mit einem Eingangswiderstand von 140 bis 180 Mega-Ohm und ein Aktionspotential, dass Überschwinger 40 Millivolt aus. Dies ist durch die Injektion schrittweise Erhöhung depolarisierende Schritte unter Stromzange bis das Aktionspotential ausgelöst wird getestet. </li><li> Als nächstes wird das Mikroskop auf ventralen Muskel mit dem XY motorisierten Übersetzer unter hohen Strom verlegt. Eine schnelle Muskelzelle wird aus dem Zielfeld ausgewählt. </li><li> Der Muskel-Elektrode ist auf das Ziel Muskelzelle unter Überdruck, der beim Loslassen, bildet eine Gigaohm Dichtung fortgeschritten. Das Elektrodenpotential wird auf -50 Millivolt eingestellt Natrium-Kanäle inaktivieren und unter leichtem Saugen der Zellmembran ist gerissen. Ein Rückgang der Widerstand gegen die 100 bis 200 Mega-Ohm und das plötzliche Auftauchen der großen kapazitiven Transienten-Eintrag. </li><li> Um zu testen,für gepaarte der Aufnahme wird die Motor-Neuron depolarisiert durch schrittweise größere Injektionen von Strom, bis ein Aktionspotential ausgelöst wird. An dieser Stelle eine Endplatte Strom sollte in der Muskulatur hervorgerufen werden. Fortsetzung Stimulation der Motoneuronen bei 1 Hertz Ergebnisse in Endplatte Ströme ohne Ausfall. Da die Reizfrequenz auf 100 Hertz erhöht wird die Endplatte Strömungen schwanken in Amplitude und unterziehen funktionalen Erschöpfung innerhalb von 10 Sekunden Stimulation. </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse Typischerweise ist das Neuron eine Aufnahmedauer von bis zu einer Stunde stabil, aber die Muskelzellen verschlechtern, da eine Erhöhung der Serienwiderstand wider. In diesem Fall wird der Versuch entweder beendet oder anderen Muskelzelle ist Patch gespannt. Alle Aufnahmen sollten innerhalb einer Stunde abgeschlossen sein. <img src="/files/ftp_upload/2351/2351fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Recordings der Motoneuron Aktionspotential (AP, oben) und die damit verbundenen muskulären Endplatte aktuellen (EPC, unten). Die Aktion Potenzial für eine CaP Neuron sollte Überschwingen +40 mV und der EPC sollte innerhalb von 300 us und Verfall entlang einer exponentiellen Zeitverlauf mit einer Zeitkonstante unter 1 ms steigen. <table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td> Rezept </td></tr><tr><td> Bad Solution (in mM) </td><td> 134 NaCl, 2,9 KCl, 2,1 CaCl 2, 1,2 MgCl 2, 10 Glucose, 10 Na-HEPES, pH 7,8 </td></tr><tr><td> Badlösung mit Tricaine </td><td> Bath Lösung mit 0,02% Tricaine </td></tr><tr><td> Badlösung mit Formamid </td><td> Bath Lösung mit 2M Formamid </td></tr><tr><td> Neuron Internal Solution (in mM) </td><td> 115 K-Gluconat, 15 KCl, 2 MgCl 2, 10 K-HEPES, 5 K-EGTA, 4 Mg-ATP, pH 7,2 </td></tr><tr><td> Muscle Internal Solution (in mM) </td><td> 120 KCl, 10 K-HEPES, 5 BAPTA, pH 7,4 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Solutions.

<ol>
	<li>Fetcho, J. R., O'Malley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+networks+in+behaving+animals.">Imaging neuronal networks in behaving animals.</a> Current Opinion in Neurobiology. 7, 832-838 (1997).</li><li>Fetcho, J. R., S, H. i. g. a. s. h. i. j. i. m. a. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+and+genetic+approaches+toward+understanding+neuronal+circuits+in+zebrafish.">Optical and genetic approaches toward understanding neuronal circuits in zebrafish.</a> Integr Comp Biol. 44, 57-70 (2004).</li><li>Iba&#241;ez-Tallon, I., Wen, H., Miwa, J., Xing, J., Aslantas-Tekinay, A., Ono, F., Brehm, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tethering+naturally+occurring+peptide+toxins+for+cell+autonomous+modulation+of+ion+channels+and+receptors+in+vivo.">Tethering naturally occurring peptide toxins for cell autonomous modulation of ion channels and receptors in vivo.</a> Neuron. 43, 305-311 (2004).</li><li>Li, W., Ono, F., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+measurements+of+presynaptic+release+in+mutant+zebrafish+lacking+postsynaptic+receptors.">Optical measurements of presynaptic release in mutant zebrafish lacking postsynaptic receptors.</a> J. Neuroscience. , 23-10467 (2003).</li><li>Ono, F., Mandel, G., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylcholine+receptors+direct+rapsyn+clusters+to+the+neuromuscular+synapse+in+zebrafish.">Acetylcholine receptors direct rapsyn clusters to the neuromuscular synapse in zebrafish.</a> J. Neuroscience. 24, 475-5481 (2004).</li><li>Ono, F., Shcherbatko, A., Higashijima, S., Fetcho, J., Mandel, G., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paralytic+zebrafish+lacking+ACh+receptors+fail+to+localize+rapsyn+clusters+to+the+synapse.">Paralytic zebrafish lacking ACh receptors fail to localize rapsyn clusters to the synapse.</a> J. Neuroscience. 21, 5439-5448 (2001).</li><li>Ono, F., Shcherbatko, A., Higashijima, S., Mandel, G., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+motility+mutant+twitch+once+reveals+new+roles+for+rapsyn+in+synaptic+function.">The zebrafish motility mutant twitch once reveals new roles for rapsyn in synaptic function.</a> J. Neuroscience. 22, 6491-6498 (2002).</li><li>Wang, M., Wen, H., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+neuromuscular+synapses+in+the+zebrafish+choline-acetyltransferase+mutant+bajan.">Function of neuromuscular synapses in the zebrafish choline-acetyltransferase mutant bajan.</a> J Neurophysiol. , 100-104 (2008).</li><li>Wen, H., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired+motor-neuron+muscle+recordings+in+zebrafish+test+the+receptor+blockade+model+for+shaping+synaptic+current.">Paired motor-neuron muscle recordings in zebrafish test the receptor blockade model for shaping synaptic current.</a> J. Neuroscience. 25, 8104-8111 (2005).</li></ol>

Wir verwenden Zebrafisch gepaart Aufnahmen (Wen und Brehm, 2005) hauptsächlich auf die Prozesse der Vesikelfreisetzung und Recycling bei hoher Frequenz Stimulation zu studieren. Dieser Prozess ist in Motilität Mutanten wobei normale synaptische Übertragung unterbrochen wird durch Punktmutationen in wichtigen synaptischen Komponenten beeinträchtigt. Zum Beispiel, Mutationen, die postsynaptische Rezeptor-Aggregate (Ono et al., 2001, 2002, 2004) und die Synthese von präsynaptischen Sender (Wang et al., 2008) führen in eine unkoordinierte Schwimmen stören. Gepaart Aufnahmen liefern die Informationen, die die Quelle der funktionellen Defekt lokalisieren kann, was eine Verknüpfung Verhalten, Genetik und Physiologie. Es sollte nun möglich sein, weitere sezieren die zugrunde liegenden Prozesse der synaptischen Übertragung durch transiente Expression in der GAP-Motor-Neuronen mit vernünftigen Promotoren. Auf diese Weise dominant negative oder mutierten Gene gezielt in diesen Neuronen exprimiert werden, und beide Verhaltens-und elektrophysiologischen Folgen bestimmt. Der zusätzliche Vorteil von der ganzen Zelle Konfiguration angeboten ermöglicht Dialyse des CaP Soma mit Substanzen, die potenziell verändern können Vesikel-Recycling, wie Clostridien-Toxine und Kalzium-Puffer. Aufgrund der kurzen Entfernung zwischen dem Soma und Muskeln, sollte Diffusion und treten innerhalb des Zeitrahmens von Aufnahmen. Das Potenzial dieses Präparats hat gerade erst begonnen erschlossen werden. Die Transparenz der Fische in diesem Alter und oberflächliche Lage der Synapsen erleichtert zudem die Anwendung der optischen Instrumente (Fetcho und O&#39;Malley, 1997; Fetcho und Higashijima, 2004). Wir waren sehr erfolgreich bei der Messung von Endo-und Exozytose in lebenden Fischen mit FM-Farbstoffe und genetische Indikatoren wie Synaptophluorin (Li et al., 2003). Darüber hinaus können fluoreszierenden konjugierten Toxinen verwendet werden, um synaptische Proteine ​​für die Bildgebung von lebenden Fischen (Ibanez-Tallon et al., 2004) zu kennzeichnen. Angesichts der Einfachheit dieser Vorbereitung ist es sehr vielversprechend für die Zukunft studieren.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Pneumatic transducer tester</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluke Biomedical Instruments</td>
<td>DPM1B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.002 x 3 inch tungsten rod</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>A-M Systems Inc</td>
<td>715000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sylgard 184 Elastomer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning Corp.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>The thickness of application will affect the DIC optics</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

paired patch clamp recordings from motor-neuron and target skeletal muscle in zebrafish

Larven Zebrafisch sind die ersten Wirbeltiere Modellsystem zur gleichzeitigen Patch-Clamp-Aufnahme von einem spinalen motorischen Neuronen-und Zielmuskel ermöglichen. Dies ist eine direkte Folge der Zugang zu beiden Zelltypen und die Fähigkeit zur visuellen Unterscheidung der einzelnen segmentalen CaP Motor-Neuron auf der Basis von Morphologie und Lage. Dieses Video zeigt die mikroskopische Methoden verwendet, um einen CaP Motor-Neuron-und Ziel-Muskelzellen sowie die Methoden für die Aufzeichnung von jedem Zelltyp zu identifizieren. Bezeichnung des CaP Motor-Neuron-Typs ist entweder Farbstoff Füllung oder durch die biophysikalischen Eigenschaften wie Aktionspotential Wellenform und Zelle Eingangswiderstand bestätigt. Motor-Neuron-Aufnahmen routinemäßig zuletzt für 1 Stunde ermöglichen, langfristige Aufzeichnungen aus mehreren unterschiedlichen Ziel Muskelzellen. Die Kontrolle über den Motor-Neuron feuern Muster ermöglicht Messungen der Frequenz-Abhängigkeit der synaptischen Transmission an der neuromuskulären Synapse. Aufgrund einer großen quantal Größe und der geringen Geräuschentwicklung gesamte Zellspannung Klammer vorgesehen, können alle an der einheitlichen Ereignisse im Muskel gelöst werden. Diese Funktion erlaubt Erforschung grundlegender synaptischen Eigenschaften wie Release-Eigenschaften, Vesikel-Recycling, sowie synaptische Depression und Erleichterung. Die Vorteile dieser in vivo Vorbereitung eclipse früheren neuromuskulären Modell angebotenen Systeme untersucht, wobei die Motor-Neuronen in der Regel durch extrazelluläre Elektroden stimuliert werden und die Muskeln sind zu groß für die gesamte Zelle Patch-Clamp. Der Zebrafisch Vorbereitung ist offen für die Kombination von elektrophysiologischen Analyse mit einer Vielzahl von Ansätzen, einschließlich transgenen Linien, Morpholino Knockdown, pharmakologische Intervention und in-vivo-Bildgebung. Diese Ansätze, verbunden mit der wachsenden Zahl von neuromuskulären Erkrankungen Modelle von mutierten Linien der Zebrafisch zur Verfügung gestellt, die Tür öffnen für ein neues Verständnis der menschlichen neuromuskulären Erkrankungen.

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Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Larven Zebrafisch sind die ersten Wirbeltiere Modellsystem zur gleichzeitigen Patch-Clamp-Aufnahme von einem spinalen motorischen Neuronen-und Ziel-Skelettmuskel ermöglichen. Dieses Video zeigt die mikroskopische Methoden verwendet, um eine segmentale CaP Motor-Neuron-und Ziel-Muskelzellen sowie die Methoden für die Aufzeichnung von jedem Zelltyp zu identifizieren.

Gepaart Patch Clamp Messungen von Motor-Neuron-und Target Skelettmuskulatur bei Zebrafisch

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

paired-patch-clamp-recordings-from-motor-neuron-target-skeletal

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.1K Aufrufe.  Oregon Health and Sciences University. Larven Zebrafisch sind die ersten Wirbeltiere Modellsystem zur gleichzeitigen Patch-Clamp-Aufnahme von einem spinalen motorischen Neuronen-und Ziel-Skelettmuskel ermöglichen. Dieses Video zeigt die mikroskopische Methoden verwendet, um eine segmentale CaP Motor-Neuron-und Ziel-Muskelzellen sowie die Methoden für die Aufzeichnung von jedem Zelltyp zu identifizieren.

Serie: Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Patch Clamp Messungen von Mouse Netzhautneuronen in einem Dark-Scheiben angepasst Vorbereitung

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Forschung

Neurowissenschaften

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

Patch-Clamp-Aufnahmen im inneren Haarsinneszellen Isoliert von Zebrafisch

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

Mitochondria are involved in many important cellular functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most important mitochondrial functions are related to the efficient production of ATP, the energy currency of the cell, by oxidative phosphorylation, and the mediation of signals for programmed cell death3.
The enzyme primarily responsible for the production of ATP is the F1FO-ATP synthase, also called ATP synthase4-5. In recent years, the role of mitochondria in apoptotic and necrotic cell death has received considerable attention. In apoptotic cell death, BCL-2 family proteins such as Bax enter the mitochondrial outer membrane, oligomerize and permeabilize the outer membrane, releasing pro-apoptotic factors into the cytosol6. In classic necrotic cell death, such as that produced by ischemia or excitotoxicity in neurons, a large, poorly regulated increase in matrix calcium contributes to the opening of an inner membrane pore, the mitochondrial permeability transition pore or mPTP. This depolarizes the inner membrane and causes osmotic shifts, contributing to outer membrane rupture, release of pro-apoptotic factors, and metabolic dysfunction. Many proteins including Bcl-xL7 interact with F1FO ATP synthase, modulating its function. Bcl-xL interacts directly with the beta subunit of F1FO ATP synthase, and this interaction decreases a leak conductance within the F1FOATPasecomplex, increasing the net transport of H+ by F1FO during F1FO ATPase activity8 and thereby increasing mitochondrial efficiency. To study the activity and modulation of the ATP synthase, we isolated from rodent brain submitochondrial vesicles (SMVs) containing F1FO ATPase. The SMVs retain the structural and functional integrity of the F1FO ATPase as shown in Alavian et al. Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of SMVs from rat brain and we delineate the patch clamp technique to analyze channel activity (ion leak conductance) of the SMVs.

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

A method to isolate submitochondrial vesicles enriched in F1FO ATP synthase complexes from rat brain is described. These vesicles allow the study of the activity of F1FO ATPase complex and its modulation using the technique of patch clamp recording.

<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</sub&gt; ATPase Vesicle Vorbereitung und Technik für Darstellende Patch-Clamp-Recordings von submitochondrialen Vesikelmembranen

Mitochondria are involved in many important cellular  functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

Isolation von sensorischen Neuronen von<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Für Patch-Clamp-Recordings von Glutamaterge Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key neurons involved in a characteristic behavior known as the C-start or escape response that occurs when the organism perceives a threat. The M-cell has been extensively studied in adult goldfish where it has been shown to receive a wide range of excitatory, inhibitory and neuromodulatory signals1. We have been examining M-cell activity in embryonic zebrafish in order to study aspects of synaptic development in a vertebrate preparation. In the late 1990s Ali and colleagues developed a preparation for patch clamp recording from M-cells in zebrafish embryos, in which the CNS was largely intact2,3,4. The objective at that time was to record synaptic activity from hindbrain neurons, spinal cord neurons and trunk skeletal muscle while maintaining functional synaptic connections within an intact brain-spinal cord preparation. This preparation is still used in our laboratory today. To examine the mechanisms underlying developmental synaptic plasticity, we record excitatory (AMPA and NMDA-mediated)5,6 and inhibitory (GABA and glycine) synaptic currents from developing M-cells. Importantly, this unique preparation allows us to return to the same cell (M-cell) from preparation to preparation to carefully examine synaptic plasticity and neuro-development in an embryonic organism. The benefits provided by this preparation include 1) intact, functional synaptic connections onto the M-cell, 2) relatively inexpensive preparations, 3) a large supply of readily available embryos 4) the ability to return to the same cell type (i.e. M-cell) in every preparation, so that synaptic development at the level of an individual cell can be examined from fish to fish, and 5) imaging of whole preparations due to the transparent nature of the embryos.

We have developed an intact brain-spinal cord preparation to record and monitor electrical activity via patch clamp recording from the Mauthner neurons and other reticulospinal cells in zebrafish embryos. Thus, we are able to record excitatory and inhibitory synaptic currents, voltage-gated channel activity and action potentials from key neurons in a developing embryo.

Patch-Clamp-Aufnahmen aus embryonalen Zebrafisch-Mauthner-Zellen

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen aus Morphologically- und neurochemisch identifizierten Hippocampus Inter

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Gepaart ganze Zelle Recordings in Organotypische Hippocampus

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. Structural changes at the NMJ can result in neurotransmission failure, resulting in weakness, atrophy and even death of the muscle fiber. Many studies have investigated how genetic modifications or disease can alter the structure of the mouse NMJ. Unfortunately, it can be difficult to directly compare findings from these studies because they often employed different parameters and analytical methods. Three protocols are described here. The first uses maximum intensity projection confocal images to measure the area of acetylcholine receptor (AChR)-rich postsynaptic membrane domains at the endplate and the area of synaptic vesicle staining in the overlying presynaptic nerve terminal. The second protocol compares the relative intensities of immunostaining for synaptic proteins in the postsynaptic membrane. The third protocol uses Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to detect changes in the packing of postsynaptic AChRs at the endplate. The protocols have been developed and refined over a series of studies. Factors that influence the quality and consistency of results are discussed and normative data are provided for NMJs in healthy young adult mice.

The neuromuscular junction (NMJ) is altered in a variety of conditions that can sometimes culminate in synaptic failure. This report describes fluorescence microscope-based methods to quantify such structural changes.

Der neuromuskulären Synapse: Mess Synapse Größe, Fragmentierung und Veränderungen der synaptischen Protein Dichte Mit der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

Elektrophysiologische und morphologische Charakterisierung neuronaler Schaltkreise in akuten Hirnschnitten Mit Paired-Patch-Clamp-Aufnahmen

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen in Hirnschnitten

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Gepaart Patch Clamp Messungen von Motor-Neuron-und Target Skelettmuskulatur bei Zebrafisch

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