Die Arbeit in diesem Artikel berichtet, wurde von einem National Health and Medical Research Council (NHMRC) of Australia Programm Grant (CRP) und eine NHMRC Project Grant (CRP und BJCQ) unterstützt. Auch BJCQ ist ein NHMRC Peter Doherty Postdoctoral Fellow.

1) Reagenz-Setup 1,1) CFSE-Stammlösung Die CFSE Farbstoff als Carboxyfluoresceindiacetat Succinimidylester (CFDA, SE) (MW 557,47 g / mol) gekauft, in der Regel in 25-mg-Durchstechflaschen. Lösen Sie die 25 mg in 8,96 ml DMSO für eine endgültige Stammlösung von 5 mM (speichern als 50-100 &amp;mgr; l Aliquots bei -20 ° C für mehrere Monate). CFDA, SE wird mit wässriger Lösung reagieren so dass es wichtig ist, dass eine solche Exposition während der Lagerung vermieden werden. 1,2) Lymphozyten Isolieren Lymphozyten aus Milz und Lymphknoten oder von Mäusen und resuspendieren in 1 ml Kulturmedium (z. B. RPMI) mit 5% hitzeinaktiviertem (HALLO) fötalem Kälberserum (FCS), mit einer Zellkonzentration von 0,5 x 06 bis 10 Oktober x 10 7 / ml. 2) CFSE Labeling 2,1) Routine-Methode: <ol class="lalpha"><li> Gründlich die Zellen in der 1 ml Volumen Medium und Ort sorgfältig in den Boden einer frisch (nicht medienberührt) 10 ml konischen Rohr. </li><li> Legen Sie das Rohr horizontal (mit einem nicht benetzte Rohr wird 1 ml-Zellsuspension aus bewegten und vorzeitig Vermischung mit dem CFDA, SE-Lösungen zu verhindern). </li><li> Vorsichtig 110 ul PBS, die nicht benetzten Teil der Kunststoff an der Spitze des Rohres gewährleistet es keinen Kontakt mit der Zelle Lösung. </li><li> Resuspendieren 1,1 ul der 5 mM Bestand CFDA, SE in den 110 ul PBS. </li><li> Schnell Kappe der Röhre und invertieren und Vortex auch einen schnellen gleichmäßigen Durchmischung der Lösungen zu erhalten. Beachten Sie, dass die CFSE Farbstoff in einer Endkonzentration von 5 uM ist, jedoch kann die optimale Konzentration müssen für jede Charge vorbereitet bestimmt werden, und dann alle 6 Monate geprüft, um sicherzustellen, dass es wirksam ist. </li><li> Inkubieren Zellen für 5 min bei Raumtemperatur. Beachten Sie, dass bei der Umwandlung von CFDA, SE CFSE (siehe Diskussion) der Farbstoff Fluoreszenz und somit anfällig für Bleichen von übermäßiger Licht wird. So ist es ratsam, das Rohr aus Licht von diesem Punkt zu schützen auf, z. B. durch Abdecken mit Alufolie. </li><li> Wash-Zellen durch Verdünnung in 10 Bänden von 20 ° C PBS mit 5% FCS HALLO, Sedimentieren durch Zentrifugation bei 300 xg für 5 min bei 20 ° C und der Überstand verworfen. Wiederholen Sie waschen zweimal. </li></ol> 2,2) Alternative Methode, die auch geeignet ist für höhere Zellzahlen (10 bis 30 x 10 7): <ol class="lalpha"><li> Bereiten Sie eine 2 x (10 uM) CFDA, SE-Lösung durch Zugabe von 2 ul der 5 mM Lager zu 1 ml PBS und schnell fügen Sie diese zu 1 mL gründlich resuspendierten Zellen, dann schnell Kappe der Röhre und invertieren und Vortex gut zu bekommen schnelle gleichmäßige Durchmischung. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen für 5 min bei Raumtemperatur und waschen wie in den Schritten 2,1 (f) und 2,1 (g). </li></ol> 2,3) Die Zellen können dann in einem Protokoll von Interesse für die Induktion der Zellteilung angewendet werden. Markierten Zellen können sowohl in in vitro und in vivo-Untersuchungen verwendet werden. 2,4) Nach Beendigung der Proliferation Assay werden Zellen geerntet und mittels Durchflusszytometrie analysiert (siehe unten für repräsentative Beispiele). 3) repräsentative Ergebnisse Um zu beurteilen, Lymphozyten-Proliferation durch CFSE Verdünnung, ist es sinnvoll, die Fluoreszenz der ungeteilten Zellen (dh maximale Fluoreszenz) und nicht-markierte Zellen (dh minimale Fluoreszenz) kennen. Daher sollten Sie Ihre experimentellen Design dieser Kontrollen zu berücksichtigen. Nachfolgend sind Beispiele für in vitro und in vivo-Tests mit CFSE zu CD8 + T Zellteilung mittels Durchflusszytometrie gemessen. 3,1) In-vitro-Stimulation Abbildung 1 zeigt die CFSE Profile von CFSE-markierten Ovalbumin (OVA)-spezifischen T-Zell-Rezeptor transgenen CD8 + OT-I T-Zellen nach 3 Tagen Kultur mit dendritischen Zellen mit verschiedenen Mengen von OVA gepulst. CD8 + T-Zellen aus der Milz und Lymphknoten von OT-I-Mäusen aufgereinigt wurden mit CFSE und 1 x 10 5 Zellen kultiviert mit 3,3 x 10 4 DC beschriftet. DC, wo mit OVA für 1 Stunde bei 37 ° C gepulst und zweimal vor dem Kultur. Nach 3 Tagen, Zellen, wo und mit anti-CD8-APC-Antikörper und Hoechst 33258 geerntet markiert und dann mittels Durchflusszytometrie analysiert (50.000 Veranstaltungen gesammelt). Live (Hoechst 33258 -) CD8 +-Zellen gezeigt werden. Als Kontrollen CD8 + T-Zellen kultiviert allein, zeigt die CFSE Intensität der nicht-geteilten Zellen, während die nicht-markierten Zellen zeigt die Autofluoreszenz der Zellen und die Grenzen der nachweisbaren Zellteilungen. Beachten Sie, dass 4 CFSE Gipfel in jede der Tafeln in diesem Beispiel zu sehen, was darauf hinweist, dass die Zellen bis zu 3 Divisionen unterzogen. 3,2) In-vivo-Stimulation Abbildung 2 zeigt die CFSE Profile von CFSE-markierten OVA-spezifischen T-Zell-Rezeptor transgenen CD8 + OT-I T-Zellen nach 3 Tagen in vivo in die Anwesenheit von 20 ug OVA. CD8 + T-Zellen aus der Milz und Lymphknoten von CD45.1 kongene OT-I-Mäusen aufgereinigt wurden mit CFSE und 5 x 10 6 Zellen iv injiziert in die seitliche Schwanzvene C56BL/6J (CD45.2 +)-Mäuse bezeichnet. Nach 2 Stunden Mäusen injiziert wurden iv mit 20 ug OVA. Nach 3 Tagen wurden Milzen der Mäuse gesammelt, machte in einem einzigen Zellsuspension, beschriftet mit anti-B220-PerCP, anti-CD8-APC-Cy7 und anti-CD45.1-PE-Cy7 Antikörper und Hoechst 33258 und anschließend analysiert mittels Durchflusszytometrie (1.000.000 Ereignisse gesammelt). Live (Hoechst 33258 -) B220-Zellen sind in linken und gated CD8 + CD45.1 + Zellen im rechten Panel angezeigt gezeigt. Als Kontrollen unstimulierten CFSE-markierten CD8 + T-Zellen, zeigt die CFSE Intensität der nicht-geteilten Zellen, während die nicht-markierten Zellen zeigt die Autofluoreszenz der Zellen und die Grenzen der nachweisbaren Zellteilungen. Beachten Sie, dass die Verwendung des CD45 allotypische Unterschied entscheidend bei der Lösung der übertragenen CD8 + T-Zellen aus Host, da sie eine kleine Teilmenge der gesamten CD8 + T-Zellen (links) sind. Beachten Sie, dass die meisten Zellen innerhalb von 7 CFSE Gipfel in diesem Beispiel (rechts) fallen, was darauf hinweist, dass die Zellen bis zu 6 Divisionen unterzogen. <img src="/files/ftp_upload/2259/2259fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Die Fähigkeit von CFSE-markierten Ovalbumin (OVA)-spezifischen T-Zell-Rezeptor transgenen CD8 + OT-I T-Zellen in vitro zu DC mit verschiedenen Konzentrationen von OVA gepulsten reagieren, Daten gezeigt, dass nach 3 Tagen Kultur. Beachten Sie, nicht geteilt Bevölkerung von CD8 + T Zellen in Abwesenheit von Antigen (hellgrau Histogramm) und Auto-Fluoreszenz von nicht-markierten Bevölkerung (dunkelgrau Histogramm). Die Abbildung zeigt CD8 + T-Zellen, die 1-3 mal aufgeteilt wurden auf der Grundlage CFSE Verdünnung Gipfel mit mehr T-Zellen teilen bei den höheren Antigen-Konzentrationen. <img src="/files/ftp_upload/2259/2259fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Die Fähigkeit von CFSE-markierten Ovalbumin (OVA)-spezifischen T-Zell-Rezeptor transgenen CD8 + OT-I T-Zellen, wenn adoptiv in C57BL / 6 Mäuse übertragen, um OVA reagieren, Daten gezeigt, 3 Tage nach dem adoptiven Transfer Linke Tafel:. CD8 +, CD45. 1 + OT-1 T-Zellen in Empfängermäuse. Rechts: CFSE Verbreitung Profil. Hinweis nicht geteilt Bevölkerung von CD8 + T-Zellen in Empfängermäuse nicht erhalten Antigen (hellgrau Histogramm) und Auto-Fluoreszenz von nicht-markierten Lymphozyten (dunkelgrau Histogramm). Die Abbildung zeigt CD8 + T-Zellen, 1-6 mal aufgeteilt wurden auf der Grundlage CFSE Verdünnung Gipfel. <img src="/files/ftp_upload/2259/2259fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Eine Darstellung der verschiedenen molekularen Ereignisse, die während der Markierung von Zellen mit Carboxyfluoresceindiacetat Succinimidylester (CFDA, SE) auftreten. Für Einzelheiten des Verfahrens siehe Diskussion Text. Hinweis: Die generische Abkürzung &quot;CFSE&quot;, nicht CFDA, SE, wird verwendet, um die Markierungsreagens und die Kennzeichnung Verfahren im Allgemeinen zu beschreiben. Abbildung basierend auf Parish 4.

<ol>
	<li>Lyons, A. B., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+lymphocyte+division+by+flow+cytometry.">Determination of lymphocyte division by flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 171, 131-137 (1994).</li><li>Parish, C. R., Glidden, M. H., Quah, B. J., Warren, H. S., Coligan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+intracellular+fluorescent+dye+CFSE+to+monitor+lymphocyte+migration+and+proliferation.">Use of the intracellular fluorescent dye CFSE to monitor lymphocyte migration and proliferation.</a> Current protocols in immunology. , (2009).</li><li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester.">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nature Protocols. 2, 2049-2056 (2007).</li><li>Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+dyes+for+lymphocyte+migration+and+proliferation+studies.">Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies.</a> Immunol Cell Biol. 77, 499-508 (1999).</li></ol>

Um zu schätzen, wie CFSE funktioniert und warum schnelle einheitliche Kennzeichnung ist für den Einsatz in Proliferation Analyse erforderlich ist, ist es sinnvoll, die molekularen Grundlagen der CFSE Zellmarkierung verstehen. Dies kann in zwei Phasen, 1) Eindringen in die Zelle und 2) Protein-Labelling (Abbildung 3) eingeteilt werden. 1) Handy: Eintragung des Farbstoffes in der Zelle wird durch die diacetylierte Form des Farbstoffes, Carboxyfluoresceindiacetat Succinimidylester (CFDA, SE) vermittelt. Die Acetate machen den Farbstoff sehr Membran Permeationsmittel ermöglicht die rasche Wandel in der Plasmamembran. Esterasen, Gegenwart innerhalb der Zelle, spaltet die Acetate von CFDA, SE und damit Anlass zu der CFSE Form des Farbstoffes, die viel weniger Membran Permeationsmittel ist, so konzentriert sich der Farbstoff in der Zelle. 2) Protein Etikettierung: Während beide CFDA, SE und CFSE aminoreaktiven Succinimidyl Seitenketten haben, ist nur die CFSE Fluoreszenz. Die hohe intrazelluläre Konzentration von CFSE ermöglicht eine schnelle und hohe intrazelluläre Markierung von Proteinen. CFSE Markierung von Zellen müssen schnell durchgeführt werden, um eine homogen bezeichnet Population von Zellen, die entscheidend für die Lösung Zellen, die mehrere Abteilungen durchlaufen haben, wie in der repräsentativen Ergebnisse (Abb. 1 und 2) gezeigt, zu erhalten.

<table><tbody><tr><td>CFDA,SE</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lymphocytes</td><td>eg mouse or human</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>SAFC Global</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10-15ml conical tubes</td><td>Falcon BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aluminium foil</td><td>Capral Aluminium</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Scientific Industries Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

the use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (cfse) to monitor lymphocyte proliferation

Carboxyfluorescein Succinimidylester (CFSE) ist ein effektives und beliebtes Mittel, um Lymphozyten Division 1-3 überwachen. CFSE kovalent Etiketten langlebig intrazellulären Molekülen mit dem Fluoreszenzfarbstoff, Carboxyfluorescein. Wenn also ein CFSE-markierten Zelle teilt, werden seine Nachkommen mit der Hälfte der Anzahl der Carboxyfluorescein-markierten Molekülen dotiert und damit jeder Zellteilung kann durch Messung der entsprechenden Abnahme der Zell-Fluoreszenz über Durchflusszytometrie beurteilt werden. Die Kapazität der CFSE auf Lymphozyten-Populationen mit hoher Fluoreszenzintensität von außergewöhnlich niedrigen Varianz, mit seinem niedrigen Zelltoxizität gekoppelt label, machen ihn zum idealen Farbstoff Zellteilung zu messen. Da es ein Fluorescein-basierte Farbstoff ist es ist auch kompatibel mit einer breiten Palette anderer Fluorochrome so dass es für Multi-Color-Durchflusszytometrie. Dieser Artikel beschreibt die Verfahren, die üblicherweise zur Kennzeichnung Maus-Lymphozyten für die Zwecke der Überwachung von bis zu 8 Zellteilungen verwendet. Diese markierten Zellen können sowohl für in vitro und in vivo-Studien verwendet werden.

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The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester CFSE to Monitor Lymphocyte Proliferation

CFSE kovalent Etiketten langlebig intrazellulären Molekülen mit dem Fluoreszenzfarbstoff, Carboxyfluorescein. Als solche, als eine CFSE-markierten Zelle teilt, haben seine Nachkommen, die Hälfte der Menge der Fluoreszenz, die damit verwendet werden, um die Zellteilung zu beurteilen. Dieser Artikel beschreibt die Verfahren, die üblicherweise zur Kennzeichnung Maus-Lymphozyten mit CFSE verwendet.

Die Verwendung von Carboxyfluoresceindiacetat Succinimidylester (CFSE) auf Lymphozyten-Proliferation-Monitor

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) is an effective and popular means to monitor lymphocyte division1-3.  CFSE covalently labels long-lived ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation

91.9K Aufrufe.  John Curtin School of Medical Research, Australian National University. CFSE kovalent Etiketten langlebig intrazellulären Molekülen mit dem Fluoreszenzfarbstoff, Carboxyfluorescein. Als solche, als eine CFSE-markierten Zelle teilt, haben seine Nachkommen, die Hälfte der Menge der Fluoreszenz, die damit verwendet werden, um die Zellteilung zu beurteilen. Dieser Artikel beschreibt die Verfahren, die üblicherweise zur Kennzeichnung Maus-Lymphozyten mit CFSE verwendet.

Serie: The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester CFSE to Monitor Lymphocyte Proliferation

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation. This labeling has classically been used to study proliferation and migration. In the method presented here, we have shortened the timeline after adoptive transfer to look at survival and killing of epitope specific CFSE labeled target cells4-6. The level of specific killing of a CD8 + T cell clone can indicate the quality of the response, as their quantity may be misleading. Specific CD8+ T cells can become functionally exhausted over time with a decline in cytokine production and killing7,8. Also, certain CD8 + T cell clones may not kill as well as others with differing TCR specificities9. For effective Cell Mediated Immunity (CMI), antigens must be identified that produce not only adequate numbers of responding T cells, but also functionally robust responding T cells. Here we assess the percent cell specific killing of two peptide specific T cell clones in BALB/c mice.

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Many infections elicit a strong CTL response, but occasionally, the quantity of responding cells does not correlate to control of the pathogen1. One measure of CTL quality is their ability to kill specifically2. CFSE labeling of target cells can be used to investigate this CTL response quality in vivo3,4.

Antigen-spezifische In Vivo Killing-Assay mit CFSE markierten Zielzellen

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation.  ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)

Tumor heterogeneity represents a fundamental feature supporting tumor robustness and presents a central obstacle to the development of therapeutic strategies1. To overcome the issue of tumor heterogeneity, it is essential to develop assays and tools enabling phenotypic, (epi)genetic and functional identification and characterization of tumor subpopulations that drive specific disease pathologies and represent clinically relevant targets. It is now well established that tumors exhibit distinct sub-fractions of cells with different frequencies of cell division, and that the functional criteria of being slow cycling is positively associated with tumor formation ability in several cancers including those of the brain, breast, skin and pancreas as well as leukemia2-8. The fluorescent dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) has been used for tracking the division frequency of cells in vitro and in vivo in blood-borne tumors and solid tumors such as glioblastoma2,7,8. The cell-permeant non-fluorescent pro-drug of CFSE is converted by intracellular esterases into a fluorescent compound, which is retained within cells by covalently binding to proteins through reaction of its succinimidyl moiety with intracellular amine groups to form stable amide bonds9. The fluorescent dye is equally distributed between daughter cells upon divisions, leading to the halving of the fluorescence intensity with every cell division. This enables tracking of cell cycle frequency up to eight to ten rounds of division10. CFSE retention capacity was used with brain tumor cells to identify and isolate a slow cycling subpopulation (top 5% dye-retaining cells) demonstrated to be enriched in cancer stem cell activity2. 
This protocol describes the technique of staining cells with CFSE and the isolation of individual populations within a culture of human glioblastoma (GBM)-derived cells possessing differing division rates using flow cytometry2. The technique has served to identify and isolate a brain tumor slow-cycling population of cells by virtue of their ability to retain the CFSE labeling.

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester CFSE

This video protocol demonstrates the application of the fluorescent dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) for the identification and separation of different sub-populations of cells in human glioblastoma based on frequency of cell division.

Identifizierung und Isolierung von Slow-teilenden Zellen im menschlichen Glioblastoma Mit Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)

Tumor heterogeneity represents a fundamental feature supporting tumor robustness and presents a central obstacle to the development of therapeutic ...

Medizin

Functional Characterization of Regulatory Macrophages That Inhibit Graft-reactive Immunity

Macrophage accumulation in transplanted organs has long been recognized as a feature of allograft rejection1. Immunogenic monocytes infiltrate the allograft early after transplantation, mount a graft reactive response against the transplanted organ, and initiate organ rejection2. Recent data suggest that suppressive macrophages facilitate successful long-term transplantation3 and are required for the induction of transplantation tolerance4. This suggests a multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation, and function, which demands a new roadmap for the isolation and analysis of macrophage function5. Due to the plasticity of macrophages, it is necessary to provide a methodology to isolate and characterize macrophages, depending on the tissue environment, and to define their functions according to different scenarios. Here, we describe a protocol for immune characterization of graft-infiltrating macrophages and the methods we used to functionally evaluate their capacity to inhibit CD8+ T proliferation and to promote CD4+Foxp3+ Treg expansion in vitro.

Macrophages are plastic cells of the hematopoietic system that have a crucial role in protective immunity and homeostasis. In this report, we describe optimized in vitro techniques to phenotypically and functionally characterize graft-infiltrating regulatory macrophages that accumulate in the transplanted organ under tolerogenic conditions.

Funktionelle Charakterisierung von regulatorischen Makrophagen, die eine pfropfreaktive Immunität hemmen

Macrophage accumulation in transplanted organs has long been recognized as a feature of allograft rejection1. Immunogenic monocytes infiltrate the ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses3. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting4 and the investigation of proliferative abilities by 3H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

Isolation und Aktivierung von murinen Lymphozyten

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

In Vivo Test zum Nachweis von Antigen-spezifischen T-Zell Zytolyse-Funktion mit einer Impfung-Modell

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, diabetic retinopathy, age-related macular degeneration (AMD) and other ocular inflammatory conditions. It may also help to monitor the therapeutic responses in the eye. The proper labeling of the blood cells, coupled with live-cell imaging of the labeled cells, allows for the investigation of the flow dynamics in the retinal and choroidal circulation. Here, we describe the standardized protocols of 1.5% indocyanine green (ICG) and 1% sodium fluorescein labeling of mice erythrocytes and leukocytes, respectively. Scanning laser ophthalmoscopy (SLO) was applied to visualize the labeled cells in the retinal circulation of C57BL/6J mice (wild type). Both methods demonstrated distinct fluorescently labeled cells in the mouse retinal circulation. These labeling methods can have wider applications in various ocular disease models.

Live-cell imaging of the labeled blood cells in ocular circulation can provide information about inflammation and ischemia in diabetic retinopathy and age-related macular degeneration. A protocol to label blood cells and image the labeled cells in the retinal circulation is described.

Fluoreszenzfarbstoff-Markierung von Erythrozyten und Leukozyten zum Studieren der Flußdynamik bei der Maus-Retinal-Zirkulation

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The development of stable, non-toxic, fluorescent dyes such as carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) allows for rare, antigen-specific T cells to be distinguished from bystanders by diminution in fluorescent staining, as detected by flow cytometry. This method has the following advantages over alternative approaches: (i) it is very sensitive to low-frequency T cells, (ii) no knowledge of the antigen or epitope is required, (iii) the phenotype of the responding cells can be analyzed, and (iv) viable, responding cells can be sorted and used for further analysis, such as T cell cloning.

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Presented here is a protocol for measuring proliferating CD4+ T cells in response to antigenic proteins or peptides using dye dilution. This assay is particularly sensitive to rare antigen-specific T cells and can be modified to facilitate cloning of antigen-specific cells.

Quantifizierung von proliferierenden humanen Antigen-spezifischen CD4+ T-Zellen mit Carboxyfluorescein Succinimidylester

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear ...

Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development

The assessment of modern sub-unit vaccines reveals that the generation of neutralizing antibodies is important but not sufficient for adjuvant selection. Therefore, adjuvants with both humoral and cellular immuno-stimulatory capabilities that are able to promote cytotoxic T lymphocytes (CTL) responses are urgently needed. Thus, faithful monitoring of adjuvant candidates that induce cross-priming and subsequently enhance CTL generation represents a crucial step in vaccine development. In here we present an application for a method that uses SIINFEKL-specific (OT-I) T cells to monitor the cross-presentation of the model antigen ovalbumin (OVA) in vivo in the presence of different adjuvant candidates. This method represents a rapid test to select adjuvants with the best cross-priming capabilities. The proliferation of CD8+ T cells is the most valuable indication of cross-priming and it is also regarded as a correlate of adjuvant-induced cross-presentation. This feature can be evaluated in different immune organs like lymph nodes and spleen. The extent of the CTL generation can also be monitored, thereby giving insights on the nature of a local (draining lymph node mainly) or a systemic response (distant lymph nodes and/or spleen). This technique further allows multiple modifications for testing drugs that can inhibit specific cross-presentation pathways and also offers the possibility to be used in different strains of conventional and genetically modified mice. In summary, the application that we present here will be useful for vaccine laboratories in industry or academia that develop or modify chemical adjuvants for vaccine research and development.

Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development

We present here an application for a standard immunological technique (CFSE stained OT-I proliferation) intended to rapidly monitor adjuvant-mediated cytotoxic T lymphocyte (CTL) generation in vivo. This fast estimation of CTL capacities is useful for the development of prophylactic vaccines against intracellular pathogens as well as therapeutic cancer vaccines.

Schnelle In-Vivo Beurteilung des Adjuvans der zytotoxischen T-Lymphozyten Generation Fähigkeiten für die Impfstoffentwicklung

The assessment of modern sub-unit vaccines reveals that the generation of neutralizing antibodies is important but not sufficient for adjuvant selection. ...

Cell Cycle Analysis: Assessing CD4 and CD8 T Cell Proliferation After Stimulation Using CFSE Staining and Flow Cytometry

Source: Perchet Thibaut1,2,3, Meunier Sylvain1,2,3, Sophie Novault4, Rachel Golub1,2,3 
1 Unit for Lymphpoiesis, Department of Immunology, Pasteur Institute, Paris, France 
2 INSERM U1223, Paris, France 
3 Universit&#233; Paris Diderot, Sorbonne Paris Cit&#233;, Cellule Pasteur, Paris, France 
4 Flow Cytometry Platfrom, Cytometry and Biomarkers UtechS, Center for Translational Science, Pasteur Institute, Paris, France
The cell cycle is a universal process of life. During the cell cycle, a cell undergoes several modifications to divide into two daughter cells. This mechanism occurs throughout an organism&#39;s life in response to its needs. Cell divisions and embryonic development produce a full organism from a single-celled zygote. During adulthood, the cell cycle is central to many critical biological processes, such as tissue repairs.
Mechanisms of cell division are tightly controlled events where the cell undergoes stepwise modifications before final division. Cells that are not yet in the cycle are described as being in the Gap 0 (G0) phase. During this stage the cell is considered quiescent. When the cell starts to cycle, four distinct phases are recognized: Gap 1 (G1), Synthesis (S), Gap 2 (G2) and Mitosis (M). G1 phase is a checkpoint for resources needed by the cell for DNA synthesis. Then, S phase occurs, and DNA replication starts, followed by the G2 interphase, another checkpoint that controls all elements necessary to for the cell to divide. Finally, the cell enters mitosis and divides into two daughter cells.
Cell division is a highly informative parameter in many different biological systems. In the field of immunology, analysis of leukocyte proliferation can indicate the mechanism of the immune response. Other domains of investigation also rely on cell cycle analysis. For instance, analysis of the cell cycle during tumor development has improved our understanding of cancer.
Many fluorescent dyes are now available for tracking cell proliferation. These dyes differ in their chemical and spectral properties. Two different classes of dyes exist: protein dyes permanently combine with protein by forming a covalent bond, and membrane dyes stably intercalate within cell membranes via strong hydrophobic associations. In vitro and in vivo studies of immune cell proliferation by flow cytometry are among the most common applications of both classes of cell tracking dyes (1, 2).
CFSE (Carboxyfluorescein succinimidyl ester) is a fluorescent dye that marks dividing cells. Initially, all the cells receive the same amount of dye; dividing cells evenly split the dye they received between their two daughter cells. Consequently, the cell cycle can be followed by the progressive decrease of dye intensity in the cells. CFSE staining is followed by conventional multi-parametric flow cytometry, a high-throughput, fluorescence-based technology that allows phenotypic and functional characterization of cells based on their degree of CFSE staining (3).
In the following experiment, we assess the proliferation of CD4+ and CD8+ T cells in-vitro, following CD3 stimulation, using CFSE staining and flow cytometry.

Cell Cycle Analysis: Assessing CD4 and CD8 T Cell Proliferation

Zellzyklusanalyse: Bewertung der Proliferation von CD4- und CD8-T-Zellen nach Stimulation mit CFSE-Färbung und Durchflusszytometrie

Source: Perchet Thibaut1,2,3, Meunier Sylvain1,2,3, Sophie Novault4, Rachel Golub1,2,3
1 Unit for Lymphpoiesis, Department of Immunology, Pasteur ...

Lehre

JoVE Science Education

Fortgeschrittene Biologie

Grundlagen der Immunologie

An In Vitro Assay for Evaluating the Immunomodulatory Impact of Monocytes on Leukocyte Proliferation

Source: Hsu, P., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/53265">Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells (MSCs).</a> J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates an in vitro assay to explore the immunomodulatory influence of mesenchymal stem cells (MSCs) on effector T cell proliferation. The assay includes co-culturing MSCs with PBMCs to induce the monocyte population to acquire an immunomodulatory phenotype, leading to the secretion of interleukin-10 (IL-10). Following incubation with activated CD4+ T cells, the induced monocytes effectively suppress T cell proliferation.

Ein In-vitro-Assay zur Bewertung des immunmodulatorischen Einflusses von Monozyten auf die Leukozytenproliferation

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
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