Name: cryopreserving and recovering of human ips cells using complete knockout serum replacement feeder-free medium
Uploaded: 2010-07-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
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Hinweis: Um sterile Kultur Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden alle Verfahren in diesem Protokoll unter Verwendung von sterilen Laborpraxis durchgeführt und führte unter einer Laminar-Flow-Haube. Vor dem Start, sicherzustellen, dass alle Medien äquilibriert bis 37 ° C und entsprechend vergast. Vorbereitung Geltrex-beschichteten Kulturschalen Hinweis: siehe Anhang für die Nutzung von CELLstart beschichteten Kulturschalen. <ol><li> Thaw eine Tube Geltrex (1 mL) langsam bei 2-8 ° C und verdünnt 1:100 in 99 ml Knockout D-MEM/F-12. Mischen Sie die Lösung vorsichtig. Hinweis: Einige iPS-Zelllinien kann eine andere Geltrex Verdünnung für ein optimales Wachstum benötigen. Siehe Anhang für alternative Verdünnungen. </li><li> Abdeckung der gesamten Oberfläche jeder Kulturschale mit dem Geltrex-Lösung (1 mL für eine 35-mm-Schale, 1,5 mL für eine 60-mm-Schale). </li><li> Seal jedes Gericht mit Parafilm zum Trocknen zu verhindern und inkubieren Sie die Gerichte für 1 Stunde bei 37 ° C. Hinweis: An dieser Stelle können Sie die Geltrex-beschichteten Kulturschalen bei 4 ° C lagern bis zu 1 Monat. Seal jedes Gericht mit Parafilm die Geltrex vor dem Austrocknen zu verhindern. </li><li> Vor dem Einsatz, übertragen Sie die Geltrex-beschichtete Platten zu einem Laminarströmungshaube und es ihnen ermöglichen, auf Raumtemperatur (ca. 1 Stunde) ausgleichen. </li></ol> Vorbereitung Komplette KnockOut SR Feeder-freiem Medium <ol><li> Zur Vorbereitung 1 mL von 10 pg / mL Grundlegende FGF-Lösung, aseptisch mischen die unten aufgeführten Komponenten. Aliquot der Lösung und bei -20 ° C bis zu 6 Monaten. <table border="0"><tbody><tr><td> Grundlegende FGF </td><td> 10 ug </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> 990μL </td></tr><tr><td> 10% BSA </td><td> 10 l </td></tr></tbody></table> Hinweis: BSA mit HSA oder Knockout SR in der gleichen Konzentration ersetzt werden. </li><li> Zur Vorbereitung 50 ml 2 mg / mL Dispase-Lösung, aseptisch mischen die unten aufgeführten Komponenten. Filter sterilisieren der Lösung und lagern bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen. <table border="0"><tbody><tr><td> Dispase </td><td> 100 mg </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> 50 mL </td></tr></tbody></table></li><li> Zur Herstellung von 100 ml komplette KnockOut SR Feeder-Free (KSR-FF) aseptisch verbinden die Komponenten in der Tabelle unten aufgeführt. <table border="1"><tbody><tr><td> Komponente </td><td> Lager-Konzentration </td><td> Endkonzentration </td><td> Volumen </td></tr><tr><td> Knockout DMEM/F12 (Kat.-Nr. 12660-012) </td><td> - </td><td> 1X </td><td> 76,8 mL </td></tr><tr><td> Glutamax-I (Kat. Nr. 35050-061) </td><td> 200 mM </td><td> 2 mM </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> KnockOut SR (Kat.-Nr. 10828-028) </td><td> - </td><td> 20% </td><td> 20 mL </td></tr><tr><td> KnockOut SR-GFC (Kat.-Nr. A10580-01) </td><td> 50X </td><td> 1X </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td> bFGF (Kat.-Nr. PHG0024). </td><td> 10 ug / mL </td><td> 20 ng / mL </td><td> 200 ul </td></tr></tbody></table> Sie können die KSR-FF Medium bei 2-8 ° C lagern bis zu einer Woche. </li><li> Kurz vor pre-Gleichgewicht der gesamten mittel-bis Temperatur und Gase, aseptisch fügen Sie die erforderlichen Volumen von 2 Mercaptoethanol (55 mM Lager-Konzentration) für eine 0,1 mM Endkonzentration. Um zum Beispiel die Zubereitung von 100 ml KSR-FF medium 182 ul 55 mM 2-Mercaptoethanol (1:550 Verdünnung) Alternativ kann die 2-Mercaptoethanol zum 1X fertig zugesetzt werden und bei 2-8 ° C bis zu einer Woche. </li></ol> Vorbereitung Freezing / Kryokonservierungsmedium Die Kryokonservierung Medium besteht aus zwei Medien; Freezing Medium A und Einfriermedium B. Sie sind, um die Zellen zu unterschiedlichen Zeiten aufgenommen und müssen getrennt bleiben. Sie sind jeweils 50% des Gesamtvolumens der Kryokonservierung Medium benötigt. Das Gesamtvolumen der Kryokonservierung Medium benötigt wird 1 ml pro Fläschchen eingefroren werden. A 90% konfluent 60mm Teller hESC kann zu Bank 2 Fläschchen hESC in Kryokonservierung Medien eingesetzt werden. Bereiten Sie genügend Volumen von jeweils Freezing Medium mit einer zusätzlichen 2-5ml bis overage zu gewährleisten. <table border="1"><tbody><tr><td> Freezing Medium A (50% Endvolumen): </td><td> 50% DMEM/F12 </td><td> 50% KSR </td></tr><tr><td> Freezing Medium B (50% Endvolumen): </td><td> 80% DMEM/F12 </td><td> 20% DMSO </td></tr></tbody></table> Beispiel: Wenn Sie das Einfrieren 20 Ampullen von Zellen sind, müssen Sie 20 mL der Kryokonservierung Medium. Add 4mL für overage für eine Gesamtmenge von 24ml Kryokonservierung Medium. Das heißt, Sie müssen 12ml von Freezing Medium A (50% 24ml) und 12ml der Freezing Medium B (50% 24ml). <table border="1"><tbody><tr><td> Freezing Medium A (12 ml): </td><td> 6 mL DMEM/F12 </td><td> 6 mL KSR </td></tr><tr><td> Freezing Medium B (12 ml): </td><td> 9,6 ml DMEM/F12 </td><td> 2,4 ml DMSO </td></tr></tbody></table> Die endgültige Zusammensetzung der Kryokonservierung Medium beträgt 65% DMEM/F12, 25% KSR, und 10% DMSO. Kryokonservierung IPSCs <ol><li> Pre-warm das erforderliche Volumen der Dispase in einem 37 ° C Wasserbad. Siehe Tabelle 1 unten für Details auf den Datenträgern erforderlich. </li><li> Pre-Gleichgewicht das erforderliche Volumen des KSR-FF in einem 37 ° C Wasserbad for15 min. Siehe Tabelle 1below für Details auf den Datenträgern erforderlich. </li><li> Saugen Sie das verbrauchte Medium aus dem Kulturgefäß mit einer Pipette, und spülen Sie die Zellen zweimal mit D-PBS. </li><li> Vorsichtig fügen vorgewärmten Dispase-Lösung, um die Kultur Gefäß (z. B. 1 ml Dispase-Lösung pro 60-mm Kulturschale). Swirl das Kulturgefäß zu beschichten die gesamte Zelloberfläche. </li><li> Inkubieren Sie die Behälter bei 37 ° C für 3 Minuten. </li><li> Entfernen Sie das Gefäß aus dem Inkubator, absaugen Dispase-Lösung und vorsichtig waschen der Zellen mit D-PBS. </li><li> Vorsichtig kratzen die Zellen von der Oberfläche der Kulturschale mit einem Zellschaber, und übertragen Sie die Zellen in ein steriles 15 ml Zentrifugenröhrchen. </li><li> Spülen Sie die Kulturschale zweimal mit KSR-FF, sanft &quot;Abspritzen&quot; alle Zellen, die nicht getrennt haben. Pool der Spül-Medium mit den Zellen in der 15 ml Tube. </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 200 xg für 5 Minuten bei Raumtemperatur die Zellen zu pelletieren. </li><li> Vorsichtig absaugen der Überstand ohne die Zellpellet und entsorgen Sie sie. </li><li> Bereiten Sie eine ausreichende Menge an Kryoröhrchen. Sobald die Zellen in Kontakt mit DMSO sind, sollten sie aliquotiert und eingefroren werden innerhalb von 2-3 Minuten. </li><li> Gently Flick das Rohr voll zu verdrängen das Zellpellet aus dem Rohrboden und wieder die Zellen in Einfriermedium A. [durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren mit einer 5-ml-serologischen Pipette]. Nach gleichmäßige Suspension von Klumpen, fügen gleichen Volumen Einfriermedium B, um es in einem tropfenweise Weise, unter leichtem Schwenken der Zellsuspension zu mischen. Hinweis: An dieser Stelle werden die Zellen in Kontakt mit DMSO, und die Arbeit muss effizient durchgeführt werden. Sobald Zellen in Kontakt mit DMSO sind, sollten sie aliquotiert und eingefroren werden innerhalb von 2-3 Minuten. </li><li> Aliquot von 1 ml der Zellsuspension in jedes Kryoröhrchen. </li><li> Raschen Platzierung der Röhrchen in einem Mr. Frosty [schnell einfrieren] und überträgt es auf -80 ° C über Nacht. </li><li> Nach Lagerung über Nacht bei -80 ° C, übertragen Sie die Zellen, um eine flüssige Stickstoff-Tank für die langfristige Lagerung. </li></ol> iPSC Fläschchen auftauen und die Erholung der Zellen Hinweis: KSR-FF kann mit KSR-haltigen MEF-konditioniertem Medium oder KSR Medium für den Einsatz mit Zubringern ersetzt werden. Siehe Anhang finden Sie Anweisungen für die mediale Aufbereitung. Pre-warmen 10 mL KSR-FF-Medium in einem 50 ml Tube. <ol><li> Äquilibrieren der entsprechenden Menge Geltrex-beschichtete Platten auf Raumtemperatur und saugen jede Flüssigkeit aus der Gerichte nur vor dem Plattieren Sier-Zellen. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die hESC (oder IPSC) Fläschchen aus flüssigem Stickstoff Storage Tank. </li><li> Schnell Tauwetter gefrorenen Fläschchen von Zellen in einer 37 ° C Wasserbad, bis nur ein kleiner gefrorener Klumpen bleibt in der Flasche. </li><li> Spray Flasche mit 70% Isopropanol zu dekontaminieren und überträgt es auf die sterile Gewebekulturen Kapuze. </li><li> Überführen Sie den gesamten Inhalt des Fläschchens in einen 15 mL konischen Rohr mit einer 5-ml-Pipette. </li><li> Spülen Sie die Flasche mit 1 mL der KSR-FF und stell &#39;das zu den 15 mL Zentrifugenröhrchen. </li><li> Langsam, 4 ml KSR-FF, um Zellen in der 15 ml konischen Rohr tropfenweise. Beim Hinzufügen des Mediums, sanft bewegen Sie den Schlauch hin und her, um die Zellen zu mischen. (Dies reduziert osmotischen Schock der Zellen). </li><li> Zentrifugieren Sie die 15 ml Tube mit der Zellsuspension bei 1000rpm (200 x g) für 2 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Vorsichtig absaugen und den Überstand verwerfen, ohne das Zellpellet. </li><li> Re-suspend das Zellpellet in vorgewärmten KSR-FF (zB 4mL/60 mm-Schale) mit einer 5-ml-Pipette und sanft Pipette die Zellen auf und ab, bis Zellpellet vollständig dispergiert ist. Ein Lebensfähigkeit von mehr als 70% zu erwarten ist, wenn die Lebensfähigkeit von weniger als 70%, kann es länger dauern, bis die Zellen bis zur Konfluenz zu erreichen. </li><li> Mit der gleichen Pipette die Zellsuspension auf Geltrex-beschichtete Kulturschale voräquilibriert auf Raumtemperatur tropfenweise. </li><li> Legen Sie die Kulturschale in einem 37 ° C Inkubator mit einer angefeuchteten Atmosphäre von 4 bis 6% CO 2 in Luft. Vorsichtig schwenken Schiff in einem von Norden nach Süden, von Osten nach Westen Muster zur gleichmäßigen Verteilung der Zellen. </li><li> Gently Fluid-Änderung der Kulturschale 24 Stunden nach dem Auftauen und danach täglich um Zelltrümmer zu entfernen und an die frische Nährstoffe liefern, bis das Gericht ist etwa 70-80% konfluent. Für die weitere Kultur und Passagierung der iPS-Zellen, zu unserem Protokoll mit dem Titel &quot;Feeder-Free Culture und Passagieren der menschlichen iPS-Zellen unter Verwendung Komplette KnockOut Serum Ersatz Feeder-freiem Medium&quot; beziehen </li></ol> Erwartete Ergebnisse Die Zellen sollten in etwa 70-80% konfluent vor Kryokonservierung werden. Dispase Verdauung Ergebnisse in Einrollen und Falzen der Kolonien entlang der Kolonie Margen. Nach der Ernte der Zellen werden sie als kleine Klumpen im Kryokonservierung Medien eingefroren. Sobald die Flasche wird aufgetaut, wieder Zellen und heften sich an die vorbeschichteten Gericht als kleine Klumpen. Sie wachsen schnell, was zu einer konfluenten Schale in 5-6 Tagen. Tabelle 1 - Empfohlene Volumes <table border="1"><tbody><tr><td> Komponente </td><td> 35mm Dish </td><td> 60mm Dish </td><td> 100mm Dish </td></tr><tr><td> Komplette KnockOut SR Medium </td><td> 2 mL </td><td> 4 mL </td><td> 10 mL </td></tr><tr><td> Geltrex Lösung </td><td> 1 mL </td><td> 1,5 ml </td><td> 4-5 ml </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> 0,5 ml </td><td> 1 mL </td><td> 3-4 mL </td></tr><tr><td> D-PBS für das Spülen </td><td> 2 mL </td><td> 4 mL </td><td> 10 mL </td></tr></tbody></table> Bitte <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/2237/2237_appendix.pdf">klicken Sie hier, um die Anlage zu sehen</a> .

<ol>
	<li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li><li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li><li>Maherali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+and+techniques+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).</li><li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+rat+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+combining+genetic+reprogramming+and+chemical+inhibitors.">Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors.</a> Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).</li><li>Liao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines+from+adult+rat+cells.">Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells.</a> Cell Stem Cell. 4, 11-15 (2009).</li><li>Dimos, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+patients+with+ALS+can+be+differentiated+into+motor+neurons.">Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons.</a> Science. 321, 1218-1221 (2008).</li><li>Aasen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes.">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnli. 26, 1276-1284 (2008).</li><li>Park, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of human-induced pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 3, 1180-1186 (2008).</li></ol>

<table><tbody><tr><td>Knockout DMEM/F12</td><td></td><td>12660-012</td><td>Note: see appendix for the use of alternative DMEM products GlutaMAX-I (Cat. No. 35050-061)</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td></td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement Growth Factor Cocktail</td><td></td><td>A10580-01</td><td></td></tr><tr><td>FGF-basic, human recombinant protein, 10 &amp;mu;g</td><td></td><td>PHG0024</td><td>Note: see appendix for alternative bFGF pack sizes.</td></tr><tr><td>2-Mercapt&amp;#8211;thanol</td><td></td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td></td><td>17105-041</td><td>Note: see appendix for alternative passaging methods</td></tr><tr><td>Geltrex hESC-Qualified Reduced Growth Factor Basement Matrix, 1 mL</td><td></td><td>A10480-01</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) without calcium and magnesium</td><td></td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, 500mL</td><td>JT Baker</td><td>JT9224-1</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Tissue Culture Hood</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator set at 37&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette-Aid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water Bath set at 37&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile serological pipettes (5 mL, 10 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL centrifuge tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 mm Tissue Culture treated dishes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquid nitrogen storage tank</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol freezing containers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Cryovials</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cryopreserving and recovering of human ips cells using complete knockout serum replacement feeder-free medium

Die Entdeckung im Jahr 2006, dass Mensch und Maus-Fibroblasten umprogrammiert könnte zu iPS-Zellen 1-3 mit Qualitäten bemerkenswert ähnlich wie embryonale Stammzellen zu erzeugen ist eine wertvolle neue Quelle für pluripotente Zellen für die Wirkstoffforschung, Zell-Therapie und Grundlagenforschung geschaffen. GIBCO Medien und Reagenzien sind an der Spitze der pluripotenten Stammzellen seit Jahren. Knockout DMEM mit Knockout Serum Replacement ergänzt wird das Medium der Wahl für die embryonalen Stammzellen das Wachstum und nun iPS Zellkultur 3-9. Dieser Goldstandard Medien kann nun für Feeder-freien Kultur mit der Zugabe von Knockout SR Growth Factor Cocktail verwendet werden. Traditionelle menschliche ES-und iPS-Zellkultur-Methoden erfordern den Einsatz von Maus oder humanen Fibroblasten Feederschichten oder Feeder-konditioniertem Medium. Diese Kultur Methoden sind arbeitsintensiv, hart zu skalieren und es ist schwierig, Hüften Zellen undifferenziert wegen der undefinierten Zustand zu erhalten. Invitrogen hat Knockout SR Growth Factor Cocktail entwickelt, damit Sie auf einfache Weise Übergang Hüfte und hES-Zell-Kulturen zu Feeder-free unter Beibehaltung Ihrer Benutzung der Knockout SR.

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Cryopreserving and Recovering of Human iPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

Dieses Protokoll beschreibt die Einzelheiten des Verfahrens zur Kryokonservierung humanen iPS-Zellen in KnockOut SR Kryokonservierungsmedium und Gewinnung dieser Zellen in völliger KnockOut SR Feeder Free (KSR-FF) mittel-oder Feeder-basierte KnockOut SR Medium.

Kryokonservierung und Wiederherstellen von Human iPS-Zellen unter Verwendung Komplette KnockOut Serum Ersatz Feeder-freiem Medium

The discovery in 2006 that human and mouse fibroblasts could be reprogrammed to generate iPS cells 1-3 with qualities remarkably similar to embryonic stem ...

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Research

JoVE Journal

Biology

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Serie: Cryopreserving and Recovering of Human iPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

Generating iPS Cells from MEFS through Forced Expression of Sox-2, Oct-4, c-Myc, and Klf4

Pluripotency can be induced in differentiated murine by viral transduction of Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc (Takahashi and Yamanaka, 2006; Wernig, et al., 2007; Okita, et al., 2007; Maherali, et al., 2007). We have devised a reprogramming strategy in which these four transcription factors are expressed from doxycycline (dox)-inducible lentiviral vectors (Brambrink et al., 2008). Using these inducible constructs, we can derive induced pluripotent stem (iPS) cells from mouse embryonic fibroblasts (MEFs). In this video, we demonstrate the procedure for the generation of inducible lentiviruses that express the four transcription factors and show how to infect MEFs with these viruses in order to produce iPS cells. By using inducible lentiviruses, the expression of the four factors in controlled by the addition of doxycyline to the culture medium. The advantage of this system over the traditional retroviral infection is the ability to turn the genes on and off so that the kinetics of reprogramming and gene expression requirements can be analyzed in detail.

This video shows the procedure for generating induced pluripotent stem cells using inducible lentivirus that express Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4.

Generieren von iPS-Zellen aus MEFS durch Forced Expression von Sox-2, Oct-4, c-Myc und Klf4

Pluripotency can be induced in differentiated murine by viral transduction of Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc (Takahashi and Yamanaka, 2006;  Wernig, et al., ...

Forschung

Biologie

Small-scale Propagation of Human iPSCs in Serum-free Conditions for Routine Immunocytochemical Characterization

There is great interest in utilizing human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) for disease modeling and cell therapeutics due to their patient specificity and characteristic stemness. However, the pluripotency of iPSCs, which is essential to their functionality, must be confirmed before these cells can be used in such applications. While a rigorous characterization of iPSCs, through different cellular and functional assays is necessary to establish their pluripotency, routine assessment of pluripotency maintenance can be achieved more simply and effectively through immunocytochemical techniques. Here, we present a systematic protocol for culturing hiPSCs, in a scaled-down manner, to particularly facilitate the verification of their pluripotent state using immunocytochemistry. More specifically, this methodology encompasses an efficient and cost-effective means of growing iPSCs in serum-free conditions and plating them on small chamber slides or glass coverslips ideal for immunocytochemistry.

Regular characterization of induced pluripotent stem cells (iPSCs), to ascertain maintenance of their pluripotent state, is an important step before these cells are used for other applications. Here we describe a method for the small-scale propagation of human iPSCs specifically designed to enable their easy and routine characterization via immunocytochemistry.

Kleines Vermehrung von menschlichen iPS-Zellen in Serum-freien Bedingungen für die Routine Immunzytochemische Charakterisierung

There is great interest in utilizing human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) for disease modeling and cell therapeutics due to their patient ...

Entwicklungsbiologie

Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of human-induced pluripotent stem cells (iPSCs) is particularly attractive for neurodegenerative disease studies, including retinal dystrophies, where iPSC-derived retinal cell models mark a major step forward to understand and fight blindness. In this paper, we describe a simple and scalable protocol to generate, mature, and cryopreserve retinal organoids. Based on medium changing, the main advantage of this method is to avoid multiple and time-consuming steps commonly required in a guided differentiation of iPSCs. Mimicking the early phases of retinal development by successive changes of defined media on adherent human iPSC cultures, this protocol allows the simultaneous generation of self-forming neuroretinal structures and retinal pigmented epithelial (RPE) cells in a reproducible and efficient manner in 4 weeks. These structures containing retinal progenitor cells (RPCs) can be easily isolated for further maturation in a floating culture condition enabling the differentiation of RPCs into the seven retinal cell types present in the adult human retina. Additionally, we describe quick methods for the cryopreservation of retinal organoids and RPE cells for long-term storage. Combined together, the methods described here will be useful to produce and bank human iPSC-derived retinal cells or tissues for both basic and clinical research.

The production of specialized retinal cells from pluripotent stem cells is a turning point in the development of stem cell-based therapy for retinal diseases. The present paper describes a simple method for an efficient generation of retinal organoids and retinal pigmented epithelium for basic, translational, and clinical research.

Definierten Xeno-frei und Feeder-freie Kulturbedingungen für die Generation der menschlichen iPSC-abgeleitete Retinal Zellmodellen

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

Feeder-Free Adaptation, Culture and Passaging of Human IPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

The discovery in 2006 that human and mouse fibroblasts could be reprogrammed to generate iPS cells 1-3 with qualities remarkably similar to embryonic stem cells has created a valuable new source of pluripotent cells for drug discovery, cell therapy, and basic research.
GIBCO media and reagents have been at the forefront of pluripotent stem cell research for years. Knockout DMEM supplemented with Knockout Serum Replacement is the media of choice for embryonic stem cell growth and now iPS cell culture 3-9. This gold standard media system can now be used for feeder-free culture with the addition of Knockout SR Growth Factor Cocktail.
Traditional human ES and iPS cell culture methods require the use of mouse or human fibroblast feeder layers, or feeder-conditioned medium. These culture methods are labor-intensive, hard to scale and it is difficult to maintain hiPS cells undifferentiated due to the undefined conditions. Invitrogen has developed Knockout SR Growth Factor Cocktail to allow you to easily transition your hiPS cell cultures to feeder-free while still maintaining your use of Knockout SR.

The following protocol provides instruction for adapting human induced Pluripotent Stem (iPS) Cells to feeder-free culture using complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free medium (KSR-FF). Once adapted, instructions for continual maintenance are also provided.

Feeder-freie Adaption, Kultur und Passagierung der Menschenrechte iPS-Zellen mit Komplett KnockOut Serum Ersatz Feeder-freiem Medium

Human Pluripotent Stem Cell Culture on Polyvinyl Alcohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels with Varying Stiffness Under Xeno-Free Conditions

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by several researchers. However, most of these investigators have used polyacrylamide hydrogels for stem cell culture in their studies. Therefore, their results are controversial because those results might originate from the specific characteristics of the polyacrylamide and not from the physical cue (stiffness) of the biomaterials. Here, we describe a protocol for preparing hydrogels, which are not based on polyacrylamide, where various stem, cells including human embryonic stem (ES) cells and human induced pluripotent stem (iPS) cells, can be cultured. Hydrogels with varying stiffness were prepared from bioinert polyvinyl alcohol-co-itaconic acid (P-IA), with stiffness controlled by crosslinking degree by changing crosslinking time. The P-IA hydrogels grafted with and without oligopeptides derived from extracellular matrix were investigated as a future platform for stem cell culture and differentiation. The culture and passage of amniotic fluid stem cells, adipose-derived stem cells, human ES cells, and human iPS cells is described in detail here. The oligopeptide P-IA hydrogels showed superior performances, which were induced by their stiffness properties. This protocol reports the synthesis of the biomaterial, their surface manipulation, along with controlling the stiffness properties and finally, their impact on stem cell fate using xeno-free culture conditions. Based on recent studies, such modified substrates can act as future platforms to support and direct the fate of various stem cells line to different linkages; and further, regenerate and restore the functions of the lost organ or tissue.

A protocol is presented to prepare polyvinyl alcohol-co-itaconic acid hydrogels with varying stiffness, which were grafted with and without oligopeptides, to investigate the effect of the stiffness of biomaterials on the differentiation and proliferation of stem cells. The stiffness of the hydrogels was controlled by the crosslinking time.

Menschlichen pluripotenten Stammzelle-Kultur auf Polyvinyl Alkohol-Co-Itaconic Säure Hydrogele mit unterschiedlicher Steifigkeit Xeno-freien Bedingungen

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by ...

Biotechnik

Induzierte Differenzierung pluripotenter Stammzellen mit Hilfe eines automatisierten Kultursystems

An Automated Culture System for Maintaining and Differentiating Human-Induced Pluripotent Stem Cells

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) with infinite self-proliferating ability have been expected to have applications in numerous fields, including the elucidation of rare disease pathologies, the development of new medicines, and regenerative medicine aiming to restore damaged organs. Despite this, the social implementation of hiPSCs is still limited. This is partly because of the difficulty of reproducing differentiation in culture, even with advanced knowledge and sophisticated technical skills, due to the high sensitivity of iPSCs to minute environmental changes. The application of an automated culture system can solve this issue. Experiments with high reproducibility independent of a researcher's skill can be expected according to a shared procedure across various institutes. Although several automated culture systems that can maintain iPSC cultures and induce differentiation have been developed previously, these systems are heavy, large, and costly because they make use of humanized, multi-articulated robotic arms. To improve on the above issues, we developed a new system using a simple x-y-z axis slide rail system, allowing it to be more compact, lighter, and cheaper. Furthermore, the user can easily modify parameters in the new system to develop new handling tasks. Once a task is established, all the user needs to do is prepare the iPSC, supply the reagents and consumables needed for the desired task in advance, select the task number, and specify the time. We confirmed that the system could maintain iPSCs in an undifferentiated state through several passages without feeder cells and differentiate into various cell types, including cardiomyocytes, hepatocytes, neural progenitors, and keratinocytes. The system will enable highly reproducible experiments across institutions without the need for skilled researchers and will facilitate the social implementation of hiPSCs in a wider range of research fields by diminishing the obstacles for new entries.

Autor im Rampenlicht: Automatisierung der iPSC-Kultur für verbesserte Reproduzierbarkeit 

Here, we present a protocol for an automated cell culture system. This automated culture system reduces labor and benefits the users, including researchers unfamiliar with handling induced pluripotent stem (iPS) cells, from the maintenance of iPS cells to differentiation into various types of cells.

Ein automatisiertes Kultursystem zur Erhaltung und Differenzierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) with infinite self-proliferating ability have been expected to have applications in numerous fields, ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is essential first to generate functional human cardiomyocytes (CMs). The use of these cells in drug discovery and toxicology studies would also be highly beneficial, allowing new pharmacological molecules for the treatment of cardiac disorders to be validated pre-clinically on cells of human origin. Of the possible sources of CMs, induced pluripotent stem (iPS) cells are among the most promising, as they can be derived directly from readily accessible patient tissue and possess an intrinsic capacity to give rise to all cell types of the body 1. Several methods have been proposed for differentiating iPS cells into CMs, ranging from the classical embryoid bodies (EBs) aggregation approach to chemically defined protocols 2,3. In this article we propose an EBs-based protocol and show how this method can be employed to efficiently generate functional CM-like cells from feeder-free iPS cells.

Pluripotent stem cells, either embryonic or induced pluripotent stem (iPS) cells, constitute a valuable source of human differentiated cells, including cardiomyocytes. Here, we will focus on cardiac induction of iPS cells, showing how to use them to obtain functional human cardiomyocytes through an embryoid bodies-based protocol.

Generation of Human Cardiomyocytes: Eine Differenzierung Protokoll von Feeder-freien menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human iPS cells (iPS-RPE), and fetal RPE. The protocols include collection of RNA for analysis by microarray, and the analysis of microarray data to identify miRNAs that are differentially expressed among three cell types. The methods for culture of iPS cells and fetal RPE are explained. The protocol used for differentiation of RPE from human iPS is also described. The RNA extraction technique we describe was selected to allow maximal recovery of very small RNA for use in a miRNA microarray. Finally, cellular pathway and network analysis of microarray data is explained. These techniques will facilitate the comparison of the miRNA profiles of three different cell types.

The microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human induced-pluripotent stem (iPS) cells (iPS-RPE), and fetal RPE, were compared.

MicroRNA Expressionsprofile der Menschen iPS-Zellen, Retinapigmentepithel Abgeleitet aus iPS und Fetal Retinapigmentepithel

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Kryokonservierung und Wiederherstellen von Human iPS-Zellen unter Verwendung Komplette KnockOut Serum Ersatz Feeder-freiem Medium

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Generieren von iPS-Zellen aus MEFS durch Forced Expression von Sox-2, Oct-4, c-Myc und Klf4

Kleines Vermehrung von menschlichen iPS-Zellen in Serum-freien Bedingungen für die Routine Immunzytochemische Charakterisierung

Definierten Xeno-frei und Feeder-freie Kulturbedingungen für die Generation der menschlichen iPSC-abgeleitete Retinal Zellmodellen

Feeder-freie Adaption, Kultur und Passagierung der Menschenrechte iPS-Zellen mit Komplett KnockOut Serum Ersatz Feeder-freiem Medium

Menschlichen pluripotenten Stammzelle-Kultur auf Polyvinyl Alkohol-Co-Itaconic Säure Hydrogele mit unterschiedlicher Steifigkeit Xeno-freien Bedingungen

Ein automatisiertes Kultursystem zur Erhaltung und Differenzierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen

Ein automatisiertes Kultursystem zur Erhaltung und Differenzierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen

Ein automatisiertes Kultursystem zur Erhaltung und Differenzierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen

Generation of Human Cardiomyocytes: Eine Differenzierung Protokoll von Feeder-freien menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

MicroRNA Expressionsprofile der Menschen iPS-Zellen, Retinapigmentepithel Abgeleitet aus iPS und Fetal Retinapigmentepithel