Diese Arbeit wurde durch ein RO1 von NIH und Merit Bewertungen aus der VA Research Service nach C-MT unterstützt, und eine individuelle NRSA auf CWL

Allgemeine Überlegungen zum Entwurf Wenn die Wellenlänge des Foto Stimulation ist im sichtbaren Bereich, wie zum optogenetische Experimente, wird das Layout des Systems wesentlich einfacher als für UV-Photolyse-Experimenten. Man braucht nur ein Dual-Kamera-Anschluss-Modul, das zur Verfügung von allen Mikroskop Unternehmen zu erwerben. Die DMD-Ebene kann die konjugierte Bildebene entweder eine der beiden Kamera-Ports platziert werden. Aber in UV-Photolyse das Licht aus dem DMD muss durch die Auflicht-Pfad (Abb. 3A) gebracht werden, weil die Bildgebung Tubuslinse was zu der Kamera ist nicht für die UV-Wellenlänge in einem der im Handel erhältlichen Mikroskope korrigiert. Die sphärische Aberration der Bildgebung Tubuslinse bei 350 nm ist stark genug, um die Fähigkeit, Licht zu einem festen Punkt zu konzentrieren und ausreichende räumliche Auflösung zu erzeugen verhindern. Dieses Problem ist nicht in der konfokalen Mikroskopie gestoßen, weil das Rohr Linse entfernt wird, wenn einem kollimierten Laserstrahl wird in auf der gleichen optischen Achse gebracht. Das Problem der UV-Beleuchtung kann durch zu bringen in das Licht durch die epi-Fluoreszenz-Weg gelöst werden, weil die Tubuslinsen es alle sind teilweise für die sphärische Aberration bei einer UV-Wellenlänge korrigiert. Wir können uns auf die Optik des Mikroskops zu irgendeinem Grad der Zeitschrift Wünschen zu erweitern. Die wissenschaftliche Gemeinschaft ist in der Regel schnell Interesse an diesem Thema und es gibt nicht viele Quellen, die sie lehrt gut. Um Änderungen des Mikroskops zu minimieren und wegen der engen Platzverhältnisse an der Epi-Fluoreszenz-Einheit, wird die DMD bei einem neu erstellten Konjugat Bildebene durch eine Relais-Linse (Punkt die Position des DMD-Einheit in Bezug auf die erstellte platziert Mikroskop). Eine kommerzielle UV korrigiert Relais-Linse gekauft wurde (Specialty Optics) (Stelle in der Grafik und am Mikroskop). Illumination des DMD Nach Erhalt ihrer Binäreingang Mikrospiegel können zwischen einer positiven und einer negativen 12 ° Neigung relativ zur Ebene des Chips wechseln. Die Drehachse ist entlang der diagonalen Ecken jedes Spiegels (45 ° zu den Seiten des Chips). Die Ausrichtung der Spiegel Rotation wird durch eine goldfarbene Dreieck an einer Ecke auf der Vorderseite des Chips bezeichnet. Der Neigungswinkel der Mikrospiegel bestimmt die Ausrichtung der Tonhöhe und azithmus der eingehenden Beleuchtungsstrahlengang. Die Tonhöhe des Beleuchtungsstrahlengang Bedürfnisse zu 24 ° von der senkrechten Achse des DMD-Chip und azithmus muss senkrecht zur Achse der Spiegel Rotation sein. Präzise Strahlausrichtung ist von entscheidender Bedeutung für einen effizienten Betrieb. In der Prototyp-System entwickelten wir mehrfache manuelle Neigung Anpassungen, die wir für die Konstruktion und Bearbeitung Unzulänglichkeiten zu korrigieren erlaubt. Dies führte zu einem System, das wesentlich sperriger als nötig ist. Alternate, kompaktere Anordnung für die Erhebung in das Licht möglich ist (zeigen alternative Design, wenn als nützlich erachtet werden). Für Photolyse-Experimenten eine Laserquelle ist erforderlich, um zu erzeugen die hohe Lichtintensität fokussierten Strahl, die für eine schnelle Uncaging. Für optogenetische Experimente, in denen mit hoher Intensität scharf fokussiertem Licht nicht erforderlich ist, würde ein nicht-kohärenten Lichtquelle ausreichend sein. In der Photolyse hier beschriebenen Experiment verwendeten wir eine quasi-kontinuierliche diodengepumpten Festkörper (DPSS) Frequenz verdreifacht NdVO4 Laser (1 W, 355 nm). (Für eine ausführliche Diskussion über die Wahl von Lichtquellen für die Photolyse siehe Referenz 2). Ein relativ hoher Power-Laser ist in den hier beschriebenen Experimenten erforderlich, da nur ein kleiner Bruchteil der Laserleistung ist eigentlich auf die Probe abgegeben, wenn mit einem DMD-System. Die Menge des Lichts geliefert, die Probe ist proportional zum Verhältnis der Anzahl der ON / OFF Spiegel innerhalb der Region durch den Laserstrahl beleuchtet. Wenn ein Laser-Lichtquelle benötigt wird, ist es am besten auf den Ausgang des Lasers in eine Multimode-Faser zu starten, so dass es leicht Position und orientiert an der richtigen Achse zur Beleuchtung des DMD kann. Die Übertragung des Lichts durch die Glasfaser löst ein zweites Problem, wie die Speckle-Muster inhärent kohärenten Beleuchtung zu beseitigen. Die Faser ist um einen piezoelektrischen Fasern Keilrahmen (Modell 915, Canadian Instrumentation &amp; Research, Ltd), die bei ~ 40 kHz schwingt Wunde. (Punkt dieser in das Rigg) Die mikroskopische Dehnung der Faser ist ausreichend, um bewegt sich der Speckle-Muster viele Male während der Millisekunden für jedes Foto Stimulationsimpulses, so wirkungsvoll eliminiert die Wirkung von Bildrauschen. Der Ausgang der optischen Faser wird anschließend mit einer UV-Mikroskop-Objektiv (Olympus DApo20UV) kollimiert. (Punkt dieser out) Eine Kalibrierung des optischen Auflösung des Systems ist in Abb.. 3B. Die effektive physiologische Auflösung durch die Amplitude des Stromflusses in Abhängigkeit von der Position des Flecks von Foto gemessenStimulation ist in Abb.. 3C. Aktuelle Antworten auf Photostimulation verschiedener Intensitäten sind in Abb. dargestellt. 3D. Der Betrieb des Systems: Co-Registrierung der CCD-Pixel mit der DMD-Spiegel Eine Inhouse-Software geschrieben wurde, der bestimmt, die Korrespondenz der einzelnen DMD-Spiegel auf bestimmte Pixel des Imaging-CCD-Kamera. Die grafische Benutzeroberfläche (GUI) innerhalb dieser Software erlaubt es dem Benutzer, die DMD-Spiegel, die in der Region entspricht auf der CCD-Bildsensor mit der Maus markiert zuweisen. So kann die Location für Foto-Stimulation durch einfaches Bewegen Sie den Cursor über das Bild auf dem Computerbildschirm angezeigt und auf den markierten Bereich von Interesse markiert werden. (A Fluoreszenzbild eines dendritischen Dorn wird auf dem Bildschirm angezeigt werden. Studenten werden eine Reihe von Standorten auf das Bild auf dem Bildschirm zu markieren.) Die Programmierung der Muster für leichte Lieferwagen Das Muster auf dem Bildschirm durch den Betreiber markiert ist als eine Reihe von einzelnen Bildern gespeichert. Der Zeitpunkt der Laserpulse für jede räumliche Muster wird dann in die Software, die mit der Datenerfassung Programm (pClamp) integriert ist programmiert. (Demonstrieren). Die Koordination der Laserpulse auf die DMD-Muster Die Datenerfassung Programm initiiert und koordiniert das Timing der DMD-Elektronik, die Verknüpfung der Laser und der Übernahme der Patch gespannt elektrisches Signal aus dem Ziel-Neuron. (Simulation dieser Reihenfolge auf dem Computer) Experimentelle Daten: Non-lineare Summation über distalen dendritischen Verzweigungen Dendritische Integration mit Elektroden wurde traditionell durch Variation der Amplitude der Stimulation an diskreten Stellen, anstatt den Ausbau im Bereich der Stimulation bei gleichzeitig konstanter Intensität durchgeführt. Fragen in Bezug auf Sättigung electrogenesis und Rekrutierung von ortsabhängigen Kanäle können das Ergebnis beeinflussen und zum Abschluss. Distributed dendritischen Stimulation kann leicht implementiert werden mit einem DMD-basiertes System (Abb. 4A). Eingang Intensität wurde durch die Erhöhung der Anzahl der Punkte von Photostimulation vielfältig. Wir können sehen, dass die räumliche Summation kann nicht linear Verzweigungspunkte zunehmend supra-linear mit zunehmender Eingangsamplituden Ankunft auf die beiden Tochterzellen Filialen. Die supra-Linearität ist weitgehend NMDA-Rezeptoren vermittelt und nicht auf gated-Kanäle (Abb. 5) Spannung Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Bedienung der Mikrospiegel in die DMD. (Seitenansicht) Elektrostatische Kräfte an einzelnen Spiegel gerichtet sind, verursachen den Spiegel in eine von zwei möglichen Orientierungen 12 ° von der Horizontalen gekippt werden. In der ON-Position einen einfallenden Strahl entlang der optischen Achse senkrecht des Chips geleitet. In der OFF-Position des einfallenden Strahls ist 48 ° off axis gerichtet. Licht, das die dünne Lücken zwischen den Spiegeln Hits 24 ° off axis gerichtet. (Ansicht von oben) die Neigung ist 45 ° in Bezug auf den Seiten des Spiegel und Chip. <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Grundaufbau des modernen Fluoreszenzmikroskop. Der Filter Würfel ist in der &quot;Unendlichen Raum&quot; zwischen dem Objektiv und der Tubuslinse positioniert. Es ist ein bildgebendes Weg, um die Kamera führt, und es gibt eine Beleuchtung Weg, der das Licht bringt, um die Probe. Die Tubuslinse für diese beiden Lichtweg sind in der Regel verschiedene in Design und in der Brennweite. Die Beleuchtung, nicht aber die Bildgebung ist Tubuslinse für den Betrieb im UV-Spektrum entwickelt. <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Layout für UV basiert DMD-System. Ist die Beleuchtung in der UV-Spektrum, dann muss es durch das Rohr Objektiv, das für UV korrigiert gebracht werden. Die Tubuslinse in der Imaging-Pfad ist nicht für UV konzipiert. Ein Relais ist erforderlich, um eine leicht zugängliche Konjugat Bildebene erzeugen. Die verschiedenen konjugierten Bildebenen in das Mikroskop ist durch gestrichelte rote Linien markiert. Helle Muster in einer Bildebene sind in anderen konjugierten Ebenen projiziert. Während die Abbildung des Musters in der Probe Flugzeug ist auf dem Detektor / Kamera projiziert. Für die Beleuchtung des Musters von der DMD erzeugt wird auf die Probe projiziert. <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Layout für sichtbares Licht DMD-Projektionssystem. Wenn die Beleuchtung Licht im sichtbaren Bereich, ist es möglich, die DMD erzeugten Lichtmuster durch die Bildgebung Lichtweg zu bringen. Dies kann leicht mit commerci umgesetzt werdenal Dual Kamera-Port-Anhänge und die entsprechende dichroitische Spiegel. <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. Laterale Auflösung des Systems. (A) Optische Auflösung auf fluoreszierende Ziel ist ~ 2 um. (B) Effektive Auflösung als durch Photolyse von caged Glutamat über eine Dendriten gemessen ~ 5 um. Die erhöhte Abstand wird durch eine Kombination von Diffusion von Glutamat und die endliche Breite des Dendriten. (C) Photolyse imitieren kann die Kinetik der synaptischen Ereignisse. Die Familie der Spannung geklemmt aktuelle Antworten ist aufgrund von Variationen in der Lichtenergie geliefert, die Dendriten. <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig6.jpg" alt="Abbildung 6" /> Abbildung 6. Nichtlineare Summation über dendritischen Verzweigungen. (A) Distributed-Eingänge sind mit zwei dendritischen Verzweigungen gesondert angewandt. Ihre jeweilige Spannung Reaktionen sind unten dargestellt. (B) Die Reize werden dann gleichzeitig gegeben. Die gemessene Reaktionszeit (rote Kurve) ist anders als die arithmetische Summe der beiden einzelnen Reaktionen (graue Kurve). <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig7.jpg" alt="Abbildung 7" /> Abbildung 7. Supralinear Summation NMDA-Rezeptor-abhängige. (A) APV, blockiert eine selektive NMDA-Rezeptor-Antagonist der supralinear Summation. (B) Die Reizintensität Beziehung und ihre Empfindlichkeit gegenüber NMDA-Rezeptor-Antagonist aufgetragen ist.

<ol>
	<li>Scanziani, M., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiology+in+the+age+of+light.">Electrophysiology in the age of light.</a> Nature. 461, 930-939 (2009).</li><li>Tang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolysis+of+caged+neurotransmitters:+Theory+and+procedures+for+light+delivery.">Photolysis of caged neurotransmitters: Theory and procedures for light delivery.</a> Curr. Prot. Neurosci. , 6.21.1-6.21.12 (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature+Technology+Feature,+Cell+imaging:+Light+activated.">Nature Technology Feature, Cell imaging: Light activated.</a> Nature. 456, 826-827 (2008).</li><li>Lutz, C., Otis, T. S., DeSars, V., Charpak, S., DeGregorio, D. A., Emiliani, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Holographic+photolysis+of+caged+neurotransmitters.">Holographic photolysis of caged neurotransmitters.</a> Nature Methods. 5, 821-827 (2008).</li><li>Hornbeck, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Digital Light Processing and MEMs: An overview. , .</li></ol>

Der Vorteil der DMD basiert Photostimulation Ansatz zeigt sich besonders deutlich in Situationen, wo das Ziel liegt in einem relativ großen Bereich. Wenn das Ziel von Interesse ist sehr klein, wie ein paar dendritische Dornen, sind sequentielle konfokalen und 2-Photonen-Systeme wahrscheinlich der bessere Ansatz sein. Eine wesentliche Schwäche des DMD-Ansatz ist die ineffiziente Nutzung der verfügbaren Licht. Der Großteil der verfügbaren Licht ist unbedingt auf die OFF Spiegel gerichtet und nicht verwendet. <p c...

Erratum: Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points

<table><tbody><tr><td>Modern upright fluorescent microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD camera and image acquisition software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Computer and data acquisition/interface system</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DLP Discovery Developer Kit </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ALP3 USB interface</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S2 + Optics w/LED</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dual camera port unit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>355nm frequency tripled NdVO4 laser (~1 W)</td><td>DPSS Laser Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser shutter Model LS6</td><td>Uniblitz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multimode optical fiber and fiber stretcher Model# 915</td><td>Canadian Instrument and Research, Ltd</td><td></td><td>100 um core multimode fiber</td></tr><tr><td>Multimode Fiber launcher </td><td>Oz Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Signal generator</td><td></td><td></td><td>up to 50 kHz</td></tr><tr><td>Beam collimator</td><td>Olympus Corporation</td><td>DApo20UV340</td><td></td></tr><tr><td>UV relay lens</td><td>Special Optics</td><td>#: 54-25-60-355</td><td></td></tr></tbody></table>

patterned photostimulation with digital micromirror devices to investigate dendritic integration across branch points

Licht ist eine vielseitige und präzise Mittel, um die neuronale Erregbarkeit zu steuern. Die kürzlich erfolgte Einführung von lichtempfindlichen Effektoren wie Kanal-Rhodopsin und eingesperrt Neurotransmitter haben Interesse an der Entwicklung besseres Mittel, um Muster von Licht in Raum und Zeit, die nützlich für experimentelle Neurowissenschaften geführt hat. Eine herkömmliche Strategie, in der konfokalen und 2-Photonen-Mikroskopie verwendet wird, ist, um Licht zu einem beugungsbegrenzten Spot-Fokus und scannen Sie dann, dass einzelne Fleck nacheinander über die Region von Interesse. Dieser Ansatz wird problematisch, wenn große Flächen in kurzer Zeitfenster, ein Problem mehr für Photostimulation als für die Bildgebung stimuliert werden müssen. Eine alternative Strategie besteht darin, die komplette räumliche Muster auf das Ziel mit Hilfe eines digitalen Mikrospiegel (DMD)-Projekt. Die DMD-Ansatz ist attraktiv, weil die Hardware-Komponenten relativ günstig sind und von kommerziellen Interessen unterstützt. Da ein solches System ist nicht für aufrechte Mikroskope zur Verfügung, werden wir die kritischen Fragen in den Bau und Betrieb eines solchen DMD-System. Obwohl wir in erster Linie beschreibt den Aufbau des Systems für die UV-Photolyse, werden die Änderungen für den Bau der viel einfachere sichtbares Licht für optogenetische Experimente vorgesehen sein. Die UV-Photolyse-System verwendet wurde, um Experimente carryout um eine grundsätzliche Frage in den Neurowissenschaften studieren, sind, wie räumlich-Eingänge über distalen dendritischen Verzweigungen integriert verteilt. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Integration kann nicht linear Verzweigungspunkte und der supralinearity wird weitgehend durch NMDA-Rezeptoren vermittelt.

Watch this Scientific Journal Video about Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points at JoVE.com

Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points

Digitale Mikrospiegel-Geräte (DMD) generieren können komplexe Muster in Raum und Zeit, mit der neuronalen Erregbarkeit zu steuern. Fragen, die für die Planung, den Bau und Betrieb von DMD Systeme diskutiert. Ein solches System ermöglicht den Nachweis von nicht-linearen Integration in distalen dendritischen Verzweigungen.

Gemusterte Photostimulation mit Digital Micromirror Devices auf Dendritische Integration über Verzweigungspunkte Untersuchen

Light is a versatile and precise means to control neuronal excitability. The recent introduction of light sensitive effectors such as channel-rhodopsin ...

patterned-photostimulation-with-digital-micromirror-devices-to

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.6K Aufrufe.  University of Maryland School of Medicine. Digitale Mikrospiegel-Geräte (DMD) generieren können komplexe Muster in Raum und Zeit, mit der neuronalen Erregbarkeit zu steuern. Fragen, die für die Planung, den Bau und Betrieb von DMD Systeme diskutiert. Ein solches System ermöglicht den Nachweis von nicht-linearen Integration in distalen dendritischen Verzweigungen.

Serie: Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points

Mapping Inhibitory Neuronal Circuits by Laser Scanning Photostimulation

Inhibitory neurons are crucial to cortical function. They comprise about 20% of the entire cortical neuronal population and can be further subdivided into diverse subtypes based on their immunochemical, morphological, and physiological properties1-4. Although previous research has revealed much about intrinsic properties of individual types of inhibitory neurons, knowledge about their local circuit connections is still relatively limited3,5,6. Given that each individual neuron's function is shaped by its excitatory and inhibitory synaptic input within cortical circuits, we have been using laser scanning photostimulation (LSPS) to map local circuit connections to specific inhibitory cell types. Compared to conventional electrical stimulation or glutamate puff stimulation, LSPS has unique advantages allowing for extensive mapping and quantitative analysis of local functional inputs to individually recorded neurons3,7-9. Laser photostimulation via glutamate uncaging selectively activates neurons perisomatically, without activating axons of passage or distal dendrites, which ensures a sub-laminar mapping resolution. The sensitivity and efficiency of LSPS for mapping inputs from many stimulation sites over a large region are well suited for cortical circuit analysis.
Here we introduce the technique of LSPS combined with whole-cell patch clamping for local inhibitory circuit mapping. Targeted recordings of specific inhibitory cell types are facilitated by use of transgenic mice expressing green fluorescent proteins (GFP) in limited inhibitory neuron populations in the cortex3,10, which enables consistent sampling of the targeted cell types and unambiguous identification of the cell types recorded. As for LSPS mapping, we outline the system instrumentation, describe the experimental procedure and data acquisition, and present examples of circuit mapping in mouse primary somatosensory cortex. As illustrated in our experiments, caged glutamate is activated in a spatially restricted region of the brain slice by UV laser photolysis; simultaneous voltage-clamp recordings allow detection of photostimulation-evoked synaptic responses. Maps of either excitatory or inhibitory synaptic input to the targeted neuron are generated by scanning the laser beam to stimulate hundreds of potential presynaptic sites. Thus, LSPS enables the construction of detailed maps of synaptic inputs impinging onto specific types of inhibitory neurons through repeated experiments. Taken together, the photostimulation-based technique offers neuroscientists a powerful tool for determining the functional organization of local cortical circuits.

This paper introduces an approach of combining laser scanning photostimulation with whole cell recordings in transgenic mice expressing GFP in limited inhibitory neuron populations. The technique allows for extensive mapping and quantitative analysis of local synaptic circuits of specific inhibitory cortical neurons.

Mapping hemmende neuronale Schaltungen durch Laser Scanning Photostimulation

Inhibitory neurons are crucial to cortical function. They comprise about 20% of the entire cortical neuronal population and can be further subdivided into ...

Forschung

Neurowissenschaften

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

The patch-clamp technique is today the most well-established method for recording electrical activity from individual neurons or their subcellular compartments. Nevertheless, achieving stable recordings, even from individual cells, remains a time-consuming procedure of considerable complexity. Automation of many steps in conjunction with efficient information display can greatly assist experimentalists in performing a larger number of recordings with greater reliability and in less time. In order to achieve large-scale recordings we concluded the most efficient approach is not to fully automatize the process but to simplify the experimental steps and reduce the chances of human error while efficiently incorporating the experimenter's experience and visual feedback. With these goals in mind we developed a computer-assisted system which centralizes all the controls necessary for a multi-electrode patch-clamp experiment in a single interface, a commercially available wireless gamepad, while displaying experiment related information and guidance cues on the computer screen. Here we describe the different components of the system which allowed us to reduce the time required for achieving the recording configuration and substantially increase the chances of successfully recording large numbers of neurons simultaneously.

Multi-electrode patch-clamp recordings constitute a complex task. Here we show how, by automating of many of the experimental steps, it is possible to accelerate the process leading to qualitative improvement in performance and number of recordings.

Eine EDV-gestützte Multi-Elektroden-Patch-Clamp-System

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the interactions of these forebrain circuits has been aided recently by the development of optogenetic methods for light-mediated modulation of neuronal activity. Here, we describe a protocol for examining the functional organization of forebrain circuits&#160;in vitro using laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin, expressed optogenetically via viral-mediated transfection. This approach also exploits the utility of cre-lox recombination in transgenic mice to target expression in specific neuronal cell types. Following transfection, neurons are physiologically recorded in slice preparations using whole-cell patch clamp to measure their evoked responses to laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin expressing fibers. This approach enables an assessment of functional topography and synaptic properties. Morphological correlates can be obtained by imaging the neuroanatomical expression of channelrhodopsin expressing fibers using confocal microscopy of the live slice or post-fixed tissue. These methods enable functional investigations of forebrain circuits that expand upon more conventional approaches.

We describe a method for characterizing the functional topography and synaptic properties of forebrain circuits using an optogenetic approach to photostimulate neuronal populations&#160;in vitro.

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

Kombinierte Methodiken Verwendung der Rolle der Plasmamembran Lieferung Während Axon Branching und Neuronale Morphogenese zu definieren

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and columns to facilitate brain wiring during development and information processing in developed animals. Postsynaptic neurons elaborate dendrites in type-specific patterns in specific layers to synapse with appropriate presynaptic terminals. The fly medulla neuropil is composed of 10 layers and about 750 columns; each column is innervated by dendrites of over 38 types of medulla neurons, which match with the axonal terminals of some 7 types of afferents in a type-specific fashion. This report details the procedures to image and analyze dendrites of medulla neurons. The workflow includes three sections: (i) the dual-view imaging section combines two confocal image stacks collected at orthogonal orientations into a high-resolution 3D image of dendrites; (ii) the dendrite tracing and registration section traces dendritic arbors in 3D and registers dendritic traces to the reference column array; (iii) the dendritic analysis section analyzes dendritic patterns with respect to columns and layers, including layer-specific termination and planar projection direction of dendritic arbors, and derives estimates of dendritic branching and termination frequencies. The protocols utilize custom plugins built on the open-source MIPAV (Medical Imaging Processing, Analysis, and Visualization) platform and custom toolboxes in the matrix laboratory language. Together, these protocols provide a complete workflow to analyze the dendritic routing of Drosophila medulla neurons in layers and columns, to identify cell types, and to determine defects in mutants.

Here, we show how to analyze dendritic routing of Drosophila medulla neurons in columns and layers. The workflow includes a dual-view imaging technique to improve the image quality and computational tools for tracing, registering dendritic arbors to the reference column array and for analyzing the dendritic structures in 3D space.

Analyse dendritischer Morphologie in Spalten und Schichten

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Zwei-Photonen-Kalzium Imaging in neuronalen Dendriten in Hirnschnitten

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding environment and initiate contacts with potential synaptic partners. Although the connection between dendritic branch dynamics and synaptogenesis is well established, how developmental and activity-dependent processes regulate dendritic branch dynamics is not well understood. This is partly due to the technical difficulties associated with the live imaging and quantitative analyses of these fine structures using an in vivo system. We established a method to study dendrite dynamics using Drosophila larval ventral lateral neurons (LNvs), which can be individually labeled using genetic approaches and are accessible for live imaging. Taking advantage of this system, we developed protocols to capture branch dynamics of the whole dendritic arbor of a single labeled LNv through time-lapse live imaging. We then performed post-processing to improve image quality through drift correction and deconvolution, followed by analyzing branch dynamics at the single-branch level by annotating spatial positions of all branch terminals. Lastly, we developed R scripts (Supplementary File) and specific parameters to quantify branch dynamics using the coordinate information generated by the terminal tracing. Collectively, this protocol allows us to achieve a detailed quantitative description of branch dynamics of the neuronal dendritic arbor with high temporal and spatial resolution. The methods we developed are generally applicable to sparsely labeled neurons in both in vitro and in vivo conditions.

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Here, we describe the method we employed to image highly motile dendritic filopodia in a live preparation of the Drosophila larval brain, and the protocol we developed to quantify time-lapse 3D imaging datasets for quantitative assessments of dendrite dynamics in developing neurons.

Zeitraffer Live Imaging und Quantifizierung der schnellen dendritischen Zweigdynamik bei der Entwicklung von Drosophila Neuronen

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

Automatic Identification of Dendritic Branches and their Orientation

The structure of neuronal dendritic trees plays a key role in the integration of synaptic inputs in neurons. Therefore, characterization of the morphology of dendrites is essential for a better understanding of neuronal function. However, the complexity of dendritic trees, both when isolated and especially when located within neuronal networks, has not been completely understood. We developed a new computational tool, SOA (Segmentation and Orientation Analysis), which allows automatic measurement of the orientation of dendritic branches from fluorescence images of 2D neuronal cultures. SOA, written in Python, uses segmentation to distinguish dendritic branches from the image background and accumulates a database on the spatial direction of each branch. The database is then used to calculate morphological parameters such as the directional distribution of dendritic branches in a network and the prevalence of parallel dendritic branch growth. The data obtained can be used to detect structural changes in dendrites in response to neuronal activity and to biological and pharmacological stimuli.

Presented is a computational tool that allows simple and direct automatic measurement of orientations of neuronal dendritic branches from 2D fluorescence images.

Automatische Identifizierung von dendritischen Ästen und deren Orientierung

The structure of neuronal dendritic trees plays a key role in the integration of synaptic inputs in neurons. Therefore, characterization of the morphology ...

A Cardiac Microphysiological System for Studying Ca2+ Propagation via Non-genetic Optical Stimulation

In vitro cardiac microphysiological models are highly reliable for scientific research, drug development, and medical applications. Although widely accepted by the scientific community, these systems are still limited in longevity due to the absence of non-invasive stimulation techniques. Phototransducers provide an efficient stimulation method, offering a wireless approach with high temporal and spatial resolution while minimizing invasiveness in stimulation processes. In this manuscript, we present a fully optical method for stimulating and detecting the activity of an in vitro cardiac microphysiological model. Specifically, we fabricated engineered laminar anisotropic tissues by seeding human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) generated in a 3D bioreactor suspension culture. We employed a phototransducer, an amphiphilic azobenzene derivative, named Ziapin2, for stimulation and a Ca2+ dye (X-Rhod 1) for monitoring the system&#39;s response. The results demonstrate that Ziapin2 can photomodulate Ca2+ responses in the employed system without compromising tissue integrity, viability, or behavior. Furthermore, we showed that the light-based stimulation approach offers a similar resolution compared to electrical stimulation, the current gold standard. Overall, this protocol opens promising perspectives for the application of Ziapin2 and material-based photostimulation in cardiac research.

Using light to control cardiac cells and tissue enables non-contact stimulation, thereby preserving the natural state and function of the cells, making it a valuable approach for both basic research and therapeutic applications.

Ein kardiales mikrophysiologisches System zur Untersuchung der Ca2+ -Ausbreitung durch nicht-genetische optische Stimulation

In vitro cardiac microphysiological models are highly reliable for scientific research, drug development, and medical applications. Although widely ...

Biotechnik

Evaluation and Manipulation of Neural Activity Using Two-Photon Holographic Microscopy

Recent advances in optical bioimaging and optogenetics have enabled the visualization and manipulation of biological phenomena, including cellular activities, in living animals. In the field of neuroscience, detailed neural activity related to brain functions, such as learning and memory, has now been revealed, and it has become feasible to artificially manipulate this activity to express brain functions. However, the conventional evaluation of neural activity by two-photon Ca2+ imaging has the problem of low temporal resolution. In addition, manipulation of neural activity by conventional optogenetics through the optic fiber can only simultaneously regulate the activity of neurons with the same genetic background, making it difficult to control the activity of individual neurons. To solve this issue, we recently developed a microscope with a high spatiotemporal resolution for biological applications by combining optogenetics with digital holographic technology that can modify femtosecond infrared laser beams. Here, we describe protocols for the visualization, evaluation, and manipulation of neural activity, including the preparation of samples and operation of a two-photon holographic microscope (Figure 1). These protocols provide accurate spatiotemporal information on neural activity, which may be useful for elucidating the pathogenesis of neuropsychiatric disorders that lead to abnormalities in neural activity.

We developed a two-photon holographic microscope that can visualize, assess, and manipulate neural activity using high spatiotemporal resolution, with the aim of elucidating the pathogenesis of neuropsychiatric disorders that are associated with abnormal neural activity.

Gemusterte Photostimulation mit Digital Micromirror Devices auf Dendritische Integration über Verzweigungspunkte Untersuchen

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video