体内研究成年果蝇味觉诱导神经反应的钙成像

我们的实验室使用果蝇作为模式生物来研究味觉信息如何通过神经回路处理，从化学物质的检测到对行为的影响。我们正在使用这种成像方案来识别对氨基酸有反应的味觉细胞，并确定不同的内部状态是否调节味觉细胞对这些必需营养素的反应。这种钙成像方法的一个优点是，它允许从内部状态保持完整的清醒动物的特定细胞中记录味觉诱导的神经反应。

我们现在可以在新的果蝇全脑连接组中识别假定的味觉回路，并使用这种钙成像方法验证体内功能性神经元动力学。首先，将麻醉的苍蝇置于解剖显微镜下。使用解剖剪刀，去除股骨胫关节处的中腿和后腿以及转子处的四条腿。

使用钝镊子通过翅膀捡起苍蝇，将其头部定位在成像室的目标子宫颈槽上方，同时保持身体下方。使用剪刀和钝镊子的钝面，轻轻地将头部和胸部同时推入槽中。门襟牢固地放入插槽内后，将其推到后面并轻轻重新定位，使其面向腔室的前部。

在牙签的末端收集一小滴指甲油，然后涂上一层薄薄的涂层，将果蝇的头部固定在成像室中。用一只手拿起打蜡机，在尖端沾上一小滴蜡。另一方面，使用半锋利的镊子抓住一个上颌触诊，轻轻拉出并保持喙完全伸展。

将打蜡机的尖端接触喙底部附近的腔室，直到蜡开始流动。移动以接触喙的底部，并在轴的一半处打蜡，避免接触贴标签感器。然后尽可能伸直喙。

现在将已安装的苍蝇放入湿度室中 60 分钟以恢复。从湿度室中取出苍蝇。使用非常锋利的镊子，捏掉两个触角，捏住角质层打一个孔，然后插入锋利镊子的一侧。

在角质层下方运行镊子，将其从覆盖感兴趣大脑区域的区域中取出。要清洗暴露的大脑，请在头部加入大约 100 微升的人工血淋巴溶液或 AHL。清洗后，去除 AHL，留下一层薄薄的一层，以防止大脑干燥。

使用锋利的镊子取出气袋和覆盖大脑的任何大碎屑。为了对食管下区 （SEZ） 进行特异性成像，请使用非常锋利的镊子在靠近喙的底部和穿过大脑的地方切开食管。删除此部分以暴露 SEZ。

在解剖显微镜下，将 10 x 20 毫米的盖玻片放入成像室的斜槽中。将大约 2 μL 水或其他阴性对照加载到毛细管中。找到被解剖的苍蝇，并使用 10 倍空气浸没明场物镜聚焦在标签上。

将毛细管与 10x 视图下的标签对齐。将毛细管位置直接放在贴标机的前面，确保它靠近但不接触。移动载物台以使感兴趣的大脑区域居中。

切换到更高放大倍率的水浸物镜，例如 40 倍物镜。在大脑顶部添加大约 200 微升 AHL，以确保与浸没物镜接触。切换到 488 纳米激光功率以定位感兴趣区域中的 GCaMP 表达。

收集至少 5 秒的基线荧光后，手动移动刺激器，使毛细管覆盖标签 5 秒。移除刺激物并根据需要继续捕获。接下来，移除 AHL 并返回 10 倍明场，以确认盖玻片、刺激器和标签保持在正确的位置。

然后取下成像室，并使用无绒布从毛细管中取出第一种溶液。用水冲洗移液器，然后将大约 2 微升的下一个 tastant 移液到毛细管中。与水相比，蔗糖刺激 Gr64f GCaMP 果蝇的相对荧光变化显着升高，表明甜味受体神经元具有强烈而持续的反应。

蔗糖刺激的相对峰值荧光显著大于水。Gr66a GCaMP 果蝇对咖啡因刺激的荧光变化显著高于水，显示出对咖啡因发作和去除的反应。Gr66a 果蝇轴突末端的投影模式与 Gr64f 不同，表明苦味和糖感应味觉受体神经元的解剖分离。