果 蝇 头部的直接冷冻切片，用于增强脑荧光染色和免疫染色

我们的团队使用果蝇模型研究代谢、心脏、肌肉睡眠和衰老障碍。这篇 Jove 论文详细介绍了脑组织处理的简化方案，包括斩首、固定、冷冻切片、染色和成像。我的研究小组率先开发了果蝇模型，以研究多种人类疾病和衰老。

我们还研究了限时进食和锻炼等干预措施。我们使用机器学习、组学和分子方法来研究昼夜节律和遗传学等因素，以揭示它们对细胞完整性、生理学和行为的影响。这种简化的果蝇大脑研究方案避免了复杂的解剖，只需要单手执行，并且无需昂贵的共聚焦显微镜，提高了可及性并减少了对设备的依赖。

首先，在老化小瓶中取出果蝇，然后打开二氧化碳垫上的阀门，并迅速将果蝇倒在垫子上以防止逃逸。一旦果蝇大部分失去知觉，通过移动物镜下方的垫子，将果蝇置于 SZ61 显微镜下方。调整放大倍率和焦距，直到苍蝇清晰可见并且易于斩首。

使用弹簧剪刀，将刀片放置在苍蝇的胸部和头部之间，并用力挤压以每个实验组斩首 5 到 10 个苍蝇头。将任何和用过的苍蝇放回老化的小瓶中。使用刷子，将斩首的苍蝇头轻轻转移到贴有标签的 1.5 毫升试管中，置于冰上。

从冰中取出试管后，将 100 微升 4% 多聚甲醛和 PBS 移液到每个试管中，确保所有飞蝇头都完全浸没。如果头部粘附在管壁上，请用刷子轻轻将其向下推，或将管子轻轻敲击水平表面，以确保与溶液正确接触。然后将试管在轨道摇床上以中等设置孵育 15 分钟。

丢弃多聚甲醛溶液并用 PBS 代替，确保所有飞头都浸没在水中。最后一次洗涤后，将果蝇头转移到 PBS 中的 10% 蔗糖溶液中，确保它们浸没在管内。用最佳切割温度或 OCT 化合物将贴标签的模具填充至约 50% 的容量，使其扩散到模具的所有四个角。

使用刷子，小心地将收集的固定飞头放在模具内的 OCT 化合物表面。使用镊子的尖端，轻轻地将每个头部推到模具底部，确保眼睛向下，以便切开冠状平面。小心对齐 X、Y 和 Z 维度上的所有头部，以确保所有切片同时包含所有实验组。

正确对齐头部后，小心地将模具直接放入零下 20 摄氏度的冰箱中冷冻。一旦模具大部分冻结，用 OCT 化合物填充剩余空间。对于模具冷冻切片，在模具顶部涂抹大量 OCT 化合物，以将卡盘钻头连接到模具上。

将钻头平放在顶部，让它在低温恒温器内完全冻结，这通常需要五分钟。然后从模具中释放钻头和 OCT 块。将块放入卡盘中，确保保持正确的上下方向，并拧紧卡盘键，直到块牢固就位。

使用调节旋钮和卡盘深度控件，将块与刀片对齐。将低温恒温器上的截面宽度设置为 20 微米，并使用缓慢一致的运动切割每个切片，同时让防滚玻璃捕获每个切片。然后，通过将载玻片触摸到切片的更近边缘并让切片上升到载玻片上，使用温玻片捕获切片。

让玻片在室温下干燥至少 30 分钟，但不要超过 1 小时。取冷冻切片的果蝇头，用剃须刀片去除载玻片边缘的任何残留 OCT 化合物，为疏水边界留出空间。然后使用疏水记号笔在每张载玻片周围画一个边框，并让它干燥 5 分钟。

在载玻片上轻轻移液，使用 PBS 洗涤所有玻片 3 次，每次 5 分钟。清洗玻片后，将 Tris 缓冲盐水封闭液中的 3% BSA 移液移液到玻片上，孵育 30 分钟至 1 小时。然后丢弃封闭溶液，将一抗溶液移液到载玻片上。

将抗体在 4 摄氏度下孵育过夜，或在室温下使用湿组织湿巾孵育 1 小时，以防止干燥。弃去一抗溶液，使用 PBS 洗涤玻片 3 次，每次 5 分钟。然后将二抗溶液添加到玻片中，并在室温下孵育 1 小时。

用 PBS 洗涤载玻片 3 次后，在载玻片上只留下少量 PBS。接下来，使用 1000 微升移液器，在载玻片上均匀添加 3 到 5 滴含有 DAPI 的硬化封固剂。将盖玻片放在载玻片上，确保在放置过程中不会形成气泡。

小心处理新安装的玻片并将它们平放存放，直到安装介质完全干燥。如果需要长期存放，请密封载玻片的边缘。尽快捕获载玻片的图像，以尽量减少荧光衰减。

在图像采集过程中，专注于同一通道中的每个独特主题，以实现所有实验组的一致性。校准每个通道的曝光，以避免所有选定通道中的曝光过度。确保所选曝光保持不变并且适合所有受试者，尤其是在不同的实验组之间。

ApoE 抗体标签的表达明显定位于 Elav + 和 Elav-ApoE4 标本的脑区域。尼罗红染色表明脂质积累，这在两种基因型的大脑区域都可见。