通过活体显微镜观察肠系膜缺血再灌注损伤后肠系膜小静脉中中性粒细胞细胞外陷阱的可视化

特定基因在血栓形成发生和发展中的作用，在这种情况下，我们研究了内皮 PAR1 表达对缺血再灌注损伤的影响。我们试图确定内皮对缺血后和再灌注期间反应的影响。迄今为止研究不足的一个非常重要的方面是确定肠道共生在肠系膜缺血再灌注损伤中的作用。

为了研究这个问题，我们小组将活体显微镜检查与肠系膜缺血再灌注损伤模型相结合，并将其与无菌小鼠模型相结合。将血栓形成模型应用于转基因小鼠并结合活体显微镜，此类技术能够对疾病发作期间的细胞行为进行体内观察。在生物体上进行实验模型始终是一项挑战，因为实验受许多因素的影响，包括性别、年龄、麻醉治疗、动物福利法规的变化等。

此外，血栓形成的研究始于上个世纪。许多促成因素仍未解决。我的小组研究肠道微生物群对血栓形成、动脉粥样硬化、血小板功能和血管形成的作用。

首先，将麻醉的剃光小鼠放在加热垫上的背卧式中。通过鼻锥将鼠标连接到氧气系统。用手术胶带将鼠标的肢体固定在加热垫上。

为了将导管植入颈静脉，请在气管上做一个横向切口。去除覆盖颈部的皮肤并隔离右颈静脉。然后，使用 5 厘米长的丝线闭合静脉的远端并用手术钳固定。

将三根丝线放在静脉下方约 2 厘米处，一根靠近远端，两条靠近颈静脉近端。打一个手术结，但不要关闭血管。用 0.9% 氯化钠填充聚乙烯导管。

去除气泡并将其塞入 1 毫升注射器中。用剪刀在第二个和第三个结之间切一个孔，然后将导管植入颈静脉。吸出注射器以确保导管中存在血液。

系好丝线以将导管固定在静脉中。然后，使用医用胶带固定注射器。用 0.5 毫克/毫升终浓度的吖啶橙和 5 微摩尔浓度的核酸染料填充 1 毫升注射器。

注射 50 μL SYTOX Orange，用于中性粒细胞胞外陷阱或 NET。用交替轮换的碘基磨砂膏和酒精对小鼠的腹部皮肤进行消毒。然后，使用手术刀沿线性白线进行 3 到 5 厘米的剖腹手术。

使用两个蘸有盐水的棉签轻轻地将肠道从腹腔中定位，并确定脂肪覆盖率最低的位置。将肠的小分支放在黑色面团上以减少背景信号。通过颈静脉导管注射 50 微升吖啶橙，以观察染色的白细胞。

获取缺血再灌注前的肠道视频。准备一个用氯化钠润湿的敷料，然后将肠道放入其中。用小血管夹闭塞肠系膜上动脉。

使用蘸有盐水的棉签轻轻地将肠道推回腹腔。使用 7-0 缝合线闭合腹壁，防止水分和温度流失。一小时后，取下缝合线。

缺血期结束后，将几滴生理盐水滴在夹住的区域。然后，使用夹子涂抹器轻轻取下微血管夹。使用蘸有盐水的棉签，轻轻地将肠道再次从腹腔中移出，并将静脉的小分支放在黑色面团上。

注射 50 微升吖啶橙并捕获静脉的缺血后视频。打开配备长距离聚光镜、单色器、10 倍水浸物镜和电荷耦合器件相机的高速、宽视场荧光显微镜。将曝光时间设置为 30 毫秒，并选择安装了 Alexa Fluor 488 和罗丹明红滤光片的 5B 通道，以可视化白细胞和 NET。

定量 0.06 平方毫米感兴趣区域内的细胞募集。然后，通过在 20 秒的观察期内对保持静止或附着在内皮内层的细胞进行计数来定量贴壁白细胞。鉴定用白细胞和核酸荧光染料标记的 NET。

缺血再灌注损伤后，野生型和 F2r δ EC 组的白细胞与缺血性肠系膜内皮的粘附增加，在 F2r δ EC 组中观察到的粘附明显较低，表明内皮 PAR1 在白细胞募集中的作用。缺血再灌注损伤后，仅在内皮细胞上表达正常水平 PAR1 的野生型组中观察到 NETs，表明 PAR1 在 NETosis中具有调节作用。