使用敏化发射 Förster 共振能量转移 （SE-FRET） 监测含有 8 通道亮氨酸的富含亮氨酸重复序列 （LRRC8/VRAC） 活性

我们的研究重点是膜转运的特性和功能，特别是离子转运蛋白和通道，例如 LRRC8 形成的阴离子和渗透液通道。我们研究了它们的生物物理机制、调节过程和细胞生理功能。最后，我们还旨在阐明它们的功能障碍如何导致人类疾病。

许多实验室推进了我们对 LRRC 通道的理解，解析 LRRC8 复合物的结构，阐明电生理特性，并揭示了不同的生理作用。然而，一个关键问题仍然存在:这些通道如何进行生化和生理调节，亚基组成如何影响它们在细胞内的激活和作用？这种方法允许在电生理学通常无法接近的隔室（例如细胞内隔室）中观察 LRRC8 通道活动，而不会像全细胞膜片钳那样干扰胞质组成。

其亚细胞分辨率能够监测单个细胞内差异激活的 LRRC8 通道，并允许在生理过程中进行连续监测。使用这种基于 FRET 的传感器，我们将研究不同生理条件下 LRRC8 VRAC 通道的调节和功能。关键问题是:亚基如何重新排列它们的确认;不同的刺激涉及哪些信号转导过程，以及 LRRC8 的不同旁系同源物之间是否存在差异;以及生理过程中是否存在亚细胞差异。

首先，准备等渗、低渗和高渗缓冲液。使用渗透压计测量缓冲液的渗透压。转染前一天，在 35 毫米培养皿中，以 1 乘以 10 的 5 个 HeLa 细胞的幂量接种在 2 毫升细胞培养基中。

在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下培养细胞过夜。第二天，以螺旋方式逐滴加入转染溶液到培养皿中。在工作台表面上水平和垂直移动培养皿五次以混合溶液。

在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下培养细胞过夜。第二天，在荧光显微镜下检查转染情况。取同时表达供体和受体构建体的细胞，吸出细胞培养基。

用 2 毫升等渗缓冲液洗涤细胞 3 次。吸出等渗缓冲液后，向细胞中加入 3 毫升等渗缓冲液，并将样品皿放在显微镜载物台上。加载显微镜 FRET 设置或为 FRET 实验设置必要的通道:供体激发-供体发射，DD;供体-受体，DA;和受体-受体，AA。找到一个至少有一个细胞同时表达供体和受体构建体的视野，并在必要时调整通道设置。

从显微镜载物台上取下板，然后将其放回培养箱中，直到实验开始。取仅表达供体构建体的细胞并吸出培养基。用 2 毫升等渗缓冲液洗涤细胞 3 次。

最后一次洗涤后，向细胞中加入 3 毫升等渗缓冲液，并将样品皿放在显微镜载物台上。找到至少有一个细胞表达供体构建体的视野。对所有供体-供体、受体-受体和供体-受体通道进行成像。

在细胞周围绘制感兴趣区域或 ROI，并测量供体-受体和供体-供体通道的平均强度。对于背景扣除，在仅找到背景信号的供体-受体和供体-供体通道中绘制 ROI 并测量平均强度。对细胞成像后，在细胞周围绘制 ROI 并测量供体 - 受体和受体 - 受体通道的平均强度。

对于背景扣除，在仅找到背景信号的供体 - 受体和受体 - 受体通道中绘制 ROI 并测量平均强度。最后，使用为背景校正的 IDA、背景校正的 IDD 和背景校正的 IAA 确定的值计算校正因子 beta 和 gamma。首先，从先前制备的表达供体和受体的 HeLa 细胞中吸出缓冲液。

用 3 毫升等渗缓冲液洗涤细胞，并将样品皿放在显微镜载物台上。对于等渗缓冲液的抽吸，固定并调整软管套管，使其尖端到达培养皿底部。要添加缓冲液，请固定并调整管路，以允许重力驱动的缓冲液流落入培养皿中。

找到至少一个细胞同时表达供体和受体构建体的视野并获取图像。对于 FRET 信号的背景扣除，在仅找到背景信号的供体 - 受体通道中绘制 ROI 并测量平均强度。对于 SE-FRET 定量，在细胞周围绘制 ROI 并测量时间序列中所有图像的供体-供体、供体-受体和受体-受体通道的平均强度。

为通道 donor-donor、donor-acceptor 和 acceptor-acceptor 设置一个延时实验，间隔为 10 秒，持续时间为涵盖刺激序列的所有条件。开始采集延时成像并绘制 SE-FRET 轨迹。基线测量后，用重力流替换缓冲液。

在现场实验中，通过软管套管吸出等渗缓冲液，用注射器施加真空。通过重力流加入 3 毫升下一个条件的缓冲液，同时继续延时成像。要测量另一种情况，如前所述在下一个缓冲液中洗涤样品，同时继续延时成像。

使用基于 FRET 的方法，在渗透刺激期间监测体积调节的 LRRC8 阴离子通道的活性，并且 SE-FRET 减少与细胞外低渗性相关。在其他实验中，还检测到等渗刺激（如甘油二酯信号传导或肌细胞激活）对 LRRC8 VRAC 的激活。在表达 LRRC8A mCerulean3 和 LRRC8E mVenus 的 HeLa 细胞凋亡诱导后监测 LRRC8 VRAC 活性。

肿瘤坏死因子 α 和放线菌酮引起 SE-FRET 的强烈降低，在高渗培养基中恢复。DMSO 治疗未降低 SE-FRET，证实了 LRRC8 VRAC 的特异性。