从快速冷冻肝组织中分离细胞核用于单细胞多组学

这种简单且可重复的方案已成功用于从健康和患病小鼠模型肝脏以及人和非人类灵长类动物的肝脏中分离高质量细胞核。该方法只需要少量的冷冻组织材料。此外，密度级激励提供了非常干净的核悬浮液，肝脏中的所有主要细胞类型都保存在最终的核制备中。

这种细胞核提取方法可用于存储在生物库中的生物存档人肝样本。通过使用预冷手术刀从放置在干冰上的培养皿中的肝组织中切下 2230 毫克或 5 毫米立方体片来开始组织均质化。立即将培养皿转移到湿冰中，并加入一毫升均质缓冲液。

使用冷手术刀，尽可能切碎组织，使其用一毫升宽的孔口吸出。收集组织悬浮液并将其转移到预冷的两毫升玻璃反弹均质器中。用额外的0.521毫升均质缓冲液清洗培养皿，并收集所有剩余的组织碎片，同时将所有东西放在冰上。

用松散的研杵A在冰上缓慢而小心地进行五笔，不要产生气泡。确保杵在每次冲程时小心地从均质器的顶部移动到底部。随后用紧密的杵B在冰上进行10至15次缓慢的划动，而不会产生气泡。

完成后，通过 50 微米的细胞过滤器过滤匀浆，同时将其转移到预冷的 1.5 毫升管中。对含有大量结缔组织团块的匀浆使用多个过滤器或管。在密度梯度离心之前，用额外的0.521毫升匀浆缓冲液冲洗均质器和过滤器，以彻底收集所有组织匀浆。

对于密度梯度离心，将过滤后的匀浆在预冷的固定角度离心机中以 1000 G 在 4 摄氏度下离心 8 分钟。在样品离心时，准备一个含有250微升50%碘沙醇稀释液的1.5毫升管和一个含有500微升29%碘沙醇稀释液的2毫升管。将两个试管放在冰上。

然后从离心机悬浮液中，使用真空泵在不干扰沉淀的情况下吸出上清液。使用一毫升宽的孔移液器尖端将沉淀重新悬浮在 250 微升匀浆缓冲液中。然后将250微升的细胞核悬浮液转移到含有250微升50%碘沙醇的预冷的1.5毫升管中，并轻轻彻底地混合以产生25%碘沙醇核悬浮液。

接下来，将500微升25%碘沙醇核悬浮液转移到含有500微升29%碘沙醇稀释液的预冷管毫升管中。将试管在预冷的摆动桶离心机中以 12， 500 G 离心 20 分钟，休息设置为关闭。在离心步骤完成之前，将RNA抑制剂添加到细胞核储存缓冲液或NSB中，同时进行单核RNA测序管道。

离心完成后，使用真空泵在不干扰沉淀的情况下吸出上清液。使用一毫升宽的孔移液器尖端轻轻地将沉淀重新悬浮在 100 至 300 微升 NSB 中，并将细胞核悬浮液转移到干净的预冷 1.5 毫升管中。使用台盼蓝溶液和手动血细胞计数器计数细胞核，并立即使用获得的细胞核悬浮液进行单核基因组学测定。

对于基于流式细胞术的细胞分选，通过 50 微米过滤器将细胞核悬浮液过滤到预冷的 5 毫升荧光活化细胞分选或传真管中。使用装有 100 微米喷嘴的流式细胞术分选仪，在预览样品之前将传真管装载到分选机上。设置细胞核分选的门控策略，从散射门开始，绘制前向散射区域与侧散射区域，然后是恶作剧高度与恶作剧区域，然后是恶作剧宽度与恶作剧区域。

在恶作剧区域直方图上可视化细胞核倍性剖面。要分选到 96 或 384 孔板中，请使用比色法设置液滴延迟并优化板对齐。将样品冷却和板架设置为4摄氏度，样品旋转以300 RPM打开。

以每秒 200 至 500 个事件的流速对样品浓度约为每毫升 10 至第五个细胞核的样品浓度对单个细胞核进行分类。对从冷冻肝脏中提取的细胞核的显微镜检查表明，密度梯度离心步骤极大地促进了不需要的细胞和组织碎片的去除。该方法保留了所有水平的倍性，并通过细胞术分析进行了验证和定量。

从使用细胞核提取获得的数据中观察到高质量的指标。均匀流形近似和投影代表了所有细胞核和主要细胞类型的计数数，只能通过核转录组和相对较浅的测序来自信地识别。这种方法允许研究肝脏特异性转录因子和参与异生素代谢的下游靶基因。

诸如中心CYP2E1和门周CYP2F2等标志性基因的互补模式表明，提取的细胞核保留了有关肝脏捐赠的关键信息。RNA的基因表达文库测序到每个细胞核44， 600个读数的深度，ATAC文库的测序深度为每个细胞核43， 500个读数。使用修拉和Signac软件包对两种模式（RNA加ATAC）进行多次测量的加权最近邻分析可以识别和注释主要和次要肝细胞类型，而不会因细胞大小或核脆性而产生明显的偏差。

该方法还检测了肝脏捐献的上游转录调节因子和标志性基因。重要的是，在上下移动杵时，避免在羽绒均质化过程中产生过多气泡，并坚持协议中指示的笔画次数。