控制用于3D细胞培养的微孔退火颗粒支架中的颗粒分数

颗粒材料，例如MAP支架，是由相互连接的微尺寸水凝胶颗粒制成的多孔可注射材料。控制颗粒分数对材料特性和细胞反应至关重要。MAP支架中的可变颗粒分数会产生一系列支架属性和细胞响应，但这种技术允许用户在他们创建的MAP支架中定义最终颗粒分数。

MAP支架可用于促进复杂伤口的修复和再生，以及输送药物。例如，颗粒分数会影响细胞浸润和再生的速度和程度。该方法可应用于所有类别的颗粒水凝胶。

现在我们可以用用户控制的颗粒组分制造MAP支架，我们可以重复地研究这些材料的生物活性并研究独特的细胞反应，例如限制。设置微流体微凝胶生成需要时间和耐心，因为您学习技术。最好准备好多个设备，以防您在设置时遇到问题。

从透明质酸（HA）和降冰片烯（NB）微凝胶的微流体生产开始。在干燥微凝胶之前，称量冷冻安全的螺旋盖管。然后在无菌罩中，使用外置活塞式移液器将洗涤和纯化的微凝胶转移到冷冻安全的螺旋盖管中。

在纯化的微凝胶中加入70%乙醇并充分混合。将试管以5， 000 g离心五分钟。吸出上清液，加入70%乙醇。

充分混合并在四摄氏度下孵育过夜。第二天，短暂离心以确保微凝胶位于管底部。将液氮加入低温容器中，并放置微凝胶管进行快速冷冻。

5至10分钟后，用镊子取出微凝胶管。快速取下盖子，并用实验室级组织覆盖试管。用橡皮筋固定组织，并将其转移到冻干容器或腔室中。

按照制造商的说明将样品加载到冻干机上，并在0.066托和零下63摄氏度下冻干。称量管中的冻干微凝胶，然后将其储存在室温下。将聚二甲基硅氧烷或PDMS弹性体基料与固化剂以10:1的质量比混合。

将PDMS混合物倒入一个大的塑料培养皿中，并在干燥器中脱气30分钟，或直到所有气泡消失。一旦所有的气泡都消失了，小心地将3D打印的模具放入PDMS中，以尽量减少新气泡的形成。放入 60 摄氏度的烤箱中两个小时以固化 PDMS。

固化后，用刀或剃须刀片在培养装置的周边轻轻描摹，并小心地去除霉菌。使用四毫米活检打孔器从孔底部去除任何PDMS。切割设备以适合玻璃盖玻片。

使用胶带清除培养装置底部的灰尘。将干净的玻璃盖玻片和培养装置放在 135 摄氏度的热板上 15 分钟以去除水分。在通风橱中，使用高处的玻璃盖玻片和设备底部的电晕等离子枪 30 秒。

然后快速将处理过的表面粘合在一起。轻轻施加压力，以确保培养装置和玻璃盖玻片之间的良好密封。将设备放入 60 摄氏度的烤箱中过夜以固定粘合。

第二天，将装置高压灭菌灭菌后再在体外使用。接下来，根据所需的颗粒组分制备微孔退火颗粒或MAP支架组件，以便在MAP支架中进行细胞培养。称量冻干微凝胶以确定微凝胶的质量。

然后根据所选的重量百分比MAP在细胞培养基的最终MAP体积的84%中重建微凝胶。让微凝胶膨胀 20 分钟。将透明质酸或 HA-四嗪和细胞培养基溶解在最终 MAP 体积的 16% 中。

一旦细胞达到所需的汇合度，提起并计数细胞。将每微升MAP中的10， 000个细胞转移到新管中。离心细胞，并从沉淀中吸出上清液而不吸出细胞。

使用置换移液器将微凝胶和交联剂添加到沉淀中。充分混合，每孔播种10微升。以圆周运动移液，使混合物均匀分布在孔中。

让微凝胶在37摄氏度下退火25分钟，然后加入细胞培养基以填充孔。将 3D 培养物保持在 37 摄氏度，并根据需要更换培养基。为避免吸出支架，请沿上孔的脊稳定移液器尖端。

在所需的时间点，通过在室温下每孔用 50 微升 4% 多聚甲醛替换培养基 30 分钟来固定样品。用50微升PBS或优选缓冲液洗涤样品三次，然后使用每孔50微升的工作体积进行免疫荧光或荧光染色。具有流动聚焦区域的微流体装置被证明可以产生直径为50或100微米的HA-NB微凝胶。

使用70%乙醇优化了用于冻干微凝胶的培养基，以最大限度地减少冷冻凝胶的形成。然而，其他介质，如异丙醇、水和乙腈可以互换使用，以促进冷冻凝胶的形成。为了促进HA-NB微凝胶的生物正交互连，合成了线性HA-四嗪交联剂。

质子核磁共振波谱显示，使用四嗪侧基团成功修饰了11%的HA重复单元。将干燥的冻干微凝胶产品用特殊体积进行再水化并退火，以在MAP支架中得到不同重量百分比的微凝胶配方。MAP支架中微凝胶的这些重量百分比对应于独特的颗粒组分。

此处显示了MAP支架中的细胞培养。MAP支架中3D培养中的细胞在第五天固定，染色并在共聚焦显微镜上成像。单个Z切片显示细胞生长和支架的差异，支架包含不同的重量百分比MAP。

根据您是否需要冷冻凝胶适当选择冻干培养基。不要跳过孵育步骤，以便您的微凝胶有足够的时间在培养基中溶胀。显微镜、流式细胞术、RNA测序等标准技术可用于评估这些具有明确孔隙率的颗粒材料中的细胞反应。