荧光激活神经元核负分选结合单核RNA测序研究海马神经源性生态位

使用负 FACS 分选排除神经元的策略可产生低丰度细胞群（如神经干细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞）的高质量 RNA 测序速率，以研究它们在成人海马神经发生调节中的作用。使用这种方法，可以调整FACS门控中抗体的选择，这使得该协议在解决与齿状回相关的各种生物学问题方面非常通用。该方法主要用于研究成年海马生态位。

然而，它可以很容易地适应研究其他干细胞生态位。展示该程序的将是弗朗西斯克里克研究所的博士后培训研究员Sara Ahmed de Prado。首先，将从安乐死小鼠解剖的大脑转移到装有冰冷PBS的10厘米培养皿中。

然后将培养皿放在冰上，沿着矢状轴将大脑切成两半。使用手术刀切除小脑。将大脑的一半转移到放置在冰上的新的10厘米培养皿中，其中包含冰冷的PBS。

使用双筒望远镜解剖齿状回或DG，并重复此步骤以从大脑的后半部分获得第二个DG。将两个DG转移到预冷的Dounce均质器中，并加入1毫升冷均质缓冲液或HB。用松散的A杵10笔使组织匀浆，然后用15笔的紧密B杵匀浆。将匀浆转移到预冷的15毫升管中。

用1毫升冷HB冲洗Dounce均质器，并将其与同一管混合。将3毫升HB加入15毫升管中，并在冰上孵育5分钟。通过轻轻倒置试管来混合该细胞核悬浮液两次。

使用0.5毫升HB，预润湿放置在50毫升试管上的70微米过滤器帽，然后在用0.5毫升HB洗涤细胞过滤器之前过滤细胞核悬浮液。接下来，取出细胞过滤器并将试管在 500 x g的旋转桶离心机中以 4 摄氏度离心 5 分钟。弃去上清液。使用 P1000 移液管将沉淀轻轻重悬于 4 毫升 HB 中。

在冰上孵育5分钟后，将悬浮液在500×g下离心10分钟，温度为4摄氏度。弃去上清液并将沉淀重悬于3毫升洗涤介质中。使用0.5毫升洗涤介质在50毫升试管上预润湿35微米过滤器盖。

然后使用 P1000 移液器一次移取 0.5 毫升悬浮液来过滤细胞核悬浮液。用0.5毫升洗涤介质清洗过滤器盖后，将管子放在冰上。将滤液转移到新的15毫升管中，并在500 x g 下离心5分钟和4摄氏度。

弃去上清液，并将沉淀重悬于3毫升洗涤介质中。重复离心并将沉淀重悬于1毫升洗涤介质中，用小鼠抗NeuN，Alexa Fluor 488偶联抗体和每毫升1微克DAPI。在黑暗中在冰上孵育反应45分钟。

对于荧光活化细胞核分选或FANS，将免疫染色的细胞核悬浮液转移到5毫升试管中，并将其放在冰上直到流式细胞术程序开始。将样品以温和的强度涡旋3秒钟，然后将试管放入FACS仪器中。要从染色的细胞核悬浮液中获取数据，请将门设置为DAPI高度和DAPI区域，以排除细胞碎片和聚集的细胞核。

然后在对数侧散射或SSC区域和对数前向散射（FSC）区域中设置门，以将单个细胞核与剩余的DAPI染色聚集体或细胞碎片分开。然后通过设置抗NeuN-AF488和FSC区域的门来隔离NeuN-AF488阴性群体。分析后，使用门控策略在装有 50 微升洗涤介质的 1.5 毫升收集管中对抗 NeuN-AF488 阴性群体进行分类。

分选完成后，向收集管中加入 1 毫升含有 1% 牛血清白蛋白或 BSA 的 PBS，以收集管壁上的液滴，并在 500 x g 下以 4 摄氏度离心管 5 分钟。弃去上清液，留下50微升溶质重悬离心的细胞核。在0.5毫升微管中，将5微升的细胞核悬浮液加入5微升台盼蓝中。

在进行文库制备和细胞核测序之前，使用自动细胞计数器测量浓度并评估单细胞悬液的活力。生物信息学聚类揭示了与DG内已知细胞类型相对应的分离良好的细胞核组，有或没有FANS。在非FACS分选的样本中，大多数高质量的测序细胞核占神经元的84.9%。

它由三组神经元组成，表明齿状回中最具代表性的细胞群可能是颗粒神经元、其他兴奋性神经元和抑制性神经元。在非FACS分选的样品中，鉴定的非神经元簇主要由11.1%的神经胶质细胞类型组成，包括星形胶质细胞，少突胶质细胞和少突胶质细胞前体细胞，3.3%免疫细胞和0，6%Cajal-Retzius细胞。在进行FANS排除NeuN阳性群体的同时，神经胶质细胞簇变得突出，占总细胞核的81.3%。

对于每个细胞核 50， 000 个读数测序的样品，非 FACS 分选样品的每个细胞核检测到 25， 010 个基因，NeuN 阴性 FANS 样品检测到 1， 665.5 个基因，证实了单个细胞核的高质量转录组学分析和 FACS 分选不会破坏后续 snRNA-seq 的细胞核。非FACS分选样品中高比例的神经元具有更高的转录活性，每个细胞核2， 660个基因，非FACS分选样品中每个细胞核6， 170个转录本，平均转录活性为每个细胞核1， 090个基因，每个细胞核1， 785个转录本。一旦使用该协议生成数据，就值得考虑这些新的正交方法，例如特殊症状或体内研究以验证任何发现。