用于评估人iPSC来源心肌细胞结构和收缩变化的杂交细胞分析系统，用于临床前心脏风险评估

该方法可以使用真实的人类数据帮助回答临床前心脏安全性和毒性相关问题，以便将候选新药安全过渡到临床阶段。这种混合系统的主要优点不是使用一组不同的体外和体内技术，而是同时评估人iPC来源的心肌细胞，电生理和活力参数，以及分析生理条件下的收缩特性。该方法可用于药物发现，因为它涵盖了心肌细胞的电生理、结构和收缩变化，以及允许同时测试 69 个孔的更高通量系统。

要开始板涂层，请将收缩板的底部由额外提供的膜护罩覆盖，直到在收缩力模块中进行测量。为了接种心肌细胞，通过在无菌离心管中转移2.75毫升EHS凝胶即用型溶液和8.25毫升DPBS与钙和镁来制备稀释的EHS凝胶包被溶液。然后混合溶液。

从收缩板上拆下膜护罩。将制备好的涂层溶液转移到实验室自动化机器人中的无菌试剂储液器中。使用该程序，使用实验室自动化机器人添加100微升，每孔添加100微升涂层溶液。

然后将盖子放回 96 孔板上，并在 37 摄氏度下孵育三小时。解冻并计数细胞后，根据细胞制造商的说明在推荐的电镀介质中调整细胞，产生每11毫升11倍10至第六个细胞，用于接种整个96孔板。使用程序去除100微升，通过实验室自动化机器人从孔中去除EHS凝胶溶液。

接下来，将11毫升细胞悬液转移到放置在实验室自动化机器人中的无菌试剂储液器中，并在每孔中接种100微升悬浮液的细胞。使用该程序，细胞增加100微升。细胞接种后，立即将灵活的96孔板转移到37摄氏度，5%二氧化碳的湿度控制培养箱中，并使细胞沉降过夜。

将22毫升心肌细胞维持培养基温热至37摄氏度加入到每个板的50毫升离心管中。接种板后 18 至 24 小时，将新鲜培养基转移到无菌试剂储液槽中，并将其放在实验室自动化机器人旁边。然后使用该程序进行培养基去除，去除 100 微升。

接下来将含有新鲜培养基的试剂储液槽放入实验室自动化机器人中，并用程序每孔分配200微升新鲜培养基，加入100微升。执行此步骤两次以达到每孔200微升。培养基交换后，立即将板转移到培养箱中。

每隔一天进行一次培养基更换，直到加入化合物。在化合物添加前四到六个小时，通过将22毫升新鲜和温暖的测定缓冲液转移到无菌试剂储液槽中并将其放在实验室自动化机器人旁边，进行最终的培养基更换。培养基交换后立即将柔性板转移回培养箱中。

基线测量前一小时将板转移到相应的测量设备上。在控制软件中，打开编辑协议并选择相应的测量模式、弹性站点或阻抗 EFP。在保存协议编号之前，将一次测量的扫描持续时间或长度定义为 30 秒，将重复间隔定义为 10 分钟。

然后选择"启动协议"并继续填写请求的字段。设置参数后，选择开始测量。在化合物添加前不久，每隔五分钟至少进行三次基线测量。

从每个孔中取出50微升测定缓冲液，而不从测量装置上取下柔性96孔板，然后根据测量计划向板的每个孔中加入50微升四倍浓缩的化合物溶液。添加化合物后，选择添加试剂标记以定义化合物板布局和化合物溶液的体积。然后根据实验计划选择"继续标准测量"或"继续测量系列"。

代表性分析显示了激酶抑制剂埃洛替尼对人iPSC来源心肌细胞收缩力的影响。在最低浓度下，埃罗替尼诱导振幅在统计学上不显着降低，而埃罗替尼的微摩尔浓度显示出时间和剂量依赖性心脏毒性作用。使用1微摩尔厄洛替尼从96小时开始见效果，而用10微摩尔埃洛替尼治疗导致化合物添加后24小时显着降低。

施用10微摩尔表柔比星后，细胞在24小时内停止跳动。应用一微摩尔表柔比星后，振幅在24小时后急剧下降，然后完全停止搏动，直到48小时。在100纳摩尔时，观察到搏动幅度随时间变化。

在10纳摩尔的最低浓度下，振幅稳定波动，证实表柔比星的作用仅是剂量依赖性的。用阿霉素和硝苯地平处理24小时以浓度和时间依赖性方式降低细胞活力。在应用增加硝苯地平浓度时，细胞上的场电位记录显示归一化的场持续时间的浓度依赖性缩短。

硝苯地平关于心脏收缩力的评估也显示，在10纳摩尔和13纳摩尔浓度的急性测量中，浓度依赖性振幅显着降低。重要的是要记住，细胞通常对环境参数敏感，如温度和pH变化以及机械模拟，这在收缩板上特别支持。