啮齿动物心肌细胞心脏收缩功能障碍和^Ca2+ 瞬变分析

这种方法检测心力衰竭发展过程中收缩功能的变化。还可以筛选肌细胞对神经激素和潜在治疗药物的功能反应。定位肌细胞可能需要练习，但对于获得一致的肌节长度成像至关重要。

演示该程序的是实验室副教授兼首席研究员Margaret Westfall。在开始实验之前，将凝胶包和培养基在37摄氏度的培养箱中预热30分钟。打开稿件中提到的收缩功能平台组件，将管道组装到蠕动泵中。

然后，将预热的凝胶包转移到管支架中，并在细胞刺激器的电源中打开真空。将带有介质的 50 毫升管放入绝缘管支架中，以每分钟 0.5 毫升的速度开始通过蠕动泵管灌注。接下来，将两毫升预热的培养基加入一个小称重舟中，并将一个含有肌细胞的盖玻片从刺激室转移到称重船上。

将刺激室在37摄氏度和5%二氧化碳下返回培养箱。从秤船上取下盖玻片并轻轻擦拭底面，然后将其转移到刚涂过油的盖玻片室中，并在盖玻片上添加一滴介质。将铂电极支架放在盖玻片上，然后用镊子在顶部放置一个新的盖玻片，并将顶部支架放在盖玻片三明治上。

安装两个或四个零号盘头螺钉以完成腔室的组装。在蠕动泵中，当介质存在于整个管道中时，将管道连接到预热器，将预热器连接到盖滑室。然后，以每分钟0.5毫升的速度开始灌注，并在腔室下方放置纸巾擦拭以确保没有泄漏。

将盖玻片室放入显微镜的载物台适配器后，打开加热系统并使组件平衡5至10分钟，以在室中心实现37摄氏度的恒定介质温度。观察在腔室另一端收集的灌注介质，管道连接到真空系统。在平衡期间，在显微镜上使用40倍水浸物镜观察肌细胞。

要激活起搏刺激器，请将电压设置为 35 至 40 伏，并将刺激频率调整为 0.2 赫兹，以优化收缩功能和肌细胞存活。要收集肌节缩短痕迹，请在计算机上打开软件并选择确定，文件和新选项卡。通过选择迹线、编辑用户限制和肌节长度来准备屏幕模板。

使用文件和新选项卡记录肌节长度轨迹，识别收缩的肌细胞并沿相机的纵轴定位肌细胞，使条纹图案垂直。使用计算机鼠标将感兴趣区域或ROI框放在肌细胞上。选择收集并开始记录收缩功能。

记录每个肌细胞在0.5赫兹的低刺激频率下缩短60秒。记录肌节缩短，从每张盖玻片 5 个细胞缩短到 10 个细胞。为了测量一系列频率的缩短，请在记录之前将肌细胞放置在每个频率以获得稳态缩短。

将灌注速率加倍，并在刺激后 15 至 20 秒以 0.2 至 2 赫兹范围内的新频率开始记录，并且每个盖玻片记录不超过两个肌细胞，以便在给定的刺激频率范围内缩短。记录每个细胞至少七次收缩，以获得可靠的信号平均数据。选择文件，选择记录的跟踪，然后选择"打开"。

选择基本跟踪的一个选项卡，然后在跟踪顶部设置黄色面板以获取 sarc 长度。准备一个分析模板，其中包含操作单调瞬态分析选项和 TTL 事件标记，在菜单中的必要选项中的 T 零定义框中。通过选择模板保存这些分析选项，并使用标识符保存分析模板。

在分析每个跟踪之前加载分析模板。要分析数据，请选择标记，门控，添加瞬态，然后从事件标记和分析范围转换。将肌细胞的时间范围设置为负 0.01 到 1.20 秒，步调为 0.2 赫兹。

为以较高频率刺激的肌细胞选择较短的时间范围。选择操作和平均事件以在原始基本迹线下方生成信号平均记录。接下来，选择信号平均迹线的选项卡之一，然后转到上方菜单上的标记，然后添加瞬态，选择操作和单调瞬态分析以在信号平均显示面板中显示基线肌节参数的信号平均值。

选择导出单调瞬态分析和剪贴板电流，并将瞬态肌节分析传输到电子表格，以便对多个肌细胞进行复合分析。要复制信号平均迹线，请依次选择导出、当前迹线，然后选择剪贴板和选项选项卡，并将小数位数设置为 5。选择制表符分隔符，然后单击确定。

将每个心肌细胞记录的信号平均迹线放入第二个电子表格中。研究表明，与假组相比，压力超负荷或PO降低了肌细胞的收缩功能。然而，在心肌肌钙蛋白IT 144D或cTnIT144D基因转移4天后，PO肌细胞的收缩能力恢复到假水平，表明肌细胞功能可以恢复。

在最初的研究中，与CTnI相比，cTnIT144D的基因转移增强了峰值缩短和舒张期钙水平升高。通常需要微调心肌细胞的位置以获得清晰的缩短痕迹。该方案也可以对装载有钙敏感荧光染料（如Fura-2 AM）的心肌细胞进行，以检测钙瞬变以及缩短。