用解剖学特异性单细胞基因表达方法研究成瘾行为中抗奖励的驱动因素

该方案具有高灵敏度，允许以单细胞分辨率高通量捕获基因表达谱。该技术在单细胞分辨率下提供解剖学空间和分子特异性。收获大脑，选择单细胞并制备mRNA后，将对照线液注入qPCR芯片进行启动。

将qPCR芯片插入微流体混合装置中。选择 Prime 脚本并运行程序。程序完成后，取出引物的qPCR芯片，并从PCR样品板中移取6微升的反应物到引物qPCR芯片中的相应样品孔中。

现在，将6微升的反应物从PCR检测板移液到相应的检测孔中，放入引物qPCR芯片中。然后将芯片插入微流体混合装置。选择"加载混合"脚本并运行程序。

打开微流体RT-qPCR平台并预热灯泡。从微流控混合装置中取出qPCR芯片，并从芯片底部撕下保护贴纸。打开微流控RT-qPCR平台，将qPCR芯片加载到平台中。

通过单击开始新运行来启动数据收集软件。验证芯片条形码和芯片类型。然后点击下一步。

选择芯片运行文件并浏览数据收集存储的文件位置。然后单击"应用程序类型"并选择"基因表达"。选择ROX作为无源参考，选择单探头，选择EVAGreen作为探头类型。

单击以选择热循环程序，然后选择Biomark HD GE:Fast 96x96 PCR + Melt v2。PCL 文件。下载数据分析软件。

启动软件以分析微流体RT-qPCR实验。单击芯片运行并打开芯片运行。由实验者创建的 BML 文件。

将弹出一个窗口，显示实验详细信息，包括被动参比、探针和 PCR 热程序。在"芯片浏览器"选项卡下，单击"样品板设置"并创建新的样品板模板。根据实验设计将样品标签复制并粘贴到软件电子表格中。

输入样品名称和用于标准样品的RNA浓度。现在，通过单击任务菜单中的映射并选择 SBS96-Left.dsp，映射示例设置。接下来，选择详细信息视图以更新文件中的这些更改，然后单击分析。

选择检测板设置并创建新的检测板。选择适当的容器类型和格式。根据实验设计粘贴检测名称，然后单击分析。

在分析设置窗格中，单击用户并将拟合设置为自动。现在，手动查看 96x96 芯片中的每个反应。可视化扩增曲线和熔解曲线，以确定每个反应是否遵循预期的qPCR模式。

如果扩增或熔解曲线与预期不匹配，则该反应失败。按照 QC，通过选择文件、单击导出并将数据集另存为 csv 文件来导出数据。由于导出的 csv 文件同时具有通过失败矩阵和具有原始 CT 值的矩阵，因此请使用传递失败矩阵将数据集中的任何失败单元格替换为 NA。下载最新版本的开源 R 软件，然后下载 R Studio 应用程序。

对于中位数居中，使用 R 软件计算根据单个样本的所有 CT 值计算出的中位数 CT 值，然后从该中值中减去所有单个 CT 值以获得负增量 CT 值。对于管家基因归一化，计算每个样本的管家基因的平均表达，并使用此值减去各个 CT 值。若要生成负增量增量 CT 值，请在 R 软件中运行代码。

将规范化数据集上传到 R 并使用缩放函数分析数据，生成缩放后的数据，然后使用 R 热图函数或单独的软件生成热图。要组织数据集以获得其他功能，请计算每个基因之间的皮尔逊相关性，然后计算熔融函数。导出这些数据并将其上传到基因相关网络软件中。

神经元显示NeuN表达升高，小胶质细胞样品显示小胶质细胞标志物Cd34和Cx3xr1的显着表达。与Th神经元和小胶质细胞样品相比，Th+神经元样品的Th表达显着升高。Th神经元显示出Gcg的显着表达，表明Th神经元样本富含使用Glp1作为神经递质的神经元。

线性判别分析表明，这三种细胞类型在所有65个基因中具有不同的基因表达谱。使用热图表示通过酒精戒断时间序列富集Glp1神经元样品的细胞亚表型。高度表达炎症基因簇一的亚表型A在8小时戒断时间点的比例增加，并在32小时戒断时达到最大值。

炎症亚表型通过停药 176 小时恢复正常以控制。高度表达GABA受体基因簇2的亚表型B表明，在176小时戒断条件下，该基因簇的表达受到总体抑制。将单个样品的基因表达合并为平均值，以便在整个时间序列中可视化基因簇的表达和该基因转录本的蛋白质位置。

该技术可以应用于任何生物系统或组织，以了解细胞对疾病或扰动的反应。也就是说，在单细胞分辨率下破译与组织的空间和解剖结构相关的分子反应。