使用张力测量小体积腔肌图测量小鼠胸主动脉内皮依赖性血管松弛

我们展示了等距或张力肌图作为金标准方案，以测量在良好控制的生理条件下小阻力或大导管血管的反应性。测量结果具有高度可重复性和可靠性。该技术在允许研究人员分别研究不同血管层或同时研究血管壁不同层之间的相互作用方面非常有价值。

演示该程序的将是我实验室的研究实验室专家罗伯特·福克（Robert Folk）。首先打开水浴并将其设置为 37 摄氏度。将两个适当标记的烧杯放入水浴中，一个装有 600 毫升 HEPES-PSS 溶液，另一个装有 150 毫升高钾溶液。

将装有 300 毫升 HEPES-PSS 溶液的烧杯与碳原气体充气至少 10 分钟。将30毫升充气HEPES-PSS溶液加入50毫升离心管中，适当标记，并将其放在冰上。将剩余的充气HEPES-PSS溶液放在冰上，以便在主动脉夹层过程中使用。

打开每个肌图室中 5 毫升 HEPES-PSS 溶液的四室肌图单元，并将热量设置为 37 摄氏度。让每个腔室中的溶液充气 30 分钟，并检查以确保腔室已达到所需的 37 摄氏度。打开肌图数据采集硬件和计算机。

将从安乐死小鼠中切除的胸廓转移到装有冰冷充气HEPES-PSS缓冲液的透明硅弹性体涂层培养皿中，并将其固定在两侧。在显微镜下，轻轻地从肋骨中切下并取出心脏和附着的主动脉，转移到干净的硅胶弹性体涂层培养皿中，然后轻轻地从主动脉中取出脂肪结缔组织和凝结的血液。使用锋利的小剪刀，解剖并隔离从弓区到降主动脉底部的整个主动脉。

将解剖的主动脉切成四段，每段 2 毫米。使用盘子内的迷你尺作为参考。在已经包含5毫升加热和充气HEPES-PSS缓冲液的腔室中，使用镊子小心地将每个2毫米的主动脉段滑到两个安装销上。

将腔室放回肌图单元时，通过逆时针旋转千分尺来缓慢地将针移开，使主动脉段不会从针上滑落。将每个肌图室放回装置，并开始在 37 摄氏度下给室充气 20 分钟。排干腔室，并向每个腔室中加入 5 毫升新鲜、温热、充气的 HEPES-PSS 溶液。

如果需要，重新调整力测量值以读取 6 毫牛顿的最佳张力。将纸巾再静置 15 到 20 分钟。打开数据采集软件。

将跟踪号从 50 更改为 1 到 500 更改为 1，然后按开始。在开始新实验之前，请务必在数据采集软件上添加适当的标签。再次排干腔室，然后向每个腔室中加入 5 毫升高钾溶液。

一旦对高钾溶液的收缩响应达到产生力的平台，再次排空腔室。用HEPES-PSS溶液清洗纸巾三次。向每个腔室中加入5毫升高钾溶液。

一旦对高钾溶液的收缩反应达到产生力的平台，立即排出腔室，并用HEPES-PSS清洗组织三次，然后将组织休息15至20分钟。用血管收缩剂 PE 预先收缩主动脉节段，剂量低于最大剂量。让PE诱导的收缩曲线达到张力发展的平台期。

以 5 微升增加剂量的乙酰胆碱工作储备溶液以 3 分钟间隔向 PE 中加入张力发展平台，以确定肌图室中乙酰胆碱的最终浓度从 50 皮摩尔到 10 微摩尔，如文本手稿中所述。完成剂量反应实验后，排干腔室，用温热和充气的HEPES-PSS溶液清洗主动脉段三次，并使组织休息30分钟。静息主动脉瓣30分钟后，引流腔室并向每个腔室中加入新鲜，温暖的高钾溶液，然后引流腔室并在对高钾溶液的收缩反应达到F平台时用HEPES-PSS溶液清洗组织如前所述。

通过加入10微升制备的100毫摩尔工作储备溶液，用L-NAME预孵育主动脉瓣，以评估一氧化氮产生对观察到的乙酰胆碱诱导的血管松弛的贡献。在不去除 L 名称的情况下，将次最大剂量的 PE 添加到腔室中以诱导主动脉收缩。等到PE诱导的收缩曲线达到张力发展的平台期，然后将乙酰胆碱添加到肌图室中，以达到500纳摩尔的最终浓度。

等待几分钟，以记录力量发展的任何可能变化，直到形成的平台稳定。排干腔室并用温热的充气HEPES-PSS溶液清洗纸巾三次。将肌图室置于显微镜下，轻轻地将一根小线穿过主动脉腔。

轻轻地将电线穿过管腔一小段时间。将主动脉切成 2 毫米的主动脉环，并将这些环安装在肌图室上。将最佳张力设置为 6 毫牛顿，让组织在充气温 HEPES-PSS 缓冲液中静置 30 分钟，然后排干腔室并向每个腔室添加 5 毫升新鲜温充气 HEPES-PSS 溶液。

将所有肌图室的力归零，并逆时针缓慢旋转千分尺以增加引脚之间的距离，直到记录的力达到小鼠主动脉所需的最佳张力。以最佳张力再按压纸巾 15 到 20 分钟，然后再次排出腔室，然后向每个腔室添加 5 毫升高钾溶液。再次排干腔室，一旦对高钾离子溶液的收缩反应达到平台，就用HEPES-PSS溶液洗涤组织三次。

让组织静息 15 至 20 分钟，然后用血管收缩剂 PE 预收缩主动脉瓣。当PE诱导的力达到平台时，将乙酰胆碱的次最大浓度添加到肌图室中，以达到500纳摩尔的最终浓度。等待3分钟，以确保PE诱导的力发展的注册平台没有改变，然后再结束实验。

通过记录收缩力的产生来评估每个隔离容器的完整性和可行性。记录的力峰值后来用于归一化同一段的力生成，以响应激动剂。内皮介导的血管松弛测量描述了平滑肌介导的收缩和力的产生。

当PE诱导的收缩达到平台期时，增加乙酰胆碱剂量在分离段中实现了最大的血管松弛。一氧化氮抑制剂L-NAME完全阻断乙酰胆碱诱导的预收缩主动脉血管松弛，表明乙酰胆碱通过增加一氧化氮的产生诱导主动脉血管松弛。此外，从主动脉瓣去除内皮层也阻断乙酰胆碱诱导的血管松弛，强调内皮在血管松弛中的作用。

确保在处理、清洁和解剖血管时保持轻柔。小心添加药理激动剂和抑制剂至关重要，以免干扰安装在肌图室上的血管环。这些信息可以帮助设计实验，以探索潜在的治疗方法，以解决特定血管层的功能障碍。