对胚胎鸡听觉脑干进行切片以评估异位梯度和微电路

该方法获取鸡听觉脑干的活切片，该切片在同一切片中包含更大的频率区域梯度。这些切片适用于具有较大负离子轴的电生理和解剖学实验。这种方法将有助于了解听觉脑干中的微电路发展。

虽然解剖结构特定于鸡，但其他鸟类如鹌鹑和鸣禽也有类似的解剖结构。首先，用70%乙醇对鸡蛋进行消毒，并在38摄氏度和50%湿度下孵育。接下来，设置 ACSF 的鼓泡速率，使 pH 值为 7.2 至 7.4，渗透压在每升 300 至 310 毫渗透压之间。

然后将5克琼脂糖与100毫升dACSF混合。用水浴或微波炉完全溶解琼脂糖，直到琼脂糖开始冒泡。将融化的琼脂糖倒入厚度达五毫米的培养皿中，并保持在室温下凝固。

凝固后，密封培养皿并储存在四摄氏度。将琼脂糖切成隔间块，以便在解剖时使用。首先，使用70%乙醇清洁解剖区域。

将支撑或倾斜的琼脂糖块粘在振动切片机托盘上。将鸡蛋放在明亮的光线下，将充满空气的空间放在鸡蛋较大或更圆的一面，然后在充满空气的空间上掰开壳并露出膜囊。在囊中轻轻切开以露出喙。

用手术刀轻轻地将脖子和头从鸡蛋中拉出来。斩首后，用冷却的dACSF清洁头部。将头部稳定地固定在冷却的dACSF中，并做一个前尾切口。

从眼睛后面和眼睛之间的切口开始，并沿着收获的颈部的长度。分离皮肤以暴露头骨。从中线到横向切开眼睛后面的头骨。

对两个半球重复此操作。通过将刀片放在眼睛后面并进行快速切割来切开头骨的嘴部。然后将头部浸入一盘冰镇的dACSF中。

使用一把小剪刀，在颅骨的尾部区域做中线到侧切口，以分离大脑而不会造成组织损伤。轻轻暴露脑干和小脑。缩回整个颅骨的背侧区域。

取下脑干，用细画刷轻轻刷洗。使用弯曲的镊子清洁连接组织和血管的脑干。通过切开花梗并小心地去除血管，将脑干与小脑分开。

修剪其他血管的脑干。首先，沿水平轴放置振动切片机刀片。对于冠状切片，将脑干粘在嘴侧的切片托盘上，保持前尾轴垂直。

对于矢状切片，保持外侧内侧轴垂直。对于水平切片，粘合腹侧，保持背侧腹轴垂直。为了实现急性角矢状面水平面，粘合脑干的腹侧，使得腹侧背轴垂直于斜边表面琼脂糖块上。

将琼脂糖块的相对表面粘向切片托盘，并保持前尾轴平行于叶片边缘。作为振动切片机切片的替代方法，将分离的脑干浸入 40 摄氏度的 4% 低熔点琼脂糖中，浸入 35 x 10 毫米培养皿中。琼脂糖凝固后，使用锋利的剃须刀片切割隔间琼脂糖块。

将琼脂糖块粘在其嘴侧，保持脑干的前尾轴垂直。取冠状切片，直到看到 NM 区域。用锋利的刀片从胶水中取出琼脂糖块。

用细针轻轻地将0.5微升甲苯胺蓝染料放在NM上以点斑细胞核。将此块重新安装到切片托盘上，用于矢状切片或水平切片。相对于染色区域识别细胞核并切片脑干。

切片后，将200至300微米依次收集的切片放入含有ACSF的切片室中，在室温下平衡一小时。来自E19至21鸡胚胎的脑干组织的冠状部分代表听觉脑干核从最低到最高特征频率听觉区域的相对等频区域。传入听觉神经纤维和NM轴突的分叉可见。

还观察到角核。在喙部，上寡核位于冠状切片的腹侧区域。在矢状切片中，在听神经纤维进入神经元簇的地方鉴定出NM和核层或NL。

在前外侧区域鉴定出上寡核。沿前尾轴观察到NM和NL的低频和高频特征听觉区域。最内侧切片显示同侧和对侧轴突簇以及听觉区域的终点。

在水平切片中，NM和NL被鉴定为中线，神经元沿外侧内侧轴分布。从水平面锐角的脑干组织切片显示听觉脑干核横跨大对角线扩散。放大图像显示听觉核沿前内侧至尾外侧轴的肌腱轴。

确保整个过程在冰冷的dACSF中连续用碳水化合物氧鼓泡进行。该协议用于研究人员研究发育脑干微电路的解剖学和生物物理特性，特别是主要听觉核之间的关系。