福斯特共振能量转移映射:阐明全球结构特征的新方法

我们开发了一种FRET映射方法，可以鉴定和表征配体结合位点，亚基取向，与配体结合相关的构象变化以及蛋白质的动态运动。这种技术的一个优点是它可以在溶液中进行，分子可以自由移动。通过该技术测量的距离适用于生物系统。

FRET 广泛适用于许多系统。绘图增强了对任何生物分子系统中的结构和动态变化的监测，如果存在三维结构信息，则特别有效。纯化蛋白质后，最难的部分是高效标记，并去除游离染料。

对于实验，尽可能少的游离染料是有帮助的。首先，选择在惩罚性结合位点的25至75埃范围内以及蛋白质相对静态区域的标记位点。距离将决定要使用的特定FRET染料对。

将标记位点定位在彼此相对不同的蛋白质区域中。因此，这些位点描述了三角形的顶点，惩罚性结合位点位于中心。为了测量R0值，根据所需的比色皿尺寸和体积，以相同总蛋白质浓度制备两个蛋白质样品。

一种仅用供体染料标记蛋白质，另一种仅用受体染料标记蛋白质。如果使用光谱荧光计，请打开荧光计并在FluorEssence软件中打开光谱采集和分析程序。单击红色 M 将计算机连接到仪器，然后选择发射光谱。

使用采集实验菜单项输入扫描参数，例如激发波长、发射扫描范围、温度和样品会改变您的位置。单击RTC并优化仪器设置，如手稿中所述，通过使用在染料吸收最大值处设置的激发波长监测峰值处的荧光发射。将供体标记的蛋白质样品置于样品支架中，然后单击运行以生成仅用供体染料标记的蛋白质的发射扫描，方法是在染料吸收最大值处激发样品，并在发射峰上进行扫描。

通过将扫描扩展到峰值末尾的25至50纳米处，为扫描建立基线。如文本手稿中所述，通过对不同浓度的样品进行吸收和荧光测量来测量仅供体蛋白质的量子产率。以相同的浓度制备仅供体蛋白、仅受体蛋白和供体-受体蛋白样品。

获得供体仅扫描即可产生荧光发射光谱。在供体染料吸收最大值处激发溶液，并在供体和受体发射峰上扫描。将样品更换为仅受体蛋白，或更改样品将您的位置更改为仅含有受体蛋白的比色皿。

仅获得用受体染料标记的蛋白质的发射扫描。在供体激发波长处激发样品。将样品更换为供体-受体蛋白样品或更改样品，将位置更改为含有供体-受体标记蛋白的比色皿。

使用相同的设置获得供体 - 受体蛋白样品的发射扫描。对于所有光谱，通过减去扫描结束时测量的背景计数来校正背景荧光。使用 3D 图形查看程序（如 PyMOL）将距离映射到结构上，方法是将脚本中的命令直接输入到具有相应距离信息的命令窗口中。

为测量的每个距离和相关误差生成一个壳体。通过不同外壳的交集映射位置。使用SecA和SecYEG上的三个不同位置以及信号肽上的四个不同位置绘制信号肽结合位点。

FRET在前蛋白的不同区域与SecA和SecYEG蛋白上的三个不同位置之间进行FRET实验，绘制了前蛋白结合位点和取向。信号肽的惩罚性结合位点先前被确定为双螺旋指，SecA C端尾巴表明方向平行于双螺旋指。得到SecA37、磷酸化钼和磷酸化钚22之间的稳态FRET光谱。

供体强度的降低表明从PhoA22转移的能量更大。相对于距离SecA37更远的PhoA2站点。时间分辨荧光衰变光谱表明，供体-受体复合物具有较短的均质衰变，与与一个距离相关的能量转移一致。

在SecA PhoA2残基和三角化位点之间构建的FRET距离壳表明，每个壳都与双螺旋指相交，假设的结合位点以绿色显示。相交区域小于每个FRET壳，并且包括来自螺旋支架的大量贡献。FRET在PhoA2残基和标记位点之间确定的壳的距离，描述了位于靠近双螺旋指尖和SecYEG通道口的较小区域。

这个相交的区域位于PhoA2的双螺旋指的另一端。需要考虑的重要事项包括正确选择标记位点以对感兴趣区域进行三角测量，测量每个位点的量子产率，并去除所有游离染料。该方法与通过NMR或X射线晶体学等方法获得的结构信息一致。

当FRET结果被放入结构上下文中时，它可以增强现有信息。