肌动蛋白动力学、离合器耦合和牵引力分析，促进生长锥体前进

单斑点成像和牵引力显微镜的耦合分析可以分析生长锥前进和导航的分子机械。由于这些技术使用市售材料和标准显微镜。研究人员可以从字面上适应他们研究中的技术。

首先在体外用培养基中以1至2000的稀释度用四甲基罗丹明或TMR配体处理神经元3。然后将神经元保持在37摄氏度，其中5%二氧化碳一小时。孵育后，用预热的PBS洗涤TMR配体三次。

在将0.5毫升温热的Leibovitz的L-15培养基加入神经元之前，先取出PBS。将神经元保持在37摄氏度一小时。接下来，打开落射荧光显微镜，将状态顶部培养箱设置为37摄氏度。

然后将TMR配体处理的神经元放在加热的舞台顶部培养箱上的玻璃底皿中。将图像采集参数（例如 Lifeact 和 HaloTag-actin 荧光通道的曝光时间设置为 500 毫秒），以及以 3 秒的时间间隔（50 帧）将像素 0.065 微米 x 0.065 微米的分档设置为 50 帧。在选择强烈表达Lifeact并每周表达HaloTag-actin的生长锥体后。

关闭隔膜上的磁场以照亮包括生长锥在内的最小区域，并获取延时图像。在体外3的一天，用0.5毫升温热的Leibovitz的L-15培养基替换培养基，并将神经元保持在37摄氏度下一小时。对于牵引力显微镜，打开激光扫描共聚焦显微镜，并将载物台顶部培养箱设置为37摄氏度。

将神经元放在预先警告的阶段顶部培养箱上的玻璃底培养皿上。按照菜单脚本中所述设置图像采集参数，并选择强烈表达增强型绿色荧光蛋白或EGFP的生长锥。聚焦在凝胶表面并获取延时图像。

完成后，使用图像处理软件生成单通道延时RGB图像堆栈。然后将图像另存为 tiff 文件。接下来，将100微升体积10%体积的十二烷基硫酸钠或溶解在蒸馏水中的SDS施加到玻璃底皿中，通过从底物中释放神经元来放松凝胶底物。

然后将培养皿在37摄氏度的舞台顶部培养箱中孵育五分钟以稳定温度。在激光扫描共聚焦显微镜中，聚焦在凝胶表面上，以获取未受训练基板中微珠的图像。在未受训的基材中生成磁珠的单通道RGB图像，并将此图像另存为tiff文件。

下载牵引力分析代码 TFM2021 并在 MATLAB 中打开 TFM2021。打开主。m在TFM2021中运行它。

当图形用户界面出现在屏幕上时。单击加载未训练的基板图像，然后在未训练的基板中选择X-Y位置校正的珠子图像。转到加载荧光珠图像，然后选择图像磁珠的延时堆栈。

然后单击加载明场图像以选择明场的延时堆栈图像，并使用加载GFP图像选择EGFP的延时堆栈图像。在图形用户界面的下拉列表中，单击 ROI 以指定感兴趣的矩形区域（包括生长锥），方法是单击显示的单元格图像上的两个点，从而选择 GFP。完成后，单击图形用户界面上的保存按钮，将选定的堆栈图像与ROI一起保存在mat文件中。

接下来，单击现场检测并在对话框中输入所需值，以确定磁珠检测的阈值。点击确定开始计算。完成计算后，单击绘图轨迹以放大之前选择的区域，并将检测到的珠子显示为白点。

使用选择磁珠来划分在生长锥下包含正确点的多边形区域。然后，通过按键盘上的 Enter 键，多边形区域内的白点将变为红色。单击图形用户界面中的估计力。

然后输入像素大小和杨氏模量的值，如手稿中所述。将泊松比率的值设置为 0.3，然后执行估计力以启动计算。该软件会将计算结果保存在电子表格格式文件中。

神经元生长锥的荧光图像显示出高Lifeact表达，允许在完全开放和狭窄的隔膜下可视化生长锥形形态。HaloTag-actin表达水平非常低，信号微弱。当隔膜适当变窄时，背景信号减弱，生长锥中出现斑点中的单一作用。

适当实现所有步骤的研究人员将观察到生长锥中的F-肌动蛋白逆行流动。聚丙烯酰胺凝胶的刚度是通过计算由于微球的重量引起的压痕深度来确定的。使用激光扫描共聚焦显微镜捕获凝胶表面和微球底部的图像。

来自荧光珠的信号在缩进区域的凝胶表面不可见。嵌入聚丙烯酰胺凝胶和神经生长锥中的珠子的荧光图像显示了珠子的起源和位移位置。还观察到生长锥体的EGFP信号。

运动记录仪显示了与参考珠相比珠子的运动。当进行单个斑点成像时，重要的事情是选择每周表达如何在两个最小面积下肌动蛋白的神经元。在进行牵引力显微镜检查时，高倍率成像对于牵引力的准确集中非常重要。