贴壁细胞对它们的周围施加力，这些力包括细胞施加在底物上的力，这里以绿色显示，以及细胞对它们的邻居施加的力，以红色显示。这些力可以使用称为单层应力显微镜的技术在细胞单层中测量。简而言之，该技术涉及制备水凝胶，其中含有微小的荧光珠，就在顶部表面下方，以及粘在玻璃上的大荧光珠。
在这种水凝胶上，人们看到细胞并培养它们汇合或想要测量力的任何状态。力的测量需要对细胞单层进行成像，拍摄细胞的透射光图像，以及微小和大珠子的荧光光图像。这些图像中的每一个都是在同一声乐平面上获取的。
当细胞附着并从水凝胶中分离时，这些图像被获取。对这两组图像的比较为我们提供了量化所有这些力所必需的数据。这就是AcTrM和AnViM发挥作用的地方。
在将细胞电镀后，您可以在任何所需的实例上在完全相同的位置获取图像，该协议被编程到AcTrM中，然后随后分析这些数据并可视化结果，这就是AnViM的目的。在接下来的几分钟里，我们将引导您完成为汇合细胞单层获取图像的过程。操作步骤 0 会提示用户选择获取类型。
重新开始新的实验，或继续收购以恢复先前的实验。单击"全新获取"以创建职位列表。操作步骤 1 列出了所有下一步。
这些操作将在此处的舞台位置列表窗口中执行。单击"在微管理器中实时"以可视化示例以进行手动调整。在实时视图中，我们将查看阶段。
在这里，这是很清楚的。现在，人们需要看看珠子。在这里，珠子可以在荧光中可视化。
因此，请选择适合顶部珠子的通道。同样重要的是，您能够看到一些底部珠子，因此让我们看一下底部珠子的通道。你在这里看到的是一个模糊的底部珠子的图像，只要你能看出底部珠子在那里，这完全没问题，你可以在这个图像中。
位置列表，单击标记。这就是您创建职位列表的方式。创建仓位列表（如上一视频所述）后，请使用多维采集窗口按照操作步骤 2 中列出的步骤操作。
假设我们想要执行很长的延时。在这里，我将指出我们想要拍摄的图像数量。第一个通道将是相位通道。
下一个将是顶部珠子，之后的那个将是底部珠子。在多维采集窗口中单击关闭，然后在 AcTrM 步骤 2 中单击确定。输出将保存在多维采集窗口中标识的目录中。
操作步骤 3 将询问实验是否需要恢复。答案通常是肯定的。在这里，iTACS问，我们是否要执行精细的恢复？
第一部分将使我们非常接近精炼的复苏，但底部将使我们更接近更高精度的重新定位。如果要使用有限的视野进行恢复，则提供此选项，但对于此实验，我们不会选择该选项。此时，一组参考图像的采集完成，可以关闭Micro-Manager。
对于图像采集，将启动 AcTrM。选择放大倍率，然后选择包含数据文件夹的目录。选择用于重新定位板的选项以及用于重新定位的通道。
提供了一个界面，用于将相机中当前看到的内容与保存的图像进行匹配。如果有重叠，图像将显示红色和绿色以及黑色，并且可以执行手动调整。否则，命中接受，收购将继续进行。
我们现在可以从斐济开始。在 MSM 下拉菜单中选择标记为"预处理"的第一个选项。然后，选择包含 tnimgs 文件夹的文件夹。
接下来，我们将必须定义哪个通道对应于哪个图像。对于此示例，通道 0 是透射光图像，它是细胞的相差图像。底部珠子图像为通道 2，顶部磁珠图像为通道 1。
然后，它会问你细胞在哪里交叉以及图像的哪一边。在这种情况下，单元格是向右边缘前进的单层，因此我们将取消选择"右"并继续。在这里，一小块顶部珠子区域，远离单层，其用途与底部珠子图像相同，其看起来比这里显示的更稀疏，更大。
现在它问我们是否要改变亮度和对比度，使珠子突出显示。因此，我们使用菜单中的滑块进行调整，一旦珠子出现突出，请单击"确定"。现在，我们将进行位置校正。如果有任何转变，它将摆脱它。
完成后，它将创建分析文件夹。在分析文件夹中，它将创建位置文件夹 P0，我们在前面的预处理菜单中所做的选择存储在分析选项中，例如交叉的边缘、像素大小以及相差图像等。在单层应力显微镜或 MSM 下拉菜单中，选择 MSM 凝胶变形。
从这里，我们将选择适合我们的珠子分销的选项。在处理数据时，您可以看到位置文件夹中出现了一个新的置换文件夹。这将是存储所有输出文件的位置。
这表示分析已完成。我们将研究如何计算在细胞 - ECM连接和细胞 - 细胞连接以及单层的单个细胞的细胞骨架上施加的力。为此，请选择第三个选项。
人们将选择包含tnimgs和分析文件夹的目录，这意味着人们将选择示例目录而不是这些目录中的任何一个。点击选择，它会问你，这个凝胶的剪切模量是多少？剪切模量为1250，本例中水凝胶的厚度为118微米。
此处提供了预期的噪音水平。然后，存在平均位移为零标志，在这种情况下不进行检查。选择"确定"，计算牵引力的实现将通过 MATLAB 函数执行，这就是在此版本的 AnViM 中实现的方式。
现在它已准备好对细胞 - 细胞或细胞骨架力进行计算。首先要问的问题是，单层是汇合的吗？在这种特殊情况下，我们有一个前进的单层，并且在框架的右侧有一个没有细胞的区域。
所以答案是单层不是汇合的，所以我们要说不。现在，我们被要求在最大的非像元对象周围绘制一个多边形。我们选择适当的分割方法。
在这里，它要求我们在方法3和4中指示单元格的颜色，因此这里的单元格是黑色的，因此我们将选择黑色。从这些不同方法产生的分割以细胞单层中的一些孔和无细胞区域中的一些白色区域结束。在这里，我们可以选择，自动填充点并点击 OK.So 现在所有点都填充在单层中，没有细胞区域。
然后，我们将计算细胞单层中的机械应力。我们已经执行了第一部分，其中我们从无细胞区域分割了细胞，因此我们从第二部分开始此步骤，即分割单个细胞和图像。一个是为单个单元格选择分割。
在这里，它要求我们选择职位目录。这里提供了有关这些参数的更多信息。然后，它会要求您在最小的正常像元周围绘制一个多边形。
所以你在这里绘制的东西用于计算面积，它将规定任何小于此值的东西都不被定义为一个单元格。接下来，它要求最大的细胞。然后我们围绕最大的正常像元绘制一个多边形，然后它会问，哪一个更亮？
是细胞-细胞界面更亮还是细胞中心更亮？所以在这种情况下，细胞-细胞接口更亮，所以我将选择细胞-细胞接口。因此，这表示计算已完成。
让我们从选择细胞强度的图谱开始。首先，iTACS 要求用户选择位置目录，也称为 P0 文件夹。完成后，单击"选择"。
然后询问用户是否希望iTACS检测细胞分裂或量化细胞荧光。在这种情况下，我们在细胞内没有任何荧光蛋白，这就是为什么我们选择检测细胞分裂。下一张幻灯片使用户能够定义相邻区域的大小，这是AnViM执行的独特分析，它在其中查看单个单元的属性以及相邻区域的单元的属性。
在这里，用户可以选择相邻区域的像元的宽度。在本例中，我们使用 60 像素定义相邻区域。第一个复选框询问我们是否希望 iTACS 收集单元格的属性，是的，我们这样做，这个复选框询问我们是否希望 iTACS 收集邻居的属性，是的，我们希望 iTACS 也这样做。
在这些复选框下方，如果用户希望了解有关每个复选框的更多详细信息，iTACS 将提供有关这些复选框的更多信息。这表示分析已完成。同样，iTACS 要求用户选择位置目录。
然后，用户可以选择映射力数据，创建力数据的图像，映射速度数据以及创建速度数据的图像。重要的是要注意，创建图像确实需要时间，因此可以选择现在就做或等待以后再做。这就是为什么用户可以选择或不选择选项的原因。
在这里，iTACS 要求用户再次确定相邻区域的大小，您可以使用您为映射强度确定的相同大小，在本例中为 60 像素。同样，系统会要求用户收集像元及其邻近区域的属性。这表示分析已完成。
在单层应力显微镜或 MSM 下拉菜单中，选择结果跟踪数据。首先，iTACS 要求用户选择位置目录，也称为 P0 文件夹。完成后，单击"选择"。
在这里，iTACS 询问用户希望 iTACS 从哪个帧号开始跟踪数据。从第二帧开始跟踪是非常安全的，因为无法确定第一帧的速度。在这里，iTACS 要求用户指示要同时填充的最大绘图数。
从本质上讲，这是一种加快数据跟踪的方法。完成后，单击"确定"（OK），用于在跟踪期间选择变量的选项将以与生成热图的选项类似的方式显示。感兴趣的常见属性在窗口顶部的文本框中提供。
但是，如果要自定义变量，只需删除文本框中的所有内容，然后选择下面列出的特定属性即可。在单层应力显微镜或 MSM 下拉菜单中，选择结果图。之后，iTACS 会询问用户是否要将绘图限制为具有不间断轨迹的单元格。
如果不想将绘图限制为不间断的轨迹，请单击"否"。但是，如果您确实希望将打印限制为具有不间断轨迹的单元格，请单击"是此处 iTACS"询问用户希望程序绘制多少个变量。iTACS 最多可以绘制三个变量，在本例中，我们只绘制两个变量来查看这些因子之间的关系。在单层应力显微镜或 MSM 下拉菜单中，选择结果图片。
下面是位置目录，完成后，单击"选择"。然后，iTACS 要求我们选择起始帧。在这里，我们选择了第二帧。
用于制作热图的选项以与绘制单个像元的时间轨迹的选项类似的方式呈现。有了这个，我们总结了如何制作热图。这里表示细胞骨架张力中细胞速度的时间痕迹，用于细胞编号。
这些属性显示在共享的垂直轴上，水平轴指示时间实例编号，其中帧以 15 分钟的间隔获取。第二个输出是实验开始一小时的热图数组。此处显示的属性包括扩散面积、方向、圆度、速度、运动方向、最大张力取向、细胞骨架张力、底物牵引和单个细胞的张力各向异性。
所以这是对一组实验的一瞥。还有其他几种实验情况，其中AnViM和AcTrM可以帮助用户可重复地进行实验，这些联系人在手稿中列出。iTACS的一些关键功能包括实验方案的自动化，自动化数据分析，并且不需要工程背景。
