提高可重复性以满足细胞外囊泡研究的最少信息 2018纳米颗粒跟踪分析指南

该协议是为NanoSight LM10的新手操作员开发的。通过遵循分步说明，可以获得准确且可重复的结果。无论用户的技能水平如何，此技术都有助于确保多次试运行的结果一致。

纳米颗粒表征，特别是定量，仍然是细胞外囊泡研究领域的一个挑战。该协议允许对悬浮液中的纳米颗粒进行一致的尺寸和浓度分析。首先用高质量的镜头清洁剂和镜头纸清洁激光模块的玻璃表面。

在组装模块之前，请确保O形圈密封件正确安装在流通池盖的凹槽中。然后将流通池盖放在激光模块上，确保电触点处于正确的方向。接下来，将四个弹簧加载的翼形螺钉穿过流通池板，并接合激光模块的螺纹，而无需单独拧紧。

在对流通池盖施加均匀压力的同时，以交替对角线方式均匀拧紧指旋螺钉，直到紧贴。用一毫升DPBS冲洗两个带滑锁适配器的一毫升结核菌素注射器三次。从第一个结核菌素注射器中取出并丢弃柱塞，然后将注射器插入剩余的端口以用作空洞的稀释剂或样品储液器。

然后用一毫升DPBS填充第二个注射器，并将其连接到流通池盖的入口端口。保持激光模块倾斜，出口注射器端口升高，以便在DPBS缓慢注入激光模块时从腔室中清除空气。通过将一毫升空气注入进气口，从激光模块中冲洗剩余的DPBS。

重复冲洗两次。最后一次冲洗后，尽可能完全清空激光模块，并加载模块以进行聚焦和定位。打开软件。

在左上角框的"捕获"选项卡下，单击"启动相机"。如果相机在五分钟后自动关闭，请单击"启动相机"以重新启动它。在同一选项卡中，将相机级别调整为14至16，以增亮激光线并简化粒子识别和聚焦。

通过将头件左侧的顶部滑块移入或移出，将图像从相机转移到目镜。在视野中，找到密度增加的区域（称为指纹和中心），然后垂直聚焦指纹。在视野中，将激光线居中，然后移动顶部滑块以将光线转移到计算机屏幕上观察到的相机。

计算机屏幕上的图像是从显微镜目镜中的视图镜像。调整焦点以使用对焦旋钮锐化屏幕上单个移动粒子的图像。要加载样品，将一毫升样品吸入冲洗过的一毫升结核菌素注射器中，并将注射器连接到流通池盖的入口端口。

继续推进柱塞，直到连接到出口的开放式注射器中的液体明显。模块应倾斜，以便从激光模块中清除空气。在相机视图中，将焦点移动到激光线右侧的均匀数量粒子的区域。

调整垂直方向以将水平光带居中并重新对焦，直到视图中粒子数量最多。确保所有后续措施的焦点位置保持一致。将相机级别调整到相机视图右上角的深色信息符号间歇性地打开和关闭的点。

对于纳米颗粒跟踪分析或NTA，将持续时间设置为30或60秒，将视频数量设置为5。要更改现有基本文件名，请单击具有新文件名的生成数据的新存储站点的选项卡。然后检查目标温度框以输入所需的温度，然后单击创建脚本以重复使用标准测量值。

加载示例并准备好运行实验后，单击"创建并运行脚本"。在设置报告详细信息弹出屏幕中，填写有关操作员，样品和稀释剂的必要信息的字段。填写完所有所需字段后，单击"设置确定"以启动脚本。

在每次视频捕获之前，请查找手动推进柱塞的提示。将约0.05毫升样品注入激光室。当粒子静止时，单击"确定"。完成第五次视频捕获后，设置确认框将与流程框一起出现。

由于帧是从视频屏幕底部手动推进的，因此请注意屏幕上产生颗粒的蓝色十字的数量，并设置用于处理样品的检测阈值。等待在结果直方图中自动处理视频，然后显示完成对话框通知，然后单击"确定"。出现导出设置框后，单击"导出"保存结果。突出显示当前实验中列出的所有五个捕获视频。

接下来，单击进程所选文件并等待设置确认框出现在进程框中以闪烁以更改检测阈值，然后将检测阈值调整到所需级别并转到设置并单击确定。视频将在结果直方图中自动处理，并显示一个对话框通知。单击 OK.In 代表性分析，则显示脂质体样品的纳米跟踪分析或NTA结果以及代表性的DPBS稀释剂。过滤样品的平均粒径为108纳米，浓度为每毫升10至8个颗粒的7.4倍。

相比之下，未过滤样品的平均粒径为159纳米，浓度为每毫升10至8个颗粒的7.6倍。在组合相机水平下，随着检测阈值从2个增加到5个，平均和模式粒径显示过滤样品的粒径显着减小。随着检测阈值的增加，组合相机水平下的粒子浓度降低。

未检测到过滤和未过滤样品之间的颗粒浓度有显着差异。在组合检测阈值下，随着相机水平从12增加到14，注意到过滤样品的平均和模式颗粒尺寸减小。随着相机水平从12增加到14，综合检测阈值处的颗粒浓度增加。

未过滤和未过滤样品之间未观察到显着差异。步骤 4.1 到 5.2 对于找到正确的查看区域非常重要。在多次试运行中实现一致的结果取决于这种可重复的技能。

动态光散射通常用作纳米粒子跟踪分析的伴随物，主要用于获得zeta电位，即粒子的表面电荷。对于纳米颗粒分析，NTA仍然是一种非常有价值的定量颗粒的方法，可用于细胞外囊泡研究。