通过联合共聚焦和超分辨率显微镜表征小鼠的神经肌肉接头

该协议有助于使用简单的程序以接近电子显微镜的分辨率定量分析神经肌肉接头的3D结构。该方案的主要优点是肌肉样品的处理方式相似，并免疫标记用于共聚焦和STED显微镜检查，从而减少了动物模型中准确评估神经肌肉接头结构的时间。我们开发的形态定量可以很容易地适应分析其他亚细胞结构。

我很高兴介绍来自我团队的科学家Martina Marinello博士，她将展示如何进行肌肉挑逗和免疫染色，并为成功应用该协议提供一些建议。我很高兴介绍来自Genethon成像平台的Jeremie Cosette博士，他将展示使用共聚焦和STED显微镜进行图像采集和分析。安乐死后，使用两个细锯齿状镊子开始在大约一毫米宽的小纤维束中挑逗胫骨前肌。

然后，将这些肌肉束转移到含有PBS中制备的1%Triton X-100的24孔板中，并使其在室温下轻轻搅拌一小时或在四摄氏度下轻轻搅拌五小时。在室温下用PBS洗涤样品三次五分钟后，将样品与由PBS中制备的4%BSA组成的封闭溶液与1%Triton X-100在4摄氏度下在轻轻搅拌下孵育4小时。然后，将样品与含有针对神经丝M或突触囊泡糖蛋白2的一抗单克隆抗体的相同封闭溶液孵育过夜，以分别标记突触前轴突末端或活性区。

第二天，在轻轻搅拌下用PBS清洗标记的肌肉束三次，每次五分钟。然后，将它们与适当的二抗一起孵育，方法是将它们放在室温下振荡器上两个小时。再次清洗肌肉束后，将它们放在装有安装介质的载玻片上。

然后，在顶部放置一个 1.5 级的玻璃盖板，然后在滑块的两侧放置圆柱形磁铁以施加压力并使肌肉变平。要使用共聚焦显微镜获取图像，请启动显微镜软件并选择机器作为配置模式，并根据文本手稿中提到的设置收集每个实验组中神经肌肉接头的图像堆栈。在会话结束时，单击在 3D 查看器中打开并选择代表实验组的神经肌肉接头以可视化 3D 标记。

要计算突触后神经肌肉接头和板体积、最大强度投影面积和相对曲折度，请将用于神经肌肉接头体积量化的宏拖放到 Image J 窗口中，当宏在第二个窗口中打开时，单击宏和运行宏。选择包含要分析的交汇点子文件夹的本机文件夹，然后单击"选择"。然后，在保存文件夹弹出菜单中，选择存储文件夹并单击选择。

在名为"图像类型"的新弹出菜单中，选择 Z 堆栈采集的格式。选择与感兴趣的染色相对应的RGB通道，并指示X、Y像素大小和Z步长。如果选择了专有文件格式，则宏直接读取像素大小和 Z 步长。

要量化突触前神经丝积累，请将用于神经肌肉接头积累定量的宏拖放到图像 J 窗口中，然后单击宏和运行宏。选择交汇点子文件夹、存储文件夹和 Z 堆栈采集的格式，如前所述。然后，在染色信息弹出窗口中，指示突触前和突触后标签和颜色，然后单击 OK.In 像素大小弹出窗口，将 X、Y 像素大小指示为 0.072 微米，Z 步长为 0.5 微米，然后单击确定。如果选择了专有文件格式，则宏直接读取像素大小和 Z 步长。

要计算乙酰胆碱受体条纹之间的距离，请选择中央窗口顶部的量化菜单。单击"工具"选项卡，选择强度，然后单击线轮廓图标。将过采样设置为 1 并勾选排序通道。

单击"打开项目"选项卡，然后选择要分析的过滤图像。然后，单击绘制线图标并追踪垂直穿过多条条纹或交界褶皱的线。单击第一个峰值的顶部，在按住鼠标左键的同时移动鼠标指针，直到达到下一个最大峰值。

请注意DX值，它对应于两个峰值之间的距离。在右侧窗口的图像中右键单击鼠标，然后选择保存 ROI。单击箭头图标后，单击ROI并通过单击垃圾箱图标将其删除。

要计算乙酰胆碱受体条纹的宽度，请在工具选项卡下的左上角面板中选择强度，单击确定 FWHM 图标，然后勾选排序通道。然后单击"打开项目"选项卡并选择要分析的过滤图像。接下来，单击右侧窗口顶部菜单中的绘制矩形图标。

选择水平或垂直的条带，然后垂直于该条带绘制一个矩形。配置文件将显示在中央窗口中。单击左侧面板中"平均投影"菜单的垂直或水平，具体取决于条带方向是垂直还是水平。

单击中央窗口中的统计信息以读取 FWHM 值，然后保存并删除 ROI，如前所述。用荧光α-Bungarotoxin标记的突触后运动终板在两个小鼠系的突变体中显得较小且碎片化。使用定制的Image J宏对神经肌肉接头Z堆栈进行定量显示，与对照组相比，两种疾病小鼠模型中的终板体积，最大强度投影和相对曲折度显着减少，表明神经肌肉接头成熟缺陷。

使用Image J自定义宏量化突触前轴突末端分支分布揭示了两种动物模型中神经丝M分布的改变模式，免疫标记增加。通过突触囊泡糖蛋白2染色，在Smn 2B /小鼠中观察到含有乙酰胆碱受体的区域与相邻神经末梢活动区的占用率降低43%。通过荧光α-Bungarotoxin标记和强度分布分析清楚地显示了神经肌肉接头突触后终板的外观。

评估神经肌肉接头参数显示突变体腓肠肌中乙酰胆碱受体条纹的连接褶皱距离和宽度增加。为了获得可靠的结果，正确挑逗肌肉至关重要，特别注意分离肌肉束的施加力量。该协议可以帮助获得神经肌肉接头的更深入的形态学表征，这在以前只能通过复杂且耗时的程序（例如透射电子显微镜）来解释。

STED成像程序为研究有关突触前和突触后标志物的新见解铺平了道路，这些标志物有助于影响神经肌肉接头的疾病的病理生理学。