在麻醉和清醒行为的非人灵长类动物大脑中注射用于光遗传学的AAV载体

许多基因治疗和神经科学研究涉及将AAV载体注射到非人类灵长类动物的大脑中。为了使这些研究成功，注射技术必须可靠。我们的注射技术是即时和准确的。

该程序适用于麻醉或清醒动物的注射。我们自制的插管易于处理且成本低廉。演示该程序的将是我实验室的工程技术员Kevin Mai。

首先，用圆盘研磨机钝化 30 号的 13 毫米皮下注射针尖。然后，根据目标大脑区域的深度将一块不锈钢管切割成一定长度。使用圆盘研磨机，将切割管的一端倾斜并平滑另一端。

用拉刀对管子内部进行毛刺。接下来，将一块PTFE管切割成适合要加载的矢量溶液体积的长度。通过插入钝的皮下注射针头来激活管的两端。

将钝的皮下注射针头插入 PTFE 管的一端约 5 毫米。然后将不锈钢管的未倒角端插入另一端约 5 毫米。通过皮下注射针轮注入过滤水来测试套管。

确认水顺利地从斜面不锈钢管尖端流出，并且水不会从任一液络部泄漏。测试套管后，将其放入高压灭菌袋中并通过高压灭菌进行灭菌。用P-20移液器将载体溶液轻轻转移到灭菌的PCR管中，避免形成气泡。

接下来，将套管连接，斜面尖端朝下连接到垂直定向立体定位支架上。然后将一毫升鲁尔锁注射器连接到套管的皮下注射针轮毂。将斜面尖端浸入矢量溶液中。

然后，用一毫升注射器施加温和的负压，将溶液装入套管中，同时目视跟踪溶液和空气之间的弯月面。加载矢量溶液后，继续温和的负压，直到溶液到达针轮毂。然后，取出一毫升注射器，沿着皮下注射针轮毂的内壁缓慢注射有色矿物油，注意避免气泡。

将皮下注射针轮毂连接到三通鲁尔锁旋塞阀的两个开放端口之一。然后，关闭端口。用空气填充一毫升注射器，并将其连接到其他两个端口之一。

最后，关闭旋塞阀的剩余端口，将注射器连接到套管。连接注射器迫使空气进入旋塞阀，并将空气分流到未占用的端口可防止它将矢量溶液推回套管。慢慢地将空气从注射器推入套管。

一旦有色油出现在PTFE管中的钝针尖端，请检查溶液和有色油之间的空气。继续施加正压，直到在斜面的套管尖端可见一滴矢量溶液。然后，关闭旋塞阀以防止矢量通过重力离开套管。

加载矢量溶液后，将套管固定在立体定位操纵器上。然后，要将旋塞阀连接到电动气泵，请从非无菌助手处取出泵管。穿过无菌套筒的壁抓住鲁尔锁接头。

放下套筒的衣领，使其通过重力沿着管子延伸。然后，固定旋塞阀并将套管紧紧地粘在鲁尔锁连接器上。接下来，通过将气泵设置为低压来测试气泵和套管，然后打开气泵并增加压力，直到油通过套管并在套管尖端可见一滴矢量溶液。

将塑料尺子粘在PTFE管上，以测量注射过程中弯月面的运动。然后，用立体定位机械手向下驱动套管，直到尖端到达表面并记录深度。将套管驱动到最深的部位，沿着轨道注射。

表面在接触时会凹陷。为了尽量减少由于组织压迫而导致的错误靶向，请向下驱动套管并超过最深的注射部位 500 微米。然后，慢慢缩回。

其他替代方案是缓慢地将套管向下或快速驾驶并在底部等待一到五分钟。一旦套管定位在最深的注射部位，使用电动气泵在 10 到 30 秒内注射 0.5 微升载体溶液。通过跟踪有色油和PTFE管中的载体溶液之间的弯月面来确认注射流量。

等待一分钟后，将套管缩回轨道上的下一个注射部位。最后一次注射后，将套管留在原位 10 分钟，以避免媒介外排。然后，收回套管并将其丢弃在生物危害锐器容器中。

在左上丘注射携带通道视紫红质II转基因的AAV载体，然后用40毫瓦的连续蓝光刺激，产生一系列连续的动作电位。一毫秒的光脉冲未能在40毫瓦时唤起动作电位，但在160毫瓦时可靠地唤起它们。由视觉引导的扫视触发的上丘骨光学刺激逐渐降低扫视增益。

这种变化的缓慢性与光遗传学诱导的可塑性一致。在网状被盖核中注射AAV后，将黄色激光传递到动眼神经蚓抑制苔藓纤维活性，这是小脑的输入。这种抑制降低了浦肯野细胞活性，这是小脑的输出。

在光遗传学抑制过程中，放电速率降低并变为爆裂孔模式，表明浦肯野细胞的苔藓纤维输入通过驱动第二次爆发来影响扫视减速阶段。通道视紫红质仅在动眼神经蚓部的浦肯野细胞中表达。短光脉冲的传递增加了分离的浦肯野细胞的简单尖峰活性。

单个 1.5 毫秒的光脉冲经常引发多个简单的尖峰。光遗传学简单尖峰激活定时发生在扫视期间增加扫视幅度，证实了浦肯野细胞对动眼膜发生器的抑制作用。套管中的气泡会破坏油载体弯月面，使注射量的测定复杂化，并妨碍对流速的精细控制。

由于这些原因，加载不含气泡的载体溶液对于此过程至关重要。注射后六到八周，可以进行光遗传学操作，并且可以处理脑组织进行组织学分析。该技术允许研究人员在少数动物中测试许多载体，这反过来又促进了新载体的开发和验证。

当前感兴趣的一个特定领域是开发针对特定神经元类型的载体。