小鼠胚胎中的器官发生阶段仍然研究不善，部分原因是由于胚胎复合物结构的难以可视化。该协议描述了允许在轴向延伸和分割期间对小鼠胚胎进行3D和4D可视化和分析的技术。该技术的主要优点是，它允许研究人员研究和显示小鼠胚胎的复杂结构作为3D动态物体。
该协议包含可用于研究影响哺乳动物椎骨和脊髓的先天性畸形（例如脊柱侧弯）的技术。这些技术也可以与体外模型系统一起使用，从而可以研究人类胚胎发育。为了准备胚胎第8.25天和第10.5天之间的小鼠胚胎以进行活体成像，在37摄氏度的预热M2培养基中解剖胚胎。
使用干净的镊子轻轻取出卵黄囊，并用新鲜的M2培养基洗涤胚胎一次，以除去解剖过程中产生的血液和碎屑。在实时成像过程中，将胚胎在低葡萄糖DMEM培养基中孵育，该培养基补充了10%HyClone定义的FBS，两毫摩尔L-谷氨酰胺和1%青霉素链霉素，在37摄氏度加热室和65%氧气和5%二氧化碳环境中。为了制备用于免疫荧光显微镜的类似阶段的小鼠胚胎，而不是使用加热的M2，在冷PBS中解剖胚胎并固定在4%多聚甲醛中。
在按照文本手稿中所述执行整个上样免疫荧光染色方案后，可以使用RapiClear实现组织清除。首先，将胚胎置于75×25毫米凹陷凹陷载玻片的中心，取出显微镜凹陷载玻片中的所有PBST并加入200微升的清除溶液，然后用盒子覆盖载玻片制备物。在避光10分钟后，当胚胎开始变得透明时，更换清除溶液并再等待20分钟。
用盖玻片覆盖胚胎，从一侧开始，轻轻地向另一侧移动。该示例现在已准备好进行映像。对于使用水杨酸甲酯或BAB进行清除，请确保胚胎在100%甲醇中完全脱水，然后开始BABB和甲醇系列，浓度连续增加20%，每个步骤孵育20分钟。
当BABB溶液达到100%时，对新鲜溶液进行两次额外的更改。准备一个20×60毫米的1.5盖玻片来安装胚胎，以避免压缩样品。添加由薄金属垫圈制成的垫片。
使用牙签，细棉尖或巴斯德移液器将清除的胚胎转移到显微镜载玻片上。然后加入一滴安装介质，用另一个类似的盖板玻璃覆盖，并用熔化的石蜡密封，以更好地稳定制剂以避免气泡。将盖玻片放在一侧，然后逐渐轻轻地将其侧向滑动，必要时添加更多介质。
样品现在可以在显微镜下成像。成像后，使用斐济/ ImageJ将胚胎重新定位为标准化的前后轴和背腹轴位置。减小斐济影像中的数据集大小，然后缩放并插入将数据集减小到小于 200 MB 所需的 X、Y 和 Z 比例值。
确保已勾选创建新窗口选项。然后转到插件并打开3D查看器。在 3D 查看器窗口中，单击胚胎以将其选中，从而显示一个红色的 3D 框。
使用此模式时，请使用鼠标控制数据集的旋转。确保胚胎的完美位置后，在3D查看器窗口中选择编辑，转换图像并导出转换后的图像。检查不同的正交平面，然后转到图像，然后堆叠并选择正交视图。
当胚胎正确定位时，选择3D查看器窗口菜单，然后编辑，转换矩阵并将其保存到具有垫扩展名的文本文件中。使用斐济/图像J打开文本文件，删除前两行并重新保存。这将创建一个与 TransformJ 插件兼容的转换矩阵文件。
切换到全分辨率数据集并执行操作插件 TransformJ 和 TransformJ 仿射。在新窗口中，浏览以搜索先前保存的矩阵文件，选择三次 B 样条插值并按各向同性重新取样，然后单击"确定"。正确重新定位胚胎后，修剪大部分创建的空白空间。要执行完整的 Z 投影图像，请单击堆栈、Z 投影，然后选择最大强度。
然后绘制X和Y中包含整个胚胎的最小ROI.通过单击编辑，选择，恢复选择和裁剪（通过选择图像）切换到原始数据集图像窗口。通过选择图像和打开堆栈来修剪开头和结尾中不与胚胎组织相交的切片，单击工具，选择切片去除器，并指定要移除的第一个和最后一个切片，确保将增量更改为1。如果需要，请使用文本手稿中的说明进行进一步的分析和3D重建。
为了对更成熟的胚胎进行3D分析，在冷的PBS中解剖胚胎第18.5天的胎儿，去除所有多余的胚胎膜，然后在新鲜的PBS中洗涤胎儿几次，以去除解剖过程中产生的血液和碎屑。将胎儿固定在PBS中4摄氏度的4%PFA中，持续五到七天。在PBS中洗涤胚胎几次后，通过在连续增加的甲醇溶液中孵育10%10直到达到100%甲醇，使胎儿脱水。
在室温下在摇床上进行每次孵育25分钟。接下来，将胎儿分别在摇摇杯上分别在甲醇中5%过氧化氢中孵育一天，然后在甲醇中孵育10%过氧化氢孵育长达三天，直到胚胎失去所有天然色素沉着。在脱矿质水中逐渐以反向甲醇系列重新水化胚胎，每次在室温下在振荡器上孵育20分钟，然后将胚胎洗涤三次，每次在脱矿质水中洗涤30分钟。
要将胎儿嵌入1%琼脂糖块中，用熔化的琼脂糖填充50毫升塑料管或注射器，然后将胎儿置于琼脂糖的垂直位置，并在琼脂糖凝固期间用镊子保持该位置。将带有块的模具在四摄氏度下放置30分钟，以使琼脂糖完全果冻，然后将琼脂糖块与胎儿一起从模具中取出，并将其放入装有去气化的水的容器中。在脱矿质水或PBS中稀释的甲醇浓度增加10%时，逐渐进行胎儿脱水，在摇床上将样品在室温下保持甲醇浓度至少45分钟，直到达到100%甲醇。
通过将胎儿在每种浓度下通过一系列BABB溶液和甲醇2.5小时，使BAB浓度增加25%，直到达到100%BABB，从而清除胎儿。每天用新鲜的BAB溶液替换BAB溶液，直到胎儿完全透明。此过程可能需要三到五天。
使用胶水将清除的琼脂糖块附着在OPT扫描仪的电机轴上，然后调整光学元件以获得整个胎儿的图像，并继续获取完整的投影数据集。4D实时成像技术能够对LuVeLu报告基因表达和胚胎第8.5天Snai1条件敲除胚胎进行动态分析。与预定中胚层上的正常LuVeLu信号一起，Snai1条件敲除胚胎在原始条纹产生的异位凸起中显示LuVeLu表达。
整个安装免疫荧光测定允许检测潜在的NMP和中胚层分化的关键调节因子。白色和黄色箭头突出显示突变型和野生型胚胎的差异。整个支架免疫染色的3D渲染可以更好地理解研究中的组织或结构。
在这种情况下，研究了尾部芽中潜在NMP的位置。3D组织重建对于理解和表征小鼠胚胎的形态缺陷也很重要。3D重建的交互式可视化也可以以用户友好的格式构建。
例如，在 PDF 文件中。这些3D胚胎尾部结构可用于向更普通的受众说明3D模型的强大功能，并帮助研究教授脊椎动物的轴向伸长和分割。最后，使用OTP显微镜技术可以对更成熟的小鼠胚胎进行3D可视化。
此处显示了动画渲染，突出显示了胚胎第18.5天胎儿的关键部分。要记住的最重要的事情是，结果必须忠实地代表在胚胎中观察到的内容。研究人员可以使用这些方法，而不仅仅是向图像呈现静态，还包括视频，三维重建，甚至数据的交互式3D模型。
