硅纳米线与光学刺激研究细胞内和细胞间电耦合

该技术仅使用标准光学显微镜，允许使用极高的空间分辨率和细胞特异性进行细胞内生物电检测。此方法有助于刺激和电质检测细胞和细胞内的特定位置，可以在体外以及 3D 体外组织制剂中进行。该技术能够对心脏或脑细胞等许多细胞领域进行生物电子研究，以及我们所有非兴奋细胞之间的电通信。

要将肌纤维细胞与肌纤维细胞心肌细胞悬浮液分离，请将分离的细胞预镀在100毫米组织培养皿上一小时，因为心肌细胞需要一个纤维颈部和治疗表面来粘附。在孵育结束时，收集含有上经应物的富血性心肌细胞，用于下游共培养。用DMEM冲洗肌纤维细胞，消除任何剩余的心肌细胞，并在另外两到四天的孵育前用新鲜培养基喂养细胞。

当细胞达到80%的汇合时，使用金刚石划片从晶圆上切割3个3毫米的芯片，该晶圆中用化学气相沉积生长的硅纳米线。并使用锋利的钳子在70%乙醇中冲洗芯片。冲洗后，在生物安全层流罩的紫外线照射下将芯片风干30分钟，然后将芯片转移到无菌微型离心管中。

使用完整的细胞培养介质冲洗去除任何剩余的乙醇，然后将芯片在一毫升新鲜培养培养器中声波化1至10分钟。当纳米线释放时，上一层应变成多云。将硅纳米线悬浮液混合到五毫升新鲜培养基中，将纳米线溶液播种到肌纤维细胞的培养皿上。

在细胞培养培养箱中四个小时后，用新鲜培养培养剂冲洗盘子五次，去除任何未内部化的纳米线，并继续孵育细胞一小时，使任何部分内化的纳米线完全整合。接下来，在 35 毫米玻璃底盘中加入 500 微升新鲜准备的胶原蛋白涂层溶液。在37摄氏度下孵育一小时后，用无菌PBS冲洗盘子，用3毫升的三毫升三毫升的三辛，在37摄氏度下收获硅纳米线肌纤维细胞杂交剂，两分钟。

当细胞分离时，停止与10毫升培养培养剂的反应，通过移液进行大力冲洗，不要离心超过200G，以避免损害细胞。然后将杂交细胞颗粒重新悬浮在一毫升新鲜介质中，并在胶原蛋白涂层玻璃底盘上播种细胞。为了验证纳米线内化，根据标准协议，用荧光细胞胶和膜染料标记细胞，并使用共物显微镜对细胞进行成像。

由于硅纳米线具有高反射性，因此可以使用反射光代替荧光进行可视化。为了建立肌纤维细胞硅纳米线混合心肌细胞联合培养，将每种细胞类型的适当数量播种到胶原蛋白涂层玻璃底盘上。并在37摄氏度下培养细胞48小时，使细胞形成细胞间间隙结。

在实验当天，用一毫升培养基基代替培养剂，辅以新鲜准备好的钙敏感染料，在37摄氏度下孵育20至30分钟。在孵育结束时，用无菌 PBS 清洗板两次，然后用一毫升预热酚红色无 DMEM 处理细胞。然后让细胞内钙染料在37摄氏度下进行30分钟的脱酯化，然后获取基线图像。

在光学成像和刺激之前，在显微镜上预热加湿的微培养箱，用准直激光线耦合到光路径中，用于钙成像和光学刺激至37摄氏度和5%气泡时代的二氧化碳混合物。当显微镜准备就绪时，将肌纤维细胞混合心肌细胞共培养物放入显微培养箱中，通过明亮的场显微镜将纳米线可视化，以找到适当的刺激位点。确定站点后，重新配置荧光模式的光路径，同时保持纳米导线预定义位置的刺激点，并验证每种硅纳米线尺寸和细胞类型的最佳刺激功率和脉冲长度。

获得2至10秒的基线细胞内钙活性记录，然后用1至10兆瓦的单个激光脉冲和1至10毫秒的持续时间刺激纳米线，再记录产生的钙波2至10秒。在实验结束时，将光学刺激的录制影片转移到相应的软件程序中，以进行进一步分析。使用标准相位对比度光学器件，光显微镜可轻松查看汇合细胞。

然而，硅纳米线几乎看不见，使得它们的位置无法用这种方法来定义。然而，超亮和暗场图像的叠加允许光反射硅纳米线的佩里核排列可视化。共体显微镜可用于可视化荧光标记染色细胞胶和等离子膜，使硅纳米线的细胞内位置更加明显。

使用标准显微镜，可以获得明亮的场图像，以确定要刺激的硅纳米线的位置。然后，可以获取自发跳动心肌细胞和休息肌纤维细胞的简短基线视频。刺激后，可以记录共培养中的钙传播。

不同细胞兴奋的时间可以通过平均光流变化达到最大值的点来决定。然后可以计算光流，以帮助识别每个细胞区域内的激活时间。可以使用 Khaimah 图形确定每个细胞的细胞内速度，线的斜率表示细胞内传播速度的反比。

例如，在这里，可以观察到单个共培养体内细胞相互作用所测量的不同细胞间和细胞内速度的摘要。该方法可用于体内研究，将细胞硅杂交直接注入组织，并利用3D外体体制剂研究体内电气公司。