从Sézary综合征患者中分离人外周血单核细胞和CD4 + T细胞以进行转录组学分析

该协议使我们能够从患有该疾病的患者中分离淋巴细胞T细胞以进行研究，分子缺陷和免疫缺陷。这种方法使我们能够分离活细胞，具有疾病异常的细胞，以从这些患者中纯化RNA，DNA和蛋白质，这使我们能够表征分子缺陷以了解发病机制中重要的途径异常。这种方法对于分离外周血很有价值，外周血可以进一步分馏以研究正常状态的血细胞，以及来自免疫异常疾病的血细胞。

演示这一程序的将是Alanna，她是我实验室的医学生研究员。在五个含有抗凝剂的10毫升管中获得外周血样品后，将10至15毫升血液转移到标有受试者编号的50毫升分离管中，并将样品稀释至少两倍，但用HBSS稀释至每管不超过35毫升。小心而缓慢地用每根管子大约13毫升的密度培养基覆盖血液，当移液器几乎空时停止移液以防止气泡。

慢慢取出移液器，以避免混合血液和密度介质层，并小心地将填充的分离管转移到离心机中，而不会干扰层。通过离心分离细胞后，除去除最后10毫升含有上层的血浆外的所有细胞，然后小心而缓慢地收集白膜。将两个分离管之间的白细胞涂层混合到单个标记的无菌50毫升管中，并用新鲜的HBSS将PBMC至少稀释两倍，每管总共50毫升。

当收集了所有的黄褐色外套后，通过离心沉淀细胞，并从每个管中除去尽可能多的上清液。点击管底以松开沉淀，并将沉淀重悬于每管原始10毫升血样体积的1至2毫升ACK裂解缓冲液中。正好五分钟后，用相同或更大体积的HBSS停止每个管中的裂解，并将每个体积调节至50毫升。

离心后，弃去上清液，将来自同一供体的细胞池化，并用新鲜的HBSS将体积提高到50毫升以进行另一次离心。然后将细胞重悬于10毫升37摄氏度RP 10F培养基中进行计数。对于CD4 + CD45RO + T细胞纯化，将细胞旋转并稀释至每毫升选择缓冲液浓度的5倍10至7个细胞。

将细胞转移到五毫升圆底聚苯乙烯管中，每毫升样品加入50微升抗体混合物，轻轻混合。在室温下5分钟后，将磁性颗粒高速涡旋30秒，然后每1毫升样品向管中加入50微升磁性颗粒，轻轻混合。将体积降至2.5毫升，加入新鲜的选择缓冲液并轻轻混合，然后将管放在磁铁上2.5分钟。

在孵育结束时，拿起磁铁并以一个连续的运动反转管，以将富集的细胞悬浮液倾析到新的无菌管中。为了增加细胞恢复，在不干扰固定珠的情况下，向管中加入2.5毫升的选择缓冲液，在磁铁上再次孵育2.5分钟，并将洗涤物加入收集管中，然后使用血细胞计数器计数活细胞的数量，并通过流式细胞术确认细胞纯度。为了激活细胞，将CD4 + CD45RO + T细胞调节到每毫升5倍10至第六个细胞，37摄氏度RP 10F培养基浓度，并将细胞接种到适当大小的培养皿上。

将细胞在37摄氏度的加湿，5%二氧化碳培养箱中静置过夜。第二天早上，通过离心收集剩余的细胞，并以每毫升5倍10至第六个细胞重悬于37摄氏度RP 10F培养基浓度。将悬浮液分成5至10倍，在三个无菌螺旋盖管中的每一个管中分别分成10至第六个细胞等分试样，并用PMA刺激管二中的细胞，用A23187和温和混合。

向第一个管中加入等体积的二甲基亚砜作为载体控制，并将盖子松开的管放入培养箱中适当的活化期。在孵育结束时，通过离心收集细胞并丢弃尽可能多的上清液，而不会干扰细胞沉淀。然后按照市售RNA分离试剂盒的指示裂解细胞，并根据制造商的说明分离RNA。

通过这种负选择方案获得的CD4 + CD45RO + T细胞的活力和纯度始终很高。从SS PBMCs的白细胞还原系统室获得的CD4 + CD45RO + T细胞的产量通常约为75%，而来自正常供体PBMCs的则约为16%。

此外，许多在正常供体T细胞中不正常表达的基因在休息和刺激后在SS T细胞中高度表达。良好的无菌技术和一致的常规对于这项技术的成功非常重要。在对Ficoll进行分层时，使用具有精细控制的自动移液器也非常重要，并且您非常注意放置Ficoll的速度。

使用这种方法分离的细胞将是可行的，可用于毒性研究，分子生化研究，用于表征信号转导途径，流式细胞术和基因表达研究。该方法可用于从疾病患者，炎症性疾病以及癌症等其他疾病中分离细胞以进行直接研究。这些疾病的例子包括牛皮癣和特应性皮炎。