接近结扎测定允许用户检测蛋白质-蛋白质原位相互作用，揭示相互作用的空间和时间模式。该技术可以帮助回答有关C.elegans开发监管的重要问题。该技术为检测蛋白质-蛋白质相互作用提供了可比的灵敏度，而不用复杂其他技术，如F FRET和BiFC。
从未解剖过蠕虫以释放性腺的个人可能会为此步骤而挣扎。练习解剖蠕虫，并使用它们进行免疫荧光，以完善处理和解剖技术，然后再进入解放军。首先，在一个装有500微升1xM9和Levamisole的手表玻璃盘中挑选30到40只年轻的成年蠕虫。
收集蠕虫后，小心地取出并丢弃大部分介质，以去除随蠕虫一起转移的细菌。加入新鲜 500 微升 1x M9 和 levamisole，并使用移液器轻轻绘制并分配介质来冲洗蠕虫。小心地卸下并丢弃大部分介质。
重复洗涤两到三次。洗涤后，将蠕虫留在约100微升介质中不超过8分钟。使用玻璃或聚乙烯移液器，将蠕虫转移到涂有 001%聚 L-莱辛的 25 毫米乘 75 毫米显微镜幻灯片中。
卸下多余的介质，使幻灯片上保留大约 15 微升介质。去除多余的缓冲区对于确保解剖的蠕虫和性腺粘附在幻灯片上至关重要。在解剖显微镜下，用两根26 1/2量针，将一根针放在另一根针上，使两端形成一把剪刀。
使用这种定向的针头，切断咽后面的蠕虫以释放细菌线。在五分钟内解剖所有蠕虫。解剖所有蠕虫后，轻轻地在幻灯片上放置 22 毫米的 40 毫米盖玻片，以便它垂直于幻灯片。
盖玻片的末端应悬挂在幻灯片上。将滑梯冷冻在干冰上保持的预冷却铝块上至少 20 分钟。轻轻地将一支冰铅笔放在盖玻片的顶部，以防止盖玻片因结冰而松动。
准备好固定时，用铅笔轻拂盖玻片，然后立即将幻灯片浸入装有新鲜、冰冷的甲醇的罐子中一分钟。然后轻轻擦拭样品周围滑梯的边缘，在室温下涂抹 150 微升甲醛固定剂，固定五分钟。以垂直 90 度角将幻灯片触摸到纸巾上，让固定器从幻灯片上跑下来，吸收到纸巾中。
在室温下，在包含 50 毫升 PBT/BSA 的科普林罐中，将幻灯片两次阻挡 15 分钟。然后用含有10%正常山羊血清的PBT/BSA溶液阻断幻灯片。轻轻擦拭幻灯片周围的边缘，并在每张幻灯片上应用 100 微升溶液。
轻轻搅动幻灯片，以帮助传播解决方案。在潮湿室的室温下孵育一小时。将幻灯片放在纸巾上，让溶液从幻灯片上跑下来，然后轻轻擦拭边缘。
要阻挡幻灯片，请将一滴阻滞试剂涂抹到 14 毫米到 14 毫米的空间中。在潮湿的室内，在37摄氏度下孵育滑梯一小时。将幻灯片放在纸巾上，让阻阻碍试剂从幻灯片上跑下来，然后轻轻擦拭边缘。
使用抗体稀释剂稀释原抗体。在幻灯片上每 14 到 14 毫米空间应用 40 微升稀释原抗体溶液。将滑梯放在潮湿的室内，在摄氏四度下孵育过夜。
早晨，在Coplin罐子的室温下，将滑梯洗两次五分钟，每张用50毫升的1x洗液缓冲液 A。将轨道摇床上的 Coplin jar 设置为 60 rpm。将幻灯片放在纸巾上，让洗涤缓冲液从幻灯片上跑下来，然后轻轻擦拭边缘。
准备包含正负探头的 40 微升解决方案。将解决方案添加到每个 14 到 14 毫米的空间。在37摄氏度的潮湿室内孵育滑梯一小时。
在Coplin罐子的室温下，用50毫升1x洗涤缓冲液 A清洗幻灯片两次，每次洗涤5分钟。将轨道摇床上的 Coplin jar 设置为 60 rpm。用超纯水稀释结扎缓冲液一至五。
使用此缓冲液将连接液稀释 1 到 40，以准备结扎溶液的工作库存。将幻灯片放在纸巾上，让洗涤缓冲液从两侧跑开，然后轻轻擦拭边缘。在每个 14 到 14 毫米的空间中添加 40 微升的结扎解决方案。
在37摄氏度下在潮湿的室内孵育滑梯30分钟。在清洗和干燥幻灯片后，如前文所述，将 40 微升新鲜准备好的放大溶液添加到每个 14x-14 毫米的空间中，防止光线。在37摄氏度下，在潮湿黑暗的室内孵育滑梯1小时40分钟。
将滑梯两次清洗10分钟，每次用50毫升1次洗涤缓冲液B，用50毫升01x洗涤缓冲液B清洗一分钟。用指甲油在盖玻片边缘周围进行油漆，以密封盖玻片和滑动。避免移动盖玻片。
让指甲油在室温下硬化至少20分钟，防止光线。与 FLAG 和 GFP 抗体共同免疫的细菌系揭示了其在生殖系中的表达模式。虽然GFP在整个生殖系中表达，但OMA-1:GFP表达仅限于晚期的帕奇泰尼和卵母细胞。
FLAG免疫标记表明，3xFLAG:DLC-1在两种菌株的发芽线上均表现出来。解放军在细菌系中量化感兴趣的区域包括所有细菌系中通过卵母细胞的晚期帕奇滕。这是 OMA-1 表达式区域。
3xFLAG:DLC-1，OMA-1:GFP细菌线似乎与3xFLAG:DLC-1，GFP细菌线相比，该区域内有更大的PLA foci数量。确保有足够的水来提高室内的湿度。此外，确保滑轨在腔室内保持水平，以防止试剂径流。
接近结扎测定后，挤出的性腺可以在共物显微镜上成像，并使用斐济 ImageJ 工作流程进行量化。这种量化可以帮助确定相互作用是否具有统计显著性。PLA 允许我们评估线虫病菌系发育的关键调节器之间的原位相互作用。
