该方法提供了有关细胞周期依赖治疗效果的信息，并允许和深入研究细胞增殖与应对DNA损伤的应对机制之间的相互作用。该方法将DNA损伤反应的重要终点，包括双链碎片识别和修复、细胞循环效应，以及最终细胞凋亡死亡，合并为一个全面的测定方法。我们主要利用这项技术研究临床肿瘤学中放射化学治疗的具体治疗反应和副作用。
该测定对放射生物学和放射治疗领域的相关研究非常有用，但也可以应用于肿瘤学的其他各个领域。按照标准细胞收集程序从培养物中收集细胞后，将颗粒重新在PBS的一毫升中重新产生。将细胞转移到两毫升的固定溶液在引擎盖。
在室温下孵育10分钟后，通过离心收集细胞，并蒸馏上经。将单元格固定为单个单元格悬浮液非常重要，并且所有样本的固定时间不变。给粘附细胞足够的时间分离，以获得很好的圆润细胞进行分析。
然后通过敲击和重新暂停细胞在三毫升的70%乙醇中松开颗粒。要在染色前清洗细胞，通过离心沉淀细胞，然后通过敲击松开颗粒。然后用三毫升的洗涤溶液和一毫升的洗涤溶液重新暂停细胞。
每次洗涤之间丢弃上一杯。最后一次洗涤后，小心吸进上经剂，而不干扰颗粒，并在感兴趣的抗体鸡尾酒的100微升中重新暂停 lucent 颗粒。在室温下一小时后，通过离心收集细胞，并小心吸上经剂，而不会干扰颗粒。
然后，将松动的颗粒重新在 100 至 250 微升的 DNA 染色溶液中，并通过具有 35 微米网孔大小的样品管的细胞过滤器盖分配细胞。要通过流式细胞分析来分析细胞，请在圆度计窗口中打开参数选项卡，然后选择表中所示的参数。接下来，打开工作表窗口，并创建指示的绘图。
将控制样品加载到圆度计上，然后按下运行按钮。在浏览器窗口中选择第一个管，然后单击管名称。在检查器窗口的参数选项卡中调整前向和侧散射和 DAPI 的检测器电压。
按备用按钮继续软件中的工作表设置。使用多边形门工具定义向前散点区域中的单元格总体与侧散点区域图，并使用矩形门工具定义 DAPI 中的单个单元格总体与 DAPI 区域图。按控件 G 以显示总体层次结构，然后单击默认门名以重命名它们。
随后，右键单击所有直方图，从上下文菜单中选择显示人口和单个单元格。获取控制和处理样品，以优化抗体耦合荧光的检测器电压，覆盖信号的全部动态范围。要测量样品，请按圆度仪上的运行按钮，并使用软件中的采集仪表板测量样品。
然后选择文件、导出和实验以在对话框中选择目录导出以将数据另存为点 FCS 文件。要评估数据，请将点 FCS 文件拖入流式细胞测量分析软件的样本浏览器中。并使用多边形工具定义前进和侧散射区域图中的单元格总体，并排除分析中的碎片。
在 DAPI 与 DAPI 区域图中，使用矩形工具定义单个单元格的填充，并排除分析中的任何细胞双精度或块。在DAPI区域直方图中，使用二角器工具将具有正常DNA含量的单个细胞与具有降解DNA的凋亡细胞进行区分。选择工具生物学和细胞周期打开细胞周期建模工具，并选择D dean-Jett Fox来估计G一个S和G两个M阶段的细胞频率。
在 DAPI 中创建 G 一 S 和 G 二和 M 相门，与细胞周期总体的 DAPI 区域图，以实现特定于细胞周期的伽玛 H 两个 A X 测量。使用双子体工具在细胞周期群的Alexa 555区域直方图中分辨磷石H三个正细胞和负细胞，并区分单细胞群的Alexa 647区域直方图中的CAS基三个阳性和负细胞。按控件 T 打开表编辑器并按指示配置表。
然后选择"要文件"以在菜单功能区的输出部分中设置格式和目标，然后将数据导出到传播工作表中。碳离子在胶质母细胞细胞中诱导更高的伽马H两个 AX 峰值水平，与同一物理剂量的光子辐射相比，这些细胞在下降较慢，并在 24 至 48 小时内保持显著升高。对于碳离子和光子辐射，伽马H两个 AX水平在G一相细胞中最高，可能是因为DNA双链断裂修复仅限于细胞周期的这个阶段非霍莫洛古斯结束连接的通路。
与较高的双链断裂诱导率和较慢的修复动力学一起，碳离子在G两相中诱导更强、更持久的细胞周期抑制，并且比光子具有更高的凋亡率。根据治疗效果的强度，不同细胞周期相的分辨率可能具有挑战性。在某些细胞系中，DAPI浓度对细胞周期轮廓的质量有很大影响，需要进行调整。
流式细胞学后，可以从剩余的样品中准备幻灯片，以评估伽马 H 两个 AX foci 的数量、大小和形状，并区分焦核和双核伽马 H 两个 AX 染色。利用我们的方法，我们可以证明，中层干细胞对电离辐射和托托莫美酶抑制具有相对的抵抗力，但对胶质霉素敏感。由于 PFA 烟雾是有毒的，因此在准备固定溶液时和固定步骤中始终使用烟气罩。
处理 DAPI 时还要记得戴手套。
