该程序的总体目标是通过提供一种简单且非侵入性的细菌接种到下呼吸道的细菌接种途径，然后进行细菌回收和RNA纯化以进行转录分析，从而加强继发性细菌性肺炎研究。这将首先对鼠标进行深度麻醉，并将预装钝尖弯曲的针头插入鼠标的气管中，该针从最大切口垂直悬浮。其次，在成功感染后，通过切除和肺均质化恢复细菌菌群形成单位。
由此产生的肺同质质被连续稀释，并镀在营养黄油上，以列举菌形成单位。最后，RNA从肺同质化中纯化。这个程序的优点是，它使控制性分娩直接进入下呼吸道。
这使我们能够研究病原体对疾病结果的组合和个人贡献。该领域的最新进展表明，细菌基因调控在决定感染结果方面可能起很大作用。这项技术受益于同时回收细菌CFO和RNA的能力。
一旦RNA被分离，然后我们可以评估特定毒性基因对感染的贡献。此外，这种技术受益于非手术。这允许对在此过程中使用的任何动物进行最小的压力，并使他们能够立即恢复。
无需使用任何类型的导丝、导线或光纤电缆，即可使用通用实验室设备。对这项技术的新鲜人可能首先与通过气管的实际安装斗争。一旦这种技术被概念化，它成为一个简单和有效的程序，以询问继发性细菌性肺炎在穆林宿主。
在开始手术之前，使用以下耗材准备工作空间:插管平台、无菌一个 mL 注射器、无菌钝尖钳、无菌 21 量钝尖针和两个锥形管来存放注射器和钳子。首先准备病原体接种，以50微升的体积获得所需的最终浓度。接下来，使用无菌手套准备一到1.5英寸21规格钝尖针弯曲到约35度角。
将针头固定在注射器上后，抽出 100 微升气垫，然后抽出 50 微升的传染性剂。100 微升气垫可确保在注射器按下后完全输送病原体负载。将装载的针头和注射器放在一个由占统治地位的手容易接近的位置。
从麻醉室取出并麻醉小鼠，然后将鼠标从最大切口上悬浮在插管平台上。使用钝尖钳，轻轻抓住并伸展舌头。将舌头从钳子转移到非主要手的拇指和食指中。
保持舌头在非多大手，拿起预装注射器。将针头的弯曲端指向远离身体。将针头插入口腔。
在舌底轻轻地角手腕，使针头稍微推开身体。此操作可确保针头插入气管而不是食道。慢慢地将针头引导到气管中。
通常，当针头穿过声带时，会感觉到轻微的滴答声。通过针头通过气管，直到在针头碰到卡琳娜时感觉到轻微的阻力。稍微抬起针向上方向，将针头吊在卡琳娜上方。
这允许交付到主支气管。完全按下注射器柱塞以提供传染性负载。从气管中取出针头并丢弃。
通过压住橡皮筋将鼠标从插管平台上取下，但保持鼠标的直立位置。将手指直接放在鼻腔上，以阻塞鼻腔。保持此位置约一分钟或直到观察到几次深呼吸。
最后一步确保总的进尿量被传递到下呼吸道。将动物返回到笼子，确保从麻醉中迅速恢复。在感染后选定的时间点，可切除受感染的肺部，以量化和评估细菌对与继发性细菌性肺炎相关的增加的疾病的贡献。
准备一个工作空间与以下项目:秤和无菌称重船，解剖平台，一个解剖套件包含剪刀和钳子，和无菌纱布。为了本演示的目的，肺的切除将在长凳上进行。然而，为了在整个过程中保持不育，建议在层流罩内进行肺切除。
用CO2或类似的 IACUC 批准的安乐死方法对受感染的小鼠实施安乐死。将受感染的小鼠放在解剖平台上并固定。用乙醇喷洒鼠标，以保持工作表面上的不育性。
从脐带开始，使用一对钳子抬起皮肤，向喉部切开。抓住初始切口两侧的皮肤，将皮肤从身体中拉出，切开组织连接。它可以帮助使横向切割整个皮肤，以揭示更多的胸腔区域。
从西腓过程的基础开始，做一个小切口，意图刺穿隔膜。这导致胸腔压力增加，导致肺缩回。肺缩回后，继续切口以释放隔膜。
通过两侧切口取出肋骨。这将暴露胸腔和肺部。切除肺用钳子抓住心脏底部，向上抬起。
将剪刀放在肺后面，开始通过组织连接进行小切口，同时继续向上抬起心脏。一旦肺被切除，将它们放在无菌纱布上，然后将其从肺中抬离并切断剩余的组织连接，将其取出心脏。将肺转移到预焦重量船并记录质量。
称重肺部后，将肺转移到无菌磷酸盐缓冲盐水中，并暂时储存在冰上。现在，肺已经切除和称重，细菌可以恢复，以确定他们的作用，对发病机制。为准备细菌回收，需要以下供应:组织研磨机，无菌无RNasePBS，缓冲RST补充β-美甲乙醇，和1.5 mL无RNase微离心管。
首先在组织研磨机中加入一 mL 无菌无 RNase PBS。填充后，将组织研磨机存放在冰上。接下来，准备一系列无菌无RNase系列稀释管，以量化从受感染的肺部恢复的细菌负荷。
将肺转移到准备好的组织研磨机中，在旋转时按下基座，使组织完全均质。将组织研磨机和等同 100 微升的均质样品打开，进入制备的第一个串行稀释管。连续稀释营养糖上的样品和板，以列举菌形成单位。
C2 可以记录为每毫升或每毫升 CFU，每毫克肺组织。拆下 100 微升等分，更换研磨基座，并在 4000 rpm 转速下将样品离机 10 分钟，温度为 4 摄氏度。离心完成后，从颗粒样品中去除上经剂。
上能分时可以保存并储存在零下80摄氏度，以供以后进一步分析。将 700 微升 RLT β-美甲乙醇中的均质组织颗粒重新悬浮，将样品转移到无菌无 RNase 1.5 mL 离心管。此时，样品可以储存在零下 80 度。
通过将样品装入含有1毫米硅珠的2 mL微离心管，然后通过珠子打手以6米/秒的速度处理20秒，可以从RLT肺均质浆中纯化RNA。然后，使用Voyich等人所报道的RNeasy方法的适应立即纯化RNA。分子生物学的方法"2008年，并介绍了在本文随附的手稿。
纯化后，可以使用分光光度计对RNA产量进行量化。一旦量化，将产生的RNA稀释成每微升50纳米的分数是有益的。这使得样品中的RNA可用于多次分析，而无需受到多个冷冻解冻周期的影响。
使用这种技术，可将受控病原体负载直接安装到下呼吸道中。通过安装 1% 的 Coomassie 亮蓝色解决方案，可以证明此交付系统的效率。上排显示一对未受感染的肺作为控制，而下排显示一对肺，通过腹内装置接收了 50 微升的 1% Coomassie 亮蓝色染料。
使用这种染料演示了中切内装置如何提供病原体负载在左右肺和整个肺的均匀分布。一旦感染，病原体负荷可以通过肺组织的切除和均质化，在切内安装后的各个时间点进行恢复和分析。为了证明这种恢复技术的效率，两组每组包含三只小鼠，他们感染了低剂量和高剂量的金黄色葡萄球菌。
细菌输入被镀在营养剂上，以列举C比。在切内安装一小时后，小鼠被安乐死，肺部被切除，并在组织研磨机中均质化。均质组织被连续稀释，并镀在营养黄油上，以列举C比。
从均质肺组织分离出的RNA可以通过逆转录酶PCR进行检查，并用于量化目标基因的相对转录丰度。为确保最少的背景DNA污染，建议在不添加逆转录酶的情况下进行PCR反应，同时运行任何qRT-PCR反应。除了细菌载荷外，该技术还可以扩展到病毒载荷的安装和隔离。
肺组织均质化后，可以分离病毒RNA，用于测量病毒基因的转录丰度或构建病毒定量的标准曲线。该系统的使用提供了一个高效和可重复的系统，以研究继发性细菌性肺炎。一旦掌握，该程序可用于大规模实验。
成批地对小鼠进行安乐死，每只小鼠在 30 秒内进行腹内安装。完成此操作后，继续切除肺部，每只小鼠大约两到三分钟内完成切除。虽然这里讨论的方法在继发性细菌感染的背景下，它们可以扩展到任何需要控制分娩和恢复幼崽的程序。
除了这里描述的方法外，在切除肺之前，还可以添加支气管。虽然这往往导致病原体负荷的恢复率下降，但它受益于获得数据，如细胞因子分析、乳酸脱氢酶活性和识别不同的细胞群。为了更彻底地了解疾病的发病机制，询问宿主和病原体对疾病的贡献变得非常重要。
此视频的目的是提供一种简单而有效的方法来探索继发性细菌性肺炎在穆林宿主。
