在浮动水培系统中监测阿拉伯菌的殖民化与维护

大多数实验通过关注殖民化来研究植物-微生物的相互作用，但我们的协议旨在同时研究殖民化和根部细菌的维持。我们可以改变实验，以适应不同的细菌和植物，我们甚至可以测试多个细菌在每个24井板。首先，使用标准打孔器创建塑料网格磁盘。

将磁盘收集在玻璃容器中，并松散地盖住。使用设置为 20 分钟干燥循环的自动洗车进行灭菌。使用火焰消毒的钳子将大约 40 个灭菌网盘在先前准备的植物生长介质的红板表面的单层中分配。

将两个先前经过消毒的种子放在每个网格的中心。用手术胶带封住盘子，在黑暗中四摄氏度下孵育两到六天，使种子发芽。然后，在21摄氏度的9小时光和15小时的黑暗下，在植物生长室中放置8至10天的板加糖侧，以发芽和生长幼苗。

在无菌24井板的每个井中加入一毫升的细菌生长介质。要转移嵌入网状的发芽幼苗，使用火焰灭菌钳子轻轻剥落含有两个同一尺寸的、大小相同且未损坏的幼苗的网状。将一个浮子与幼苗转移到每个井的细菌生长液，根侧向下。

接下来，在液体细菌生长介质的阿加板上隔夜生长的再暂停细菌。在每个油井中加入10微升的细菌悬浮液，但仅介质控制井除外，每口井最终浓度为100万菌群形成单位。要密封板以进行无菌生长，请小心地将气体渗透膜压在板上，而不接触粘性面。

在井的每个环周围施加压力，以确保每口油井都经过单独密封。然后，将塑料盖紧贴在气体渗透膜上，将板紧贴在盖子上。将板放在植物生长室中，放在设置为 220 rpm 的轨道板摇床上，并在与幼苗最初发芽的相同条件下孵育 18 小时。

要用植物冲洗所有浮子，请向新24井板的每个井中加入一毫升无菌水。用植物从板中去除气体渗透膜，使用无菌钳子将浮子转移到有水的水井中，并在室温下孵育10分钟，不搅拌。然后，用一毫升的植物生长介质填充新24井板的每个井。

将一个网眼转移到每口井，并盖上气体渗透密封。在植物生长室220转/分的轨道板摇床上孵育72小时。孵育后，像以前一样冲洗植物。

冲洗后，将幼苗从网状物中去除，轻轻将火焰消毒钳放在网片叶面的叶子下方。轻轻捏茎，晃动幼苗，远离网状物，在不破坏根部的情况下将根部开走。为了去除植物根部中的细菌，将幼苗从每个网眼转移到含有一毫升双蒸馏水的24孔声波板的单个井中。

使用手稿中描述的多管齐下声波器一次对板内的所有样品进行声波化。为了量化细菌，在细菌生长介质中对声波样品进行连续10倍的稀释。使用无菌玻璃珠传播，并在细菌的最佳温度下孵育，直到单个菌落可计数。

要收集完整的植物根，请使用钳子从网格中去除幼苗。然后，通过将根尖放在幻灯片上并将其从滑头上拖离，将拍摄与幻灯片齐平，将每个植物转移到显微镜幻灯片上，确保拉直根部以获得最佳成像效果。在每个样品中添加一滴水或无菌植物生长介质，使盖玻片和滑梯之间的界面水合。

将玻璃盖玻片放在根冠的上方和射片叶下方，以避免表盖唇倾斜，然后轻轻按下。然后，使用适当的激发/发射过滤器对细菌进行图像图像，以区分细菌彼此和植物根。伪多多多丝，天然荧光细菌，殖民的阿拉伯多普西沙利亚纳根，并在转移到植物生长介质后保留在根部。

根冠，中长，和尖端显示荧光由于殖民化伪莫纳斯模拟。无细菌阴性对照显示没有殖民化。当在18小时的殖民化或72小时的维护后对阿拉伯沙皮萨利亚纳根的伪多莫纳斯的模拟被量化时，两个时间点每个幼苗的成群单位总数在不同日子进行的生物复制中显示出良好的可重复性。

与殖民化后18小时时间点观察到的数字相比，每种幼苗在72小时后形成菌落的单位数量增加，表明在维持阶段，植物根部上菌群的活性生长。在实验室条件下生长在天然土壤中的阿拉伯多普西沙利亚纳分离出的三种细菌被用来监测植物根部上多种物种的关联。由于菌落形态和颜色的差异，它们在含有X-gal的介质上明显有区别，这使得它们能够计算每个物种的幼苗的成菌单位，而不用选择抗生素，即使在多物种共培养中。

这三种细菌都是殖民的，并维持在根部，无论是单独还是细菌共培养。每种物种都显示出不同生物和技术复制的相似趋势，表明该协议可用于测量每个物种的根的相对或总群落形成单位。单独生长时，在维持阶段没有个别物种的丰度显著增加，但联合群落每个根的群落形成单位在联合栽培中增加，表明这些细菌并不禁止其他菌株的殖民化。

最困难的步骤是那些需要从网盘中删除完好无损的植物的步骤。耐心和温柔会使这一切成为可能。如果细菌细胞是荧光的，样品可以通过流式细胞学进行排序，以确定细胞的相对数量。